一种检测禽和猪组织中哌嗪残留的确证分析方法
【专利摘要】本发明涉及兽药残留检测领域，具体涉及一种高效检测禽和猪组织(肌肉、肝脏、肾脏和皮脂)中哌嗪残留的确证分析方法。该方法是将组织样品经过加速溶剂萃取法提取、净化和衍生化处理后，用气相色谱?串联质谱法(GC/MS?MS)进行检测。本发明在回收率、精密度和灵敏度三个方面与其他检测方法进行比较，具有简单、快速、准确和灵敏的优点。
【专利说明】
-种检测禽和猪组织中脈瞎残留的确证分析方法
技术领域
[0001] 本发明设及兽药残留检测领域，具体设及一种检测禽和猪组织中赃嗦残留的确证 分析方法。
【背景技术】
[0002] 目前国内外对赃嗦的残留检测方法虽有不少报道，主要有重量分析法、比色法、非 水滴定法、气相色谱法、高效液相色谱法和(超)高效液相色谱-串联质谱法等，但重量分析 法、比色法和非水滴定法不适合生物样品中赃嗦的检测，灵敏度较低。在液相色谱上，赃嗦 无发光基团，不能直接被紫外检测器或巧光检测器检测，故常通过柱前衍生使赃嗦带上特 定基团，从而使检测成为可能。而到目前为止，通过较为简单的乙酸酢柱前衍生法检测动物 组织中赃嗦残留的气相色谱-串联质谱法(GC-MS/MS)的研究国内、外均尚未见报道。
【发明内容】
[0003] 为了能检测并确证赃嗦在禽和猪组织中的残留，满足欧盟标准，本发明提供了一 种气相色谱-串联质谱法(GC-MS/MS)，能快速、准确地检测禽和猪组织中赃嗦的残留。
[0004] 本发明所采用的技术方案是：一种检测禽和猪组织中赃嗦残留的确证分析方法， 是将组织样品经过提取、净化和柱前衍生化后，进行气相色谱-串联质谱法(GC-MS/MS)检 巧U。W高纯氮气(99.999 % )为载气，流速为1. OmL/min，程序升溫模式，不分流进样，进样体 积：1.0化。采用电子轰击化I)离子源，全扫描（SCAN)和选择离子监测（SIM)方式定性，选择 反应监测(Auto SRM)方式定量。
[0005] 所述的禽和猪组织样品提取、净化和衍生化具体内容是:将均质好的组织样品，在 研鉢中与3.Og无水硫酸钢研磨混匀吸收样品水分，再加入3. Og左右娃藻±研磨至粉状混 匀，装填入加速溶剂萃取仪22mL不诱钢萃取池中，在80°C和ISOOpsi压力条件下静态萃取 5min，氮气吹扫60s，每个萃取池萃取两次，第一次使用正己烧，去脂用，收集液弃掉，第二次 萃取液收集于60mL收集瓶，转移至50mL离屯、管，即得提取液。
[0006] 提取液过Strata-X-C固相萃取小柱，依次用3血甲醇、3血2.0%甲酸水溶液将SPE 小柱活化平衡，上样后待提取液匀速流干后，再依次用3mL O.lmol/L的盐酸水溶液、3mL O.lmol/L的盐酸甲醇淋洗，待小柱干燥后，最终用2mL 5.0%氨水甲醇分两次进行洗脱，收 集洗脱液于2mL具塞离屯、管中。
[0007] 将上述装有净化收集液的具塞离屯、管，置于离屯、浓缩仪中，4(TC真空负压浓缩至 干，后加入1. OmL二氯甲烧溶解残渣，满旋混匀后，转移至IOmL玻璃小瓶，并加入50化乙酸酢 和100化立乙胺，梓紧瓶盖，于50°C溫度下衍生30min后取出，冷却至室溫，衍生后液体并洗 涂液转移至2mL具塞离屯、管，满旋振荡使基质混匀，12000Xg，常溫离屯、lOmin，将上层清液 过0.22皿滤膜，滤液供GC-MS/MS测定分析。
[000引本发明在回收率、精密度和灵敏度=个方面与其他检测方法进行比较，本方法具 有简单、快速、准确和灵敏的优点。
【附图说明】
[0009] 图1赃嗦衍生后产物（1,4-二乙酷基赃嗦)质谱图。
[0010] 图2赃嗦标准工作曲线(n = 7)。
[0011] 图3空白鸡组织(肌肉、肝脏、肾脏和皮肤+脂肪)样品的总离子流图（TIC)和定量离 子的质量色谱图(MC)。
[0012] 图4空白鸡组织(肌肉、肝脏、肾脏和皮肤+脂肪)样品添加100.OOiig/kg标准品的混 合总离子流图(MIC)和定量离子总离子流图（TIC)。
[0013] 图5空白鸭组织(肌肉、肝脏、肾脏和皮肤+脂肪)样品的总离子流图（TIC)和定量离 子的质量色谱图(MC)。
[0014] 图6空白鸭组织(肌肉、肝脏、肾脏和皮肤+脂肪)样品添加100.OOiig/kg标准品的混 合总离子流图(MIC)和定量离子总离子流图（TIC)。
[0015] 图7空白碟组织(肌肉、肝脏、肾脏和皮肤+脂肪)样品的总离子流图（TIC)和定量离 子的质量色谱图(MC)。
[0016] 图8空白碟组织(肌肉、肝脏、肾脏和皮肤+脂肪)样品添加100.OOiigAg标准品的混 合总离子流图(MIC)和定量离子总离子流图（TIC)。
[0017] 图9空白猪组织(肌肉、肝脏、肾脏和皮肤+脂肪)样品的总离子流图（TIC)和定量离 子的质量色谱图(MC)。
[001引图10空白猪组织(肌肉、肝脏、肾脏和皮肤+脂肪)样品添加100.OOiig/kg标准品的 混合总离子流图(MIC)和定量离子总离子流图（TIC)。
【具体实施方式】
[0019] 在本发明中所使用的术语，除非有另外说明，一般具有本领域普通技术人员通常 理解的含义。
[0020] 下面结合具体实施例，并参照数据进一步详细地描述本发明。运些实施例只是为 了举例说明本发明，而非W任何方式限制本发明的范围。
[0021] 在W下的实施例中，未详细描述的各种过程和方法是本领域中公知的常规方法。 所用试剂的来源、商品名W及有必要列出其组成成分者，均在首次出现时标明，其后所用相 同试剂如无特殊说明，均W首次标明的内容相同。
[0022] 1.试验家禽和猪的饲养和样品采集
[0023] 分别选取上市日龄S元杂交猪和家禽，即16周龄京海黄鸡、10周龄扬州碟、8周龄 樓桃谷鸭各12羽W及6月龄杜X长X大=元杂交猪6头，公、母各半，单笼(栏)饲养，饲喂不 含任何药物的全价饲料，自由饮水。饲养2周后屠宰时分别取供试动物的肌肉、肝脏、肾脏和 皮肤和脂肪组织作为空白组织样品，-35°C保存，使用时将该样品绞碎使之均质。
[0024] 2.本发明提取、净化与衍生化步骤
[0025] 1)准确称取(2.0±0.02)g均质好的空白组织样品，在研鉢中与3.Og无水硫酸钢研 磨混匀吸收样品水分；
[00%] 2)再加入3. Og左右娃藻±研磨至粉状混匀后，装填入22mL不诱钢萃取池；
[0027] 3)在80°C和ISOOpsi条件下，静态萃取5min。每个萃取池萃取两次(各5min)，第一 次使用正己烧，去脂用，收集液弃掉，第二次使用纯乙腊，萃取用，萃取液收集于60mL收集 瓶，转移至50mL离屯、管使用纯乙腊；
[002引4)依次分别用3.OmL甲醇和3.OmL 2.0%甲酸水溶液将混合阳离子固相萃取小柱 (Stra1:a-X-C)活化；
[0029] 5)向活化后的固相萃取小柱中加入提取液，匀速流干后，依次用3mL O.lmol/L的 盐酸水溶液和3mL 0.1mol/L的盐酸甲醇淋洗；
[0030] 6)待固相萃取小柱干燥后，用2mL 5.0%氨水甲醇分两次进行洗脱，将赃嗦洗脱至 2mL离屯、管中；
[0031] 7)将离屯、管置于离屯、浓缩仪中，40°C真空负压浓缩至干；
[0032] 8)加入1. OmL二氯甲烧溶解残渣，满旋混匀后，转移至IOmL玻璃小瓶；
[0033] 9)加入50化乙酸酢和10化LS乙胺，梓紧瓶盖，于50°C溫度下衍生30min;
[0034] 10)衍生后液体并洗涂液转移至2mL具塞离屯、管，满旋振荡使基质混匀，12000 X g， 常溫离屯、IOmin，将上层清液过0.22皿滤膜，滤液供GC-MS/MS测定分析。
[0035] 3试验条件
[0036] 3.1气相色谱条件
[0037] 色谱柱：色谱柱：TG-SMSAmine (30m X 0.25mm i.d. XO. 25WI1);载气：高纯氮气（〉 99.999%，60psi)，载气柱流速：1. OmL/min;程序升溫参数:80°C保持Imin，20°C/min升至 280°C，保持Imin。进样口溫度：280°C ;分流模式:不分流进样，分流流量:50.OmL/min; 2min 后开阀（载气节省时间2min，载气节省流量20mL/min);不分流时间：I .Omin;进样体积：I .Oy L。
[003引3.2质谱条件
[0039] 电离模式：电子轰击化I);电子束能量（电离能）：70eV;碰撞气：高纯氣气（〉 99.999%，4化Si);离子源溫度:280°C ;传输线溫度:280°C ;溶剂延迟:4.Omin;采集数据方 式:全扫描（SCAN)和选择离子监测（SIM)方式定性，选择反应监测(Auto SRM)方式定量。赃 嗦衍生产物(1,4-二乙酷基赃嗦)的分子量和质谱参数见表1，质谱图见附图1。
[0040] 表1赃嗦的分子量和质谱参数
[0041]
[00创注:*定量离子对
[0043] 4定量方法与定性方法
[0044] 4.1标准曲线的绘制
[0045] 准确吸取10.0 Omg/L浓度赃嗦标准工作液1、10、20、50、100、200和400化(复溶后， 相当于添加赃嗦浓度为 5.00、50.00、100.00、250、500.00、1000.00和2000.00蛇/1^)，并用 二氯甲烧补足溶液至总体积相等，再依次迅速加入50化乙酸酢和10化LS乙胺，梓紧瓶盖， 50°C烘箱中衍生30min。在优化好的气相色谱和质谱条件下，进行GC-MS/MS检测。W基质标 准工作液的浓度为横坐标(X)，定量离子对m/zl70.1>68.1的峰面积为纵坐标(y)，绘制标 准曲线，W此曲线作为待测样品的定量曲线，并得出其回归方程和决定系数见表2,标准曲 线见附图2。若待测样品的浓度超出了线性范围，则应将被分析样品进行稀释，所得结果乘 稀释倍数得原样品浓度。
[0046] 表2赃嗦的线性回归方程、决定系数和线性范围
[0047]
[004引由表2和附图2可见，本发明条件下，在标准品浓度为5.00-2000.0化g/kg范围内， 赃嗦的定量子离子(m/z 170. D68.1)的峰面积(y)与其浓度(X)呈线性相关，且线性关系良 好。
[0049] 4.2回收率及精密度的测定
[0050] 准确称取2 . Og匀质后的空白组织样品于研鉢中，与无水硫酸钢和研磨混匀后，依 次添加10.0 Omg/L浓度标准工作液1、10、20、100、200和40化L (相当于空白组织样品中赃嗦 添加浓度为5.0(KL0Q)、50.00、100.00、500.00、1000.00和2000.00yg/Kg)，并用二氯甲烧补 足液体至总体积相等，再次与娃藻±研磨混匀装填入22mL萃取池，每个添加水平设置6个平 行，经提取、净化和衍生化方法处理后，在上述优化好的气相色谱和质谱分析条件（3.1、 3.2)下，进行GC-MS/MS分析。空白鸡组织(肌肉、肝脏、肾脏和皮肤+脂肪)样品的总离子流图 (TIC)和定量离子的质量色谱图(MC)见图3;空白鸡组织(肌肉、肝脏、肾脏和皮肤+脂肪)样 品添加100.OOiig/kg标准品的混合总离子流图(MIC)和定量离子总离子流图（TIC)见图4;空 白鸭组织(肌肉、肝脏、肾脏和皮肤+脂肪)样品的总离子流图（TIC)和定量离子的质量色谱 图（MC)见图5;空白鸭组织(肌肉、肝脏、肾脏和皮肤+脂肪)样品添加100.OOiig/kg标准品的 混合总离子流图(MIC)和定量离子总离子流图（TIC)见图6;空白碟组织(肌肉、肝脏、肾脏和 皮肤+脂肪)样品的总离子流图（TIC)和定量离子的质量色谱图（MC)见图7;空白碟组织(肌 肉、肝脏、肾脏和皮肤+脂肪)样品添加100.0 OygAg标准品的混合总离子流图(MIC)和定量 离子总离子流图（TIC)见图8;空白猪组织(肌肉、肝脏、肾脏和皮肤+脂肪)样品的总离子流 图（TIC)和定量离子的质量色谱图(MC)见图9;空白猪组织(肌肉、肝脏、肾脏和皮肤+脂肪） 样品添加100.0 OygAg标准品的混合总离子流图（MIC)和定量离子总离子流图（TIC)见图 10。
[0051] 日内精密度测定:在同日内不同时间用同一条标准曲线及同一台仪器6次重复测 定添加浓度分别为5.00 化09)、50.00、100.00、500.00、1000.00和2000.0 Oiig/kg的样品，求 得日内（批内）精密度。
[0052] 日间精密度测定:在一周内不同日W不同的标准曲线及同一台仪器6次重复测定 上述浓度的样品，求得日间(批间)精密度。
[0053] 将添加样品所得定量子离子(m/z 170.1〉68.1)的峰面积代入标准曲线中求得浓 度，与实际添加的分析物的浓度相比求得添加回收率。
[0054] 在此条件下，本发明方法提取禽和猪组织中赃嗦的添加回收率及精密度见表3-6。
[0055] 表3鸡组织中赃嗦的添加回收率及精密度(n = 6)
[0化6]
[0化7] [0化引
[0化9]
[0060]
[0061]
[0062]
[0063]
[0064]
[00 化]
[0066] 4.3检测限及定量限的确定
[0067] 每种组织各取6个平行空白样品进行添加回收试验，通过逐级降低赃嗦的浓度，经 提取、净化和衍生化后，GC-MS/MS条件进行分析，得出信噪比（S/N)平均值，重复试验，W子 离子的信噪比大于等于l〇(S/N>10)时所对应的的添加浓度为定量限化OQ); W子离子的信 噪比大于等于3(S/N>3)时所对应的的添加浓度为定量限化OD)，同时对LOQ浓度点的回收 率及相对标准偏差(RSD)进行考察。
[0068] 根据6个平行空白组织样品的添加回收试验，得到赃嗦在现有条件下的定量限为 5.0]ig/kg，检测限分别为1 .f5]ig/kg
[0069] 4.4确定限及检测容量的确定
[0070] 选取20个空白组织样品（2.Og),添加添加最大残留限量(M化)浓度水平（100.0化 g/Kg)赃嗦，进行回收试验，经提取、净化和衍生化后，进行GC-MS/MS分析，求得标准差(SD)。 CCa 和C处的计算公式分别为CCa = MRLs+1.64XSD(a = 5%WPCCe = CCa+1.64XSD(e = 5% )。(：化和C地均在最大残留限量（100.0化g/Kg)的附近，符合欧盟的规定，完全满足药物 残留分析要求。各组织确定限和检测容量结果见表7。
[0071] 表7不同组织100.0 Oiig/Kg添加水平下的确定限和检测容量
[0072]
【主权项】
1. 一种高效检测禽和猪组织中哌嗪残留的新的确证分析方法，其特征在于，将禽和猪 组织样品经过提取、净化和衍生化处理后，用气相色谱-串联质谱法检测。2. 根据权利要求1所述的方法，气相色谱-串联质谱的条件是：以>99.999%日高纯氦气 为载气，流速为1.0 mL/min，程序升温，进样量为1.0 yL;采用电子轰击离子源，选择离子监测 定性，选择反应监测结合外标法定量分析。3. 根据权利要求1所述的方法，所述的组织样品的提取、净化和衍生化处理是：组织样 品采用加速溶剂萃取仪经正己烷去脂、乙腈萃取的在线过程，提取液用固相萃取法净化、乙 酸酐衍生法衍生。4. 根据权利要求3所述的方法，所述的组织样品提取、净化和衍生化的具体步骤是：均 质好的组织样品，在研钵中依次与无水硫酸钠和硅藻土研磨混匀，装入萃取池并在80°C和 1500psi条件下萃取，所得提取液过Strata-X-C阳离子固相萃取小柱，先依次用甲醇和 2.0 %甲酸水溶液将SPE小柱活化平衡，上样后待提取液匀速流干后，再依次用0. lmol/L的 盐酸水溶液和〇. Imo 1/L的盐酸甲醇淋洗，待小柱干燥后，用5.0 %氨水甲醇洗脱，所得洗脱 液经离心浓缩仪40°C真空负压浓缩至干，后用二氯甲烷溶解残渣，涡旋混匀后，转移至衍生 小瓶，并加入50yL乙酸酐和IOOyL三乙胺，拧紧瓶盖，于50°C烘箱中衍生30min后取出，冷却 至室温，将衍生后液体并洗液转移至2ml具塞离心管，12000 X g，常温离心10min，过0.22μπι 滤膜，滤液供GC-MS/MS测定分析。
【文档编号】G01N30/02GK105954370SQ201610246436
【公开日】2016年9月21日
【申请日】2016年4月20日
【发明人】谢恺舟, 刘亚楠, 庞茂达, 谢星, 崔璐璐, 王波, 高强, 张杨杨, 张跟喜, 戴国俊, 卜仕金, 王冉, 王金玉
【申请人】扬州大学