一种酪氨酸酶辅助的荧光增强型酪氨酸蛋白激酶活性分析方法
【专利摘要】本发明公开了一种酪氨酸酶辅助的荧光增强型酪氨酸蛋白激酶活性分析方法，该方法首先将靶标酪氨酸蛋白激酶与其对应的荧光标记的多肽底物混合，使多肽中酪氨酸发生磷酸化，酪氨酸酶能够将未磷酸化酪氨酸残基上的酚羟基氧化成邻苯醌而猝灭底物的荧光，而磷酸化底物上酪氨酸酚羟基被磷酸基团保护不会被氧化，对多肽上标记的荧光分子不会产生猝灭作用。因此，在酪氨酸酶的辅助作用下，通过检测体系中荧光信号的增强情况，即可实现酪氨酸蛋白激酶活性的定量分析。本发明只需将蛋白激酶反应体系与酪氨酸酶混合后即可进行荧光信号的测量，利用简便的操作步骤实现了酪氨酸蛋白激酶活性的快速灵敏分析。同时本发明可用于酪氨酸蛋白激酶抑制剂的筛选。
【专利说明】
一种酪氨酸酶辅助的荧光増强型酪氨酸蛋白激酶活性分析方法
技术领域
[0001]本发明属于生物分子检测技术领域，具体涉及一种利用酪氨酸酶对荧光多肽底物上酪氨酸残基的氧化能力，以及酪氨酸残基磷酸化后对酪氨酸酶氧化能力的阻止作用，实现酪氨酸蛋白激酶活性分析的方法。
【背景技术】
[0002]蛋白质磷酸化在细胞信号转导过程中发挥着重要的作用。细胞的代谢、生长、发育、凋亡等大多数生命过程，都与蛋白质的磷酸化有密切的联系。蛋白激酶是调控蛋白质磷酸化的最关键的生物分子。它能够将腺嘌呤三磷酸核苷(ATP)上的γ -磷酸基团转移至激酶底物蛋白或多肽的丝氨酸、苏氨酸或酪氨酸残基上。人体约30 %的蛋白质磷酸化是由激酶调控的。一方面，激酶通过调控磷酸化作用调节下游蛋白的活性；另一方面，通过将蛋白质逐级磷酸化，信号逐级放大，最终引起细胞反应。在蛋白激酶家族中，酪氨酸蛋白激酶的作用尤其重要，许多种酪氨酸蛋白激酶活性的异常失衡往往与恶性肿瘤的增长，转移和代谢密切相关。
[0003]鉴于酪氨酸蛋白激酶与肿瘤发生的密切关系，能够快速、准确、灵敏地检测酪氨酸蛋白激酶的活性，对及早发现并且有效控制恶性肿瘤增长具有重要意义。此外，研发以酪氨酸蛋白激酶为靶点，能够高效地抑制酪氨酸蛋白激酶的活性的药物，为有效调控细胞恶性增长，治疗疾病提供了一种高效的途径。因此，建立快速灵敏，操作简单，价格低廉的酪氨酸蛋白激酶活性分析方法，是相关研究领域的基础和关键。
[0004]到目前为止，酪氨酸蛋白激酶活性分析方法有以下几种:(I)放射性标记技术，T-32P-ATP标记技术是检测各类蛋白激酶，包括酪氨酸激酶活性的标准方法。但此方法有许多缺点:操作繁琐、耗时、放射性污染等。(2)基于免疫识别的检测技术。利用对酪氨酸磷酸化位点具有特异性识别作用的亲合抗体为识别元件，结合荧光、电化学等多种检测技术，是当前酪氨酸蛋白激酶活性分析领域中非常活跃的研究方向。虽然此类方法已取得了重大进展，但是仍存在很多不足:抗体标记物制备过程复杂，其活性容易受到环境、反应基质、操作等因素影响，检测过程要求苛刻，而且成本高。(3)以金纳米粒子聚集显色为传感机制的检测方法。利用金纳米粒子生物兼容性好、光学性能优异等特点，许多研究者构建起了基于金纳米粒子聚集显色的可视化蛋白激酶活性分析。虽然检测方法简便，但金纳米粒子的聚集易受到介质环境如酸度、离子强度、共存物质等多种因素的干扰，容易产生假阳性的信号，在抑制及药物筛选方面受到极大的限制。
[0005]因此，考虑到酪氨酸蛋白激酶检测对低成本，简单操作及实用性等方面的需求，理想的酪氨酸蛋白激酶活性检测方法应摆脱对抗体识别和放射性标记技术的依赖，且满足高效、灵敏、操作简单、价格低廉、适用范围广等特点。
[0006]发表内容
[0007]本发明所要解决的技术问题在于提供一种操作简单、成本低、无需昂贵仪器即可高效、高灵敏分析酪氨酸蛋白激酶活性的方法。
[0008]解决上述技术问题所采用的技术方案由下述步骤组成:
[0009]1、将已知活性的酪氨酸蛋白激酶与其对应的荧光标记的多肽底物混合进行磷酸化反应；
[0010]2、将步骤I中磷酸化反应后的溶液与酪氨酸酶混合后检测体系的荧光强度，绘制荧光强度随酪氨酸蛋白激酶活性变化的标准曲线；
[0011]3、按照上述步骤I和2检测待测酪氨酸蛋白激酶样品对应的荧光强度，根据标准曲线即可实现待测样品中酪氨酸蛋白激酶活性的定量分析。
[0012]上述步骤I中，所述的荧光标记多肽底物中的荧光标记物为荧光素类、罗丹明类、香豆素类及其衍生物中的任意一种或花青染料，或者荧光标记物为半导体或碳荧光量子点或金、银荧光纳米簇，具体如:羧基四甲基罗丹明、2，7_二甲基-4，5-二氯-6-羧基荧光素、四氯-6-羧基荧光素、六氯-6-甲基荧光素、德克萨斯红、3H-吲哚菁染料等或其衍生物;所述的酪氨酸蛋白激酶是指能够将酪氨酸蛋白磷酸化的激酶，具体如:Src激酶系列、Abl、Csk、Fes、EGFR、TrkA、Fl t3等。
[0013]本发明的有益效果如下:
[0014]1、本发明首次提出利用酪氨酸酶介导的荧光增强型(turn-on)分析方法检测酪氨酸蛋白激酶活性。酪氨酸酶能够将酪氨酸蛋白激酶对应的多肽底物中酪氨酸残基上的酚羟基氧化成邻苯醌结构，邻苯醌多肽底物上标记的荧光染料有高效的猝灭能力，而酪氨酸蛋白激酶催化磷酸化后的酪氨酸残基上的酚羟基修饰了磷酸基团，酪氨酸酶不能将其氧化，进而无法猝灭荧光染料的荧光。因此，本发明利用酪氨酸酶对荧光多肽底物上酪氨酸残基的氧化能力，以及酪氨酸残基磷酸化后对酪氨酸酶氧化能力的阻止作用，通过检测体系中荧光信号的增强情况，即可实现酪氨酸蛋白激酶活性的定量分析。
[0015]2、本发明建立的酪氨酸蛋白激酶活性分析方法操作极为简单，只需将蛋白激酶与荧光标记的多肽反应后的体系直接与酪氨酸酶混合并检测体系的荧光信号即可，是一种即混即测型荧光分析方法，具有非放射性、非抗体依赖性、无需使用纳米粒子等额外的传感元件等显著的特点，以及快速灵敏、稳定性好、操作步骤简单、成本低、检测方便等诸多优势，克服了传统放射性物质标记、抗体识别和金纳米粒子比色方法中存在的放射性危害、需专业人员操作、耗时长、成本高、试剂存放时间短、易受外界干扰等不足，具有在普通的化学及生物实验室均可进行。
[0016]3、本发明酪氨酸蛋白激酶活性分析方法也适用于蛋白激酶抑制剂的筛选。
【附图说明】
[0017]图1是实施例1中反应体系荧光信号随酪氨酸蛋白激酶Src活性变化的荧光光谱图。
[0018]图2是实施例1中反应体系在583nm处的荧光强度随酪氨酸蛋白激酶Src活性变化的标准曲线图。
[0019]图3是实施例2中反应体系荧光信号随酪氨酸蛋白激酶Src活性变化的荧光光谱图。
[0020]图4是实施例2中反应体系在583nm处的荧光强度随酪氨酸蛋白激酶Src活性变化的标准曲线图。
[0021 ]图5是荧光强度随抑制剂PP2浓度变化的荧光光谱图。
[0022]图6是583nm峰值荧光强度随抑制剂PP2浓度的对数变化的曲线图。
【具体实施方式】
[0023]下面结合附图和实施例对本发明进一步详细说明，但本发明的保护范围不仅限于这些实施例。
[0024]实施例1
[0025]以酪氨酸蛋白激酶Src为例，其活性检测方法如下:
[0026]1、将2yL 25ymoVL羧基四甲基罗丹明标记的多肽(由吉尔生化上海有限公司提供，多肽的氨基酸序列为RRRRIYGEFKK)水溶液、3yL lmmol/L ATP水溶液和不同体积的1 X10一VgAiL酪氨酸蛋白激酶Src(所用酶活性为1020U/mg)溶液分散到25mmol/L pH值为7.5的HEPES缓冲溶液(含lOmmol/L MgCl2)中，终体积为20yL，使混合体系中酪氨酸蛋白激酶Src的活性分别为0、0.5Χ10—4、1X10—4、2X10—4、3X10—4、4X10—4、5X10—4、6X10—4、7X10—4、8X 10—4、9 X 10—4、10 X 10—4、15 X 10—4yg/yL，在恒温培养振荡器上37°C温育60分钟，进行磷酸化反应。
[0027]2、向步骤I磷酸化反应后的溶液中加入3yL 2kU/mL的酪氨酸酶水溶液、40μL250mmol/L pH值为6.6的Tris-HCl缓冲溶液，用水定容至200yL，然后在恒温培养振荡器上37°C温育40分钟，进行酪氨酸酶氧化反应。反应完后，用荧光仪(激发波长554nm，最大发射波长583nm，入射狭缝2.0nm，出射狭缝1.0nm)测量反应体系的荧光强度。反应体系的荧光信号随酪氨酸蛋白激酶Src活性变化的光谱图见图1，并绘制583nm处荧光强度随酪氨酸蛋白激酶Src活性变化的标准曲线(见图2)。由图2可知，583nm处荧光强度与酪氨酸蛋白激酶Src的活性在O?2 X 10—4PgAxL和2 X 10—4?9 X 10—4yg/yL两个活性区间内分别呈良好的线性关系，其中酪氨酸蛋白激酶Src的活性在O?2 X 10—4PgAxL活性区间的线性方程为:Y = 7080X+34936，在2\10—4?9\10—\8/^活性区间的线性方程为:￥ = 30318乂-13247，式中￥代表体系的荧光强度，X代表酪氨酸蛋白激酶Src活性，相关系数r值分别是0.99329,0.99824。由此可知，体系的荧光强度与酪氨酸蛋白激酶Src活性的线性关系良好。
[0028]3、按照上述步骤I和2检测待测样品中酪氨酸蛋白激酶Src对应的荧光强度，根据标准曲线即可实现待测样品中酪氨酸蛋白激酶Src活性的定量分析。
[0029]实施例2
[0030]为了进一步提高酪氨酸蛋白激酶Src的活性检测范围，本发明通过提高多肽底物浓度进行磷酸化反应，拓宽了酪氨酸蛋白激酶Src活性的检测动态范围，具体实验过程如下:
[0031]1、将2yL ΙΟΟμπιοΙ/L羧基四甲基罗丹明标记的多肽(由吉尔生化上海有限公司提供，多肽的氨基酸序列为RRRRIYGEFKK)水溶液、3yL lmmol/L ATP水溶液和不同体积的1 X10一VgAiL的酪氨酸蛋白激酶Src(所用酶活性为1020U/mg)溶液分散到25mmol/L pH值为7.5的HEPES缓冲溶液(含1mmo 1/L MgCl2)中，终体积为20yL，使混合体系中酪氨酸蛋白激酶Src的活性分别为0、2 X 10—4、5 X 10-4、7.5 X 10—4、10 X 10-4、12.5 X 10—4、15 X 10—4、20 X 10—4μg/yL，在恒温培养振荡器上37°C温育60分钟，进行磷酸化反应。
[0032]2、向步骤I磷酸反应后的溶液中加入3yL 2kU/mL的酪氨酸酶水溶液、40μL250mmol/L pH值为6.6的Tris-HCl缓冲溶液，用水定容至200yL，然后在恒温培养振荡器上37°C温育40分钟，进行酪氨酸酶氧化反应。反应完后，用荧光仪(激发波长554nm，最大发射波长583nm，入射狭缝2.0nm，出射狭缝1.0nm)测量反应体系的荧光强度。反应体系的荧光信号随酪氨酸蛋白激酶Src活性变化的光谱图见图3，并绘制583nm处荧光强度随酪氨酸蛋白激酶Src活性变化的标准曲线(见图4)。由图4可见，583nm处荧光强度与酪氨酸蛋白激酶Src的活性在2\10—4?15\10—\8/^活性区间的线性方程为4 = 28844乂+231274，式中￥代表体系的荧光强度，X代表酪氨酸蛋白激酶Src活性，相关系数r值是0.99418。
[0033]3、按照上述步骤I和2检测待测样品中酪氨酸蛋白激酶Src对应的荧光强度，根据标准曲线即可实现待测样品中酪氨酸蛋白激酶Src活性的定量分析。
[0034]不同种类的酪氨酸蛋白激酶作用的多肽底物具有特异性，因此针对特定的酪氨酸蛋白激酶，本发明只需选取与之对应的多肽进行荧光标记，按照上述相似的检测过程即可实现特定酪氨酸激酶的活性分析。
[0035]实施例3
[0036]本发明酪氨酸蛋白激酶活性分析方法也适用于蛋白激酶抑制剂的筛选。下面用已知的Src抑制剂PP2(3-(4-氯苯基)-1-叔丁基-1H-吡唑并[3，4-D]嘧啶-4-胺)为例，验证此方法在抑制剂筛选中的可行性，具体实验过程如下:
[0037]1、将2yL 7X 10—3yg/yL的酪氨酸蛋白激酶Src(所用酶活性为1020U/mg)溶液和不同浓度的抑制剂PP2水溶液、2yL 25ymo I/L羧基四甲基罗丹明标记的多肽(由吉尔生化上海有限公司提供，多肽的氨基酸序列为RRRRIYGEFKK)水溶液和3yLlmmol/L ATP水溶液分散在25mmol/L pH值为7.5的HEPES缓冲液(含10mmol/L MgCl2)中，终体积为20yL，使混合体系中抑制剂PP2的终浓度分别是OnmoI/L、lnmol/L、5nmol/L、10nmol/L、50nmol/L、10nmo 1/L、2001111101/1、500醒01/1、1411101/1、5411101/1。将该混合体系在恒温培养振荡器上37°(:温育60分钟，进行磷酸化反应。
[0038]2、向步骤I磷酸化反应后的溶液中加入3yL 2kU/mL的酪氨酸酶水溶液、40μL250mmol/L pH值为6.6的Tris-HCl缓冲溶液，用水定容至200yL，然后在恒温培养振荡器上37°C温育40分钟，进行酪氨酸酶氧化反应。反应完后，用荧光仪(激发波长554nm，最大发射波长583nm，入射狭缝2.0nm，出射狭缝1.0nm)测量反应体系的荧光强度。反应体系的荧光信号随抑制剂PP2浓度变化的光谱图见图5，并绘制583nm处反应体系的荧光强度与抑制剂PP2浓度的对数关系曲线(见图6)。
[0039]由图5和6可见，在固定酪氨酸蛋白激酶Src浓度条件下，随着抑制剂PP2浓度的增加，体系的荧光强度逐渐减弱。由此可知，抑制剂PP2浓度的增加提高了抑制酪氨酸蛋白激酶Src活性的能力，导致未被磷酸化的底物多肽比例增加，在酪氨酸酶氧化作用后，荧光染料的荧光强度逐渐降低。此结果表明本发明方法能够用于酪氨酸蛋白激酶抑制剂的筛选。
【主权项】
1.一种酪氨酸酶辅助的荧光增强型酪氨酸蛋白激酶活性分析方法，其特征在于它由下述步骤组成: (1)将已知活性的酪氨酸蛋白激酶与其对应的荧光标记的多肽底物混合进行磷酸化反应； (2)将步骤(I)中磷酸化反应后的溶液与酪氨酸酶混合后检测体系的荧光强度，绘制荧光强度随酪氨酸蛋白激酶活性变化的标准曲线； (3)按照上述步骤(I)和(2)检测待测酪氨酸蛋白激酶样品对应的荧光强度，根据标准曲线即可实现待测样品中酪氨酸蛋白激酶活性的定量分析。2.根据权利要求1所述的酪氨酸酶辅助的荧光增强型酪氨酸蛋白激酶活性分析方法，其特征在于:所述步骤(2)中，按照每微摩尔的荧光标记多肽底物加入14?15U酪氨酸酶。3.根据权利要求1或2所述的酪氨酸酶辅助的荧光增强型酪氨酸蛋白激酶活性分析方法，其特征在于:在步骤(I)中，所述荧光标记多肽底物中的荧光标记物为羧基四甲基罗丹明、2，7_ 二甲基-4，5-二氯-6-羧基荧光素、四氯-6-羧基荧光素、六氯-6-甲基荧光素、德克萨斯红、3H-吲哚菁染料中的任意一种。
【文档编号】G01N21/64GK105842219SQ201610348232
【公开日】2016年8月10日
【申请日】2016年5月24日
【发明人】刘成辉, 蒋超, 申海霞, 李正平
【申请人】陕西师范大学