磁性颗粒及其聚类的检测的制作方法

专利名称：磁性颗粒及其聚类的检测的制作方法
技术领域：
本发明涉及用于检测样本室中的磁性颗粒的设备和方法。
背景技术：
磁性颗粒是例如用在生物传感器中以标记人感兴趣的样本的成分。在US2009/148933A1中描述了这种应用的典型范例。根据本文献,在关掉外部磁场时超导珠的磁化强度消失，使得这些颗粒不会成团(
)。

发明内容
基于这一背景，本发明的目的是提供实现对磁性颗粒的更鲁棒和精确检测的手段。 这一目的是由根据权利要求I所述的方法和根据权利要求4到6所述的设备实现的。在从属权利要求中公开了优选实施例。根据第一方面，本发明涉及一种用于检测样本室中的磁性颗粒的“基本方法”，其中，术语“磁性颗粒”应表示持久的磁性颗粒或可磁化颗粒，尤其是纳米颗粒或微米颗粒。在很多情况下，磁性颗粒用作标签，即它们要结合到人实际感兴趣的一些目标成分(例如分子)。“样本室”通常是腔，尤其是开放腔、闭合腔或者通过流体连接通道连接到其他腔的腔。该方法将包括如下步骤，可以按照列举的或任何其他适当次序执行a)确定与第一检测区域中的磁性颗粒的量相关的参数，下文称为“颗粒参数”。可以通过任何适当定义来表示“磁性颗粒的量”，包括绝对值(例如，磁性颗粒的总数量或总质量)和相对值(例如，每单位体积或面积的磁性颗粒数量或质量)。b)确定与第二检测区域中的磁性颗粒的聚类的量或程度相关的参数，下文称为“聚类参数”。可以通过任何适当定义(例如，每个聚类的磁性颗粒平均数量或质量)，包括取决于颗粒聚类的任何参数，表示“聚类的程度”。第一和第二检测区域通常是样本室的子区域。它们可以是相同的，部分交叠的或者不同的。此外，它们可以包括整个样本室。c)颗粒参数的评估基于聚类参数。例如可以在数据处理装置中自动进行这种评估，所述数据处理装置可以用专用电子硬件、具有适当软件的数字数据处理硬件或两者的混合来构建。该方法具有如下优点除了检测样本中的磁性颗粒之外，它还提供了关于所述颗粒的可能聚类的信息。在实践中证明这种信息很重要，因为颗粒检测过程的输出结果常常受到磁性颗粒聚类存在的影响。如果不存在磁性颗粒的(不可逆)聚类则产生正确结果的检测方法例如可以在发生越多磁性颗粒聚类时产生越来越弱的结果。因此可以利用确定这样聚类的程度提高颗粒检测的可靠性、鲁棒性和/或精确度。能够将关于颗粒参数和聚类参数的信息用于不同目的。在优选实施例中，如果聚类参数偏离预定值集合，即预定“正常范围”，则生成警报信号。于是能够通知用户异常状况发生，这削弱了颗粒检测结果的可靠性，并可能例如必须要改变操作参数。根据另一实施例，可以基于聚类参数校正颗粒参数。这种方法要求关于颗粒参数对颗粒聚类程度依赖性的一些信息是已知的，例如从理论研究或校准流程已知。本发明的“基本方法”需要确定颗粒参数(与第一检测区域中的磁性颗粒量相关)和聚类参数(与第二检测区域中的聚类的程度相关)作为必要先决条件。在下文中，描述了能够应用于该方法中的各种设备，以提供这些参数或至少可以从其导出颗粒参数和聚类参数的信息(优选通过纯粹计算，即无需额外测量)。然而，应该注意，这些设备也可以用于其他目的。用于“基本方法”中的第一设备包括如下部件a)磁场发生器,其用于在样本室中生成磁场，其中，所述场在结合表面的“第一场区域”和“第二场区域”中分别相对于结合表面具有不同的倾斜(inclination)。磁场发生 器例如可以包括一个或多个永磁体和/或可以有选择地进行控制的电磁体。优选同时采取磁场在第一和第二场区域中的不同的倾斜，但通常也可以相继地采用它们(即，在部分交叠期间甚至在不同时段)。此外，第一和第二场区域优选是不同的，但通常它们也可以部分交叠，甚至相同(其中，在场区域交叠的那些部分中必须要相继采用具有不同的倾斜的磁场)。此外，“结合表面”通常应该是样本室和磁性颗粒能够驻留其上或附近的相邻部件之间的界面。如其名称所示，在所述“结合”表面和磁性颗粒之间优选有每种链接或结合。b)传感器元件，其用于(分离地)检测第一和第二场区域中的磁性颗粒，其中，传感器元件产生与其检测结果对应的检测信号。c)评估单元，其用于使上述传感器元件提供的第一和第二场区域的检测信号彼此相关。可以在专用电子硬件、具有关联软件的数字数据处理硬件或两者的混合中实现评估单元。检测信号的相关例如可以包括计算其比值、差异或这两个变量的任何其他函数。与所述第一设备相关的是一种包括如下步骤的方法a)在样本室中生成磁场，其中，所述场在结合表面的“第一场区域”和“第二场区域”中分别相对于结合表面具有不同的倾斜。b)检测第一和第二场区域中的磁性颗粒。c)将来自第一和第二场区域的检测信号彼此相关。所述第一设备和对应方法允许通过磁场操控磁性颗粒并检测在结合表面处的这些颗粒。具体特征是施加的磁场在结合表面的两个区域中具有至少两个不同的倾斜，并分离地检测这些区域中的磁性颗粒，这样能够将所得的检测信号彼此相关。结果表明，这种方法产生了关于结合表面状况的宝贵附加信息。具体而言，能够获得磁性颗粒的可能(不可逆)聚类的信息，因为所述聚类对磁场的方向敏感。因此，能够从检测信号导出“颗粒参数”和“聚类参数”。应当指出，以上设备中发生的“基本方法”的“检测区域”和“场区域”是不同概念。在典型的实施例中，第一和第二检测区域是相同的，对应于第一和第二场区域的结合。这意味着利用将这一子区区分成第一和第二场区域而针对样本室的同一子区确定“颗粒参数”和“聚类参数”。用于“基本方法”中的第二设备包括如下部件a)磁场发生器，其用于在样本室中生成磁场，所述场在结合表面的“第一场区域”中倾斜于结合表面。在当前语境中，如果磁场不平行于表面，即如果场和表面之间的角度α满足0° <α <90°，则认为磁场是相对于表面“倾斜的”。b)传感器元件，其用于检测所述第一场区域中的磁性颗粒，其中。传感器元件产生与其检测结果对应的检测信号。c)评估单元，其用于将持久关闭所述磁场之前和之后获得的检测信号相关。在当前语境中，如果磁场的关闭的持续时间长于与结合表面处弛豫和扩散过程相关的预定时段，则认为磁场的关闭是“持久的”。对于直径约为500nm的磁性颗粒，如果持续超过一分钟，优选长于两分钟，通常可以认为是“持久”关闭。对于更大(更重)的颗粒(例如IOOOnm的珠子)，所需的最少时间可以更短，因为更大的重力将向表面更快地驱动颗粒。第二设备可以任选地包括第一设备的特征(在这种情况下，术语“第一场区域”可以指同一区域)。通常，上文相对于第一设备给出的解释也类似适用于第二设备。
与所述第二设备相关的是一种包括如下步骤的方法a)在样本室中生成相对于结合表面的“第一”场区域中的结合表面倾斜的磁场。b)检测第一场区域中的磁性颗粒。c)将持久关闭所述磁场之前和之后获得的检测信号相关。所述第二设备和对应方法允许通过磁场操控磁性颗粒并检测结合表面的这些颗粒。第二设备和方法的具体特征是磁场应该相对于结合表面倾斜，检测这一场作用之前和之后的检测信号并彼此相关。结果表明，这种方式提供了关于结合表面处的状况，尤其是关于磁性颗粒可能的(不可逆)聚类的宝贵额外信息。再次可以使用这种信息导出“颗粒参数”和“聚类参数”。在第一或第二设备的第一场区域中，磁场优选包括相对于结合表面超过约10°的角度。在这种情况下，磁场相对于结合表面充分倾斜，以显示磁性颗粒的聚类效应。在第二场区域(如果有的话)中，磁场优选包括相对于结合表面小于约10°，更优选小于约5°的角度。这样的磁场可以被认为基本平行于第二场区域中的结合表面。在这种配置中使磁性颗粒聚类的扩散相关效应最小化。用于“基本方法”中的第三设备包括如下部件a) “颗粒检测单元”，其用于检测样本室第一检测区域中的磁性颗粒。颗粒检测单元通常产生与检测结果相关联的信号(例如电信号)，例如将检测到的磁性颗粒的量表达为一些模拟值。因此，这一信号可以直接对应于本发明的方法需要的颗粒参数。颗粒检测单元可以应用任何适当的检测原理，例如光学、磁性、机械、声学、热和/或电的原理。最优选地，颗粒检测单元将是表面敏感的，即仅在接近于样本室表面的有限区域之内检测磁性颗粒。b) “聚类检测单元”，其用于检测磁性颗粒的聚类的程度。同样地，聚类检测单元通常产生与检测结果相关联并且可以直接对应于本发明的方法要求的聚类参数的信号(例如电信号)。有不同方式可以检测聚类的存在。在优选实施例中，聚类检测单元例如可以包括光源和光检测器，所述光检测器被布置成测量第二检测区域中的光透射。对于包括多个磁性颗粒的非球状聚类，例如与外部磁场对准的磁性颗粒链，光透射将典型地取决于聚类的发生和程度。于是透射测量提供了确定聚类参数的适当手段。
在上述情况下，所述聚类检测单元可以优选包括至少一个反射和/或折射界面，光在其从光源到光检测器的途中遇到所述界面。例如能够将反射表面(镜片)用在样本室的一侧以向光源反射回光，从而允许在样本室的同一侧布置光源和光检测器。类似地，可以使用样本室侧面上的折射窗口重定向光，使得可以在方便的位置布置光源和/或光检测器。根据本发明的方法和设备优选可以包括磁场发生器，例如永磁体或电磁体，用于在样本室中生成作用于磁性颗粒的磁场。磁场发生器优选可以包括马蹄形磁体。这提供了明确行为的配置，利用其能够容易地产生不同的倾斜的磁场(例如，在极尖附近倾斜更大，它们之间大致为平行方向)。此外或备选地，磁场发生器可以包括与传感器元件相对设置的磁体。样本室中的磁场可以用于各种目的，通常包括与磁性颗粒交互作用。在很多重要应用中，配置磁场，使其在磁性颗粒上产生力，尤其是向结合表面吸引的力。为此，磁场通常将具有梯度，以产生期望方向的力。可以使用向结合表面吸引磁性颗粒来加快其从整个样 本体积向检测它们的小得多区域中的迁移。在磁场作用期间，通常会形成磁性颗粒的聚类或链，其可以在关闭场之后持续。可以通过确定聚类参数来处理这种(不希望有的)不可逆聚类。根据具有磁场发生器的实施例的进一步发展，磁场被调制，尤其是被反复开关。因此磁场对磁性颗粒的效果与颗粒不受外部磁场影响的周期交替。如果磁场在磁性颗粒上施加力，这意味着例如颗粒的强制运动与自由(扩散控制的)迁移交替。应当指出，在当前语境中表示的磁场关闭通常比上文定义的“持久”关闭更短。磁场反复关闭的频率优选介于约IOHz和大约O. IHz之间(其中，将这种切换的周期定义为两次相继打开事件之间的时间)。磁场反复关闭的占空比优选介于大约20%和大约90%之间，其中，所述占空比定义为“开”时段相对于整个切换期间(包括“开”和“关”时段)的持续时间。通过占空比，可以控制磁性颗粒必须要自由迁移多长时间而不受磁场影响。如果在磁场中发生了磁性颗粒的聚类并且如果聚类的取向相对于结合表面倾斜，无场迁移的可用时间决定了远端磁性颗粒或子聚类是否有足够时间通过扩散到达结合表面。因此，占空比的值可以决定性地影响检测流程的结果。例如可以将这种相关性用于判断聚类是可逆的(在关闭磁场之后不发生子聚类)还是不可逆的(发生子聚类)。所述磁场切换尤其可以发生在检测颗粒参数和/或聚类参数期间。如上所述，由于磁场作用而形成的磁性颗粒聚类通常将由于一旦关闭磁场而发生热运动而分裂。然而，在持久或不可逆聚类的情况下，通过磁性方式形成的颗粒聚类可以因为任何原因(例如由于化学结合)而持续。因此可以使用调制磁场的作用在可逆和不可逆磁性颗粒聚类之间区分并确定(不可逆)聚类的程度。可以从各种不同测量推断可逆和不可逆聚类之间的上述区分。最优选地，可以相对于局部相对幅度，即相对于某个时间点最近局部极大值和最近局部极小值之间的相对差异，来评估聚类检测单元的检测信号，其中，分别在打开或关闭磁场时，采用上述局部极值。在本发明的优选实施例中，样本室包括覆盖有针对磁性颗粒的结合部位的结合表面。应当指出，在当前语境中，磁性颗粒常常可以包含来自被研究样本的特异结合的目标成分(例如原生质)，并且可以通过这些目标成分结合到结合部位。在结合部位仅结合特定聚类体的磁性颗粒，尤其是包括所述目标成分的磁性颗粒的意义上，结合部位可以相应地是“特异的”。如果是该方法或设备的一部分，可以通过任何适当的方法或原理，例如通过光学、磁性、机械、声学、热学和/或电学测量来实现磁性颗粒的检测。检测信号通常将是电信号或计算机产生的信号(例如来自图像处理)，表示与对应感测区域中的磁性颗粒量相关的标量值。本发明还涉及将上述设备用于分子诊断、生物样品分析、化学样本分析、食物分析和/或法医分析。例如，可以借助于直接或间接附着于目标分子的磁珠或荧光颗粒完成分子诊断。


本发明的这些和其他方面将从下文描述的实施例变得显而易见并参考其加以阐 述。将借助于附图以举例方式描述这些实施例，在附图中图I示意性图示了根据本发明的(第一 /第二)设备的侧视图；图2分离地图示了图I设备中磁场的配置；图3图示了关闭磁场之后磁性颗粒聚类的局部破裂；图4是示出了在发生珠子可逆聚类时对于占空比为40%的脉动磁场第一和第二场区域中的测量结果的图示；图5是在发生珠子可逆聚类时针对90%占空比像图4那样的图示；图6是在发生珠子不可逆聚类时针对40%占空比像图4那样的图示；图7是在发生珠子不可逆聚类时针对90%占空比像图4那样的图示；图8示意性图示了根据本发明的(第三)设备，其具有聚类检测单元，从样本室顶侧向底侧施加光透射；图9示出了图8设备的修改，从样本室的底侧向顶侧和后侧施加光透射；图10不出了图8设备的修改,施加光透射而在样本室的相对侧窗口具有光折射；图11图示了针对磁场多次开/关切换周期，针对没有聚类的样本，在样本室表面上不同位置获得的光透射测量信号；图12图示了针对聚类样本像图11中那样的测量信号；图13以更高时间分辨率示意性图示了打开磁场时以及关闭其之后光透射测量信号的时间过程；图14是将所确定的聚类相关到颗粒检测结果的图示；图15示出了在有和没有被分析物诱发的聚类的样本中检测信号的相对幅度过程。附图中相差100整数倍的相似附图标记或数字是指相同或相似部件。
具体实施例方式在下文中将相对于生物或保健应用描述本发明，生物或保健应用例如包括DNA(分子诊断)和蛋白质(免疫化验)的检测，两者都是人体中所有种类疾病的重要标志。免疫化验技术可以使用小的(超)顺磁性珠有选择地俘获感兴趣的生物标志。接下来，磁珠能够耦合到特异性抗体表面上的部位，接着对准珠子进行最后的检测。基于此，可以开发平台检测仪器以进行分散测量，例如唾液中药物滥用的路旁测试或在医生处进行人体血液中心脏标记的护理点测试。作为上述仪器的范例，图I示意性示出了用于光学检测试剂盒或载体110中提供的磁性颗粒MP的设备100。由于载体被手边的样本污染，它通常将是一次性装置，例如由玻璃或透明塑料(例如聚苯乙烯)通过注射模制生产。此外，可以将载体110逻辑地认为是或不是设备100的一部分。载体110包括样本室111，在其中可以提供待检测(例如药物、抗体、DNA等)目标成分的样本流体。样本还包括磁性颗粒MP，例如超顺磁性珠，其中，这些颗粒MP通常作为标记结合到上述目标成分(为简单起见，图中仅示为磁性颗粒MP)。载体110的质量部分和样 本室111之间的底部界面由称为“结合表面”112的表面形成。这个结合表面112可以任选地涂布有俘获元件，例如，抗体，其能够特异性地结合目标成分。设备100包括光源121 (例如红色650nm LED)，用于向载体110中发射“输入光束” LI。输入光束LI以大于全内反射(TIR)临界角的角度到达结合表面112，因此被全内反射为“输出光束” L2。输出光束L2离开载体110，被光检测器，例如由摄像机131的光敏像素检测到。光检测器131由此生成检测信号，表示输出光束L2的光量(例如，由这个光在整个光谱或光谱某部分中的光强表达)。评估单元132从光检测器接收检测信号以进一步处理(评估、记录等)。设备100还包括磁场发生器140,其用于在结合表面112处和样本室111的相邻空间中可控地生成磁场B。磁场发生器例如可以由电磁体140实现，电磁体具有线圈和马蹄型铁芯，铁芯具有两个磁极尖端141和142。它可以任选地包括其他磁单元，例如试剂盒110(未示出)上方的(例如圆柱状)磁体，通过叠加而共同生成磁场。借助于所生成的磁场，可以操控磁性颗粒MP，即磁化以及特定地移动(如果使用具有梯度的磁场)。于是，例如能够将磁性颗粒MP吸引到结合表面112，以便加快关联目标成分结合到所述表面。所述设备100应用光学模块检测磁性颗粒MP和实际感兴趣的目标成分。为了消除或至少最小化背景的影响(例如样本流体，诸如唾液、血液等)，检测技术应当是表面特异性的。如上所述，这是通过利用受抑全内反射原理实现的。这个原理基于如下事实在入射光束LI被全内反射时，渐逝波传播(以指数方式降落)到样本室111中。如果这种渐逝波然后与具有和水不同折射率的另一介质，例如与磁性颗粒MP相互作用时，输入光的一部分将耦合到样本流体(这被称为“受抑全内反射”)中，并且反射强度将减小(同时对于清洁的界面且没有相互作用的情况，反射强度将为100%)。可以在通过引用并入本文中的WO2008/155723A1中找到这个流程的更多细节。上述种类的设备必须要应对的问题是，像唾液和血液(或血浆)的体液在物理和化学性质方面在患者间表现出很大差异。优选地，生物传感器中使用的化验和激励技术应当对这些变化是鲁棒的。相关的问题是磁性颗粒的不可逆聚类。因为磁场B被用于向结合表面112吸引磁性颗粒MP，所以磁性颗粒MP变得被磁化，并且还开始彼此吸引。形成了磁性聚类链。在放大率足够大的显微镜下可以清楚地观测到这种效果。所述链由磁性颗粒MP彼此施加的磁力(所谓的珠-珠交互)维系在一起。在关闭磁激励场B时，磁性颗粒不再被磁化(如果它们是顺磁性的)，将所述链维系在一起的磁力消失。在正常情况下，所述链再次分裂成个体运动的珠。这一过程被称为“可逆聚类”或磁性聚类磁场导致磁聚类，但一旦关闭磁场，聚类就再次消失。与可逆或磁性聚类相反，不可逆聚类也是可能的。有各种不可逆聚类的方式不可逆聚类能够在没有磁场的情况下发生(参考胶体化学)或者可以由于存在磁场而触发。在不可逆聚类的情况下，当磁场被关闭时，聚类不会分裂成个体运动的珠子。不可逆聚类的量强烈取决于身体流体的组成，可能在患者之间变化很大。这种不可逆聚类的实际机制尚未被理解。一般而言，像图I的设备测量的信号与待检测的目标分子浓度成正比。这是设备的主要功能。高信号表示目标分子的高浓度，低信号表示目标分子的低浓度。然而，试验还表明测量的信号受到不可逆聚类的量的影响。高浓度目标分子和大量不可逆聚类的组合将引起更低的信号。因此，不可逆聚类导致测量的信号的判读错误。对于很多疾病而言，某种 物质(例如心脏标记)的高浓度表示身体中有机能失调。在仪器表示出低信号时，未注意到机能失调。这提出了一个问题。在下文中，将公开确定“聚类参数”的各种方法，聚类参数与(不可逆)聚类的程度相关。如果测量的信号大概不可靠或为了校正测量结果，聚类参数例如能够用于发出警告。在图I到7中，描述了第一种方法，其中利用了磁性颗粒和聚类的行为对磁场取向的依赖性。为了理解提出的方案，首先将参考图2和3稍微详细地解释功能性磁性颗粒MP向结合表面112结合的过程。作为起点，假设测量点上方的样本流体包含磁性颗粒MP (典型为超顺磁性珠)，目标分子附着于它们之上。这里将不会进一步描述如何执行这种培育反应。为了利用靶分子测量磁性颗粒的浓度，这些颗粒必须要结合到结合表面112上印刷的抗体。这些抗体特异性地捕捉目标分子。可以通过增强表面附近目标的浓度来加快目标和抗体之间这种结合反应的运动学。这是利用磁场B实现的。在打开磁场B时,磁力(垂直于结合表面)将磁性颗粒MP从液体向抗体所在的结合表面112驱动。这个过程被称为激励周期的“吸引阶段”。上述过程的实质性方面是，尽管所有磁性颗粒(有或者没有目标)都被磁场B向着结合表面吸引，但这些颗粒中仅有小部分将实际与表面接触并能够结合。磁性颗粒的第一部分将结合到原来空白的表面，但一旦达到特定的磁性颗粒表面覆盖度，后面到达的磁性颗粒将会磁性聚集到已经结合的珠子。因为磁场通常与结合表面112形成一定的角度α(这个角度α取决于磁体磁极141、142之间的位置)，所以聚类CL中远端珠子在渐逝光场外部，测量系统看不到。在连续磁场B下，在磁体中心C处分数表面覆盖度约为10%，在磁体磁极尖端141、142处的区域P附近甚至更低(参考图2)。为了允许磁性聚类的珠子到达结合表面112并结合，在第一吸引阶段之后关闭磁场B。在这种情况下，聚类CL能够分裂成个体运动的珠子，其一部分能够通过扩散到达结合表面。这被称为激励周期的“扩散阶段”。珠子的另一部分将扩散到液体通道中。可以通过再次切换磁场B将这一部分送回表面。通过反复开关磁场B (总的激励序列由很多激励周期构成)，最终所有磁性颗粒都能够结合到结合表面112。这是所述脉冲式激励协议的本质。
从前文显然看出，检测信号的最大部分(90%)是通过聚类分裂成个体磁性颗粒且自由磁性颗粒向结合表面扩散的过程产生的。图3示出了如果在磁场B已经关闭之后发生不完全分裂会发生什么。在图3的左侧部分，整个聚类CL被示为沿磁场B的场线取向。图3的右部示出了在关闭磁场B之后这一聚类不完全分解成子聚类CLa、CLb。根本防止了属于表面结合子聚类CLa的远端磁性颗粒到达结合表面。从前一聚类释放的更长片段CLb表现出更慢的扩散速率，将具有较小机会结合到表面112。在又一种情况下，表面上应当由足够大自由空间容纳更大片段。提到的这些效应将导致结合的磁性颗粒更低的信号。现在主要的问题是如何在由于低目标浓度导致的低水平信号和由于不可逆聚类的效应导致的低水平之间区分。通常，在马蹄形磁体的中心C中测量结合磁性颗粒的表面浓度。在这一位置，测量最高的信号，点之间的可再现性最好。然而，如果考虑由磁场开关构成的脉冲式激励，这种方法对扩散效应的敏感度较低，因为形成的链到结合表面的距离相当短。为了更好地看到扩散的效应，提出在链和结合表面之间生成更大的平均距离。马蹄形磁体140生成的磁场线B的方向或多或少平行于结合表面112。在电磁体140的中心位置C处确实是这种情况(参考图2)，其中场线和结合表面之间的角度α为0°。在更接近电磁体磁极尖端141、142之一的位置P处，磁场线B开始相对于表面形成有限角α。这基本是因为马蹄形磁体的弥散场形状或多或少是圆的一部分。接近磁极尖端位置角度α可以大到30°。在其最低能量状态中，磁性颗粒链指向平行于磁场线B。于是，在磁极尖端附近的“第一场区域P”中，磁性颗粒和结合表面112之间的平均距离比马蹄形磁体中心处“第二场区域C”中大得多。因此，在所述第一场区域P中测量的信号对珠扩散的变化，比第二场区域C处的信号敏感得多。这可以用于检测不可逆聚类。在未出现不可逆聚类时，中心位置C处和磁极尖端位置P处的信号将或多或少相同。图4示出了利用涂有表现出可逆聚类的抗生蛋白链菌素的磁珠进行的示范性测量的结果(在这里以及在下文中，曲线上的字母C表示中心位置的测量值，而P表示磁极尖端位置的测量；垂直轴表示相对单位的检测信号S，而水平轴表示时间t)。激励周期的“占空比”表示激励周期中打开磁场的分数(即占空比表示“吸引阶段”的相对持续时间，剩余持续时间由“扩散阶段”填充)。调谐这一占空比，从而为磁极尖端的位置给予单个珠扩散的足够时·间极尖的磁性颗粒有足够时间达到结合表面并对检测信号做贡献。在图4中这是由40%的占空比实现的，这表示珠子周期时间的40%是向结合表面吸引的，珠子周期时间60%自由向所有方向扩散。在图5中所示的测量中，选择的占空比高得多。在这种情况下，周期时间的90%用于吸引，周期时间的10%用于扩散。在极尖(上方曲线)测量的信号变得低于中心(底部曲线)处的信号，因为选择的扩散时间太短(应当指出，信号S称为“100%”的起动信号；因此将由位于图中“更高信号”上方那些的S值表示)。极尖处的磁性颗粒不能及时到达结合表面。无论何时出现不可逆聚类，都会减缓聚类片段的扩散，因为判断大于单个磁性颗粒，有更多来自流体的流体阻力。图6示出了对于表现出不可逆聚类的抗生蛋白链菌素珠，作为时间t的函数的测量的信号。也可以通过显微镜试验看到这一情况。在中心位置C处，单个磁性颗粒和片段之间的扩散差异较不显著，因为这里，磁性颗粒或片段必须扩散的距离较短。如图4中所示，占空比为40%，对于这一具体情况，在中心C测量的信号稍微小于图4中的对应信号。然而，在极尖位置P处，较慢的扩散防止了片段及时到达表面，即使对于40%的占空比也是如此。如果比较图6和4的对应曲线，显然可以看到这种情况。在极尖第一场区域P中获得的检测信号与在中心C处第二场区域中获得的检测信号S之间的比值减小。可以将这一比值用作不可逆聚类的度量。在图7中所示的测量中，将占空比选择为周期时间的90% (如图5中那样)。由于扩散时间不够，所有检测信号现在更低。马蹄形磁体140生成的磁力指向主要垂直于结合表面112。磁性颗粒运送到磁体中心区域C大致等同于磁性颗粒到极尖区域P的运动。因此基本上，两个区域都收集了相同量的珠子。在最后永久关掉磁场并且一直等待扩散过程完成时，预计在极尖位置P和中心位置C处信号量相同。在实践中，并非始终能见到这种情况，因为珠子还扩散离开表面。然而，在观测到可逆聚类的情况下，关闭占空比为90%的脉冲激励在极尖附近的信号中给出额外贡献(参考图5中的曲线“P”)。在这种情况下，如果给予足够多扩散时间，在激励期间不能及时到达结合表面的珠子仍然能够到达表面。对于不可逆聚类而言，几乎观测不到这样的信号增强(参考图7)。这种额外的信息还指向不可逆聚类行为。
总之，在与磁场大致平行于结合表面的磁体中心C附近的检测信号相比时，在磁场相对于结合表面倾斜的激励磁体的磁极尖端P附近测量检测信号能够提供关于不可逆聚类行为的信息。极尖处检测信号和中心处检测信号之比是用于不可逆聚类的量的度量。于是，可以向手持装置中内置检查。在不可逆聚类似乎表示测量的信号大概不可靠时，可以由评估单元132给出警告。在图8到14中，描述了第二种方法，其中使用专门的聚类检测单元确定聚类参数。图8示意性示出了根据这种方法的传感器装置或设备200。类似于上述实施例，所述设备充当基于纳米颗粒标签，尤其是磁珠或颗粒MP的生物传感器，其提供于试剂盒210的样本室211中，可以利用电磁体241、242和243生成的电磁场致动。通常，利用能够结合特定被分析物分子的抗体使磁性颗粒功能化。在化验期间，可以通过磁力将颗粒MP吸引到样本室211的“结合表面”212的“第一检测区域”DRl中，其中结合颗粒的数目与样本中存在的被分析物分子量正相关或逆相关。然后可以由“颗粒检测单元”220利用任何对接近表面(即在第一检测区域DRl中)的颗粒更敏感的技术检测磁性颗粒MP (在图中，可以布置颗粒检测单元220/延伸到图平面之外，以为其提供对第一检测区域DRl的进出而不被部件262阻碍)。例如，检测技术可以基于渐逝光场，例如如上所述的受抑全内反射(FTIR)。如上所述，像人血浆那样的样本流体似乎包含导致磁性颗粒MP不可逆聚合(“聚类”)的干扰因子，导致化验性能降低。例如，在被分析物是心脏肌钙蛋白I的情况下，这可能导致假阴性结果。因此精确确定磁颗粒化验中聚类的量的方法会很宝贵，其或者作为控制(例如，如果聚类的量超过特定阈值令特定测量的结果不合格)或者作为校准器如果聚类的量和化验性能降低之间的关系已知，可以校正获得的结果，由此获得更精确的测量结果O在设备200中，通过提供“聚类检测单元”260实现上述目的，聚类检测单元允许确定与磁性颗粒MP在“第二检测区域"DR2中的聚类的程度相关的“聚类参数”。简而言之，光通过包含样本室211 (具有流体样本)的试剂盒210透射，流体样本中散布了磁性纳米颗粒MP。在设备200中，这是通过最简单直接的方式实现的将光源261放在试剂盒210 —侧，并由检测器262 (例如图像传感器)收集通过另一侧的第二检测区域DR2透射的光。观测到在打开磁体241、242时，聚类检测单元260记录的强度增大。在关闭线圈并且颗粒再次分散成随机图案时，强度再次减小。如下文将更详细解释的，强度变化允许确定期望的“聚类参数”(聚类的程度)。聚类检测单元260的布置对利用顶端线圈243提出了一些限制，线圈不包括芯材料，允许光通过。图9示出了改造的设备300，其中利用试剂盒310—侧(在图中为顶侧，但也可以在底部或任何其他侧)的(非磁性)反射层363，例如铝箔规避了这些限制。在这一实施例中，光两次通过第二检测区域DR2中的样本。可以将聚类检测单元360的光源361和检测器362都定位在同一侧，例如试剂盒310的底侧。图10图示了另一设备400，其中聚类检测单元460的光源461发射的光在试剂盒410的小面被折射，通过第二检测区域DR2中的液体行进，在试剂盒410的相对小面处再次被折射，并到达检测器462。如果优选仅分析试剂盒的小部分，可以利用与底部线圈在同一侧或相对侧的显微 镜物镜这样做。除了监测透射光强度的变化之外，当然也能够将检测器定位在光源的基本光路外部，由此仅收集散射光。在低颗粒浓度下，这可能更有利，因为难以在高光强下检测非常小的变化。在设备200、300和400中，收集光的检测器262、362或462连接到具有软件的控
制单元(未示出)，控制单元能够为电磁线圈供电并记录检测器测量的强度。图11中示出了测量的透射强度I的典型记录。该记录是在类似于设备300的实验装置中获得的，其中光通过样本反射回记录强度的检测器(图像传感器)。该图实际包括在所记录图像的三个不同位置获得的三条测量曲线。在记录期间，反复开关电磁体。观测到在打开磁体时，磁性颗粒在链中对准并且记录的强度增大。在关闭线圈并且颗粒再次分散成随机图案时，强度再次减小。在图13中更详细地例示了这点，其中在垂直轴上表示(按任意单位)强度I，其中由检测区域的对应显微镜图像表示测量点。图示的时间跨度对应于磁体的一次开/关周期，其中在t=0s和O. 5s打开磁体,在t=0. 5s和2s关闭磁体。观测到在磁性颗粒表现出(不可逆)聚类时，在磁场作用期间形成的链不会(充分)再次分散。尽管图11的图示出了在非聚类样本中获得的信号样本，图12显示了在表现出严重聚类的样本中观测到的信号变化。从图11和12的比较可以看出，在获得的两条曲线之间有很多差异，例如基线(局部最小值)的增大、幅度的差异以及每个个体脉冲的弛豫时间(在这个细节水平上看不到)。可以利用这些差异中的每个量化聚类的量，即“聚类参数”。尤其是给定时间t的相对幅度证明提供了测量特定样本中聚类的量的鲁棒方式，这个相对幅度Im1定义为Irel=100% ·(局部极大值-局部极小值)/局部极小值。图14针对表现出不同程度聚类同时包含相同量被分析物的样本，示出聚类的量和化验性能的测量。化验性能被给出为信号变化S，定义为在终点，即在冲洗步骤(左轴，开放的菱形)之后，从颗粒检测单元(20，320，420)获得的(例如FTIR)测量信号。聚类被给出为聚类化验中测量的相对幅度Irel(右轴，完整菱形)，可以将其解释为颗粒迁移率较低的信号迁移率更低(聚类的程度更高)。通过混合包含相同量被分析物的两种样本获得用于测量的样本，其中第一样本未表现出聚类，而第二样本表现出严重聚类。水平轴表示第二样本的相对量，即诱发聚类的样本的百分比BP。可以看出，诱发聚类的第二样本百分比BP越高，信号幅度S越低(这表示有更多聚类)。从图14显然看出，聚类的量Irel和化验性能S是相关的，其中这种方法对样本中的聚类的程度非常敏感。图14还示出了存在聚类的结果是磁性标签化验中的测量的信号变化S未正确反映样本中被分析物实际浓度。如上所述，在这种情况下可以通过两种方式使用聚类的量Irel的确定I.作为控制如果样本显示出超过特定阈值的聚类，取消测量的资格，设备返回错误消息。这对于排除假阴性是非常重要的。2.作为校准器在其知道一定量的聚类如何导致磁性颗粒与表面的相互作用减小(因此减小结束信号)时，能够校正这种减小的相互作用并将信号变化(S)的结果乘以取 决于聚类的量(Iw)的倍数。除了不希望上述聚类之外，应当指出，所提出的技术还能够测量由于存在目标而诱发的聚类。作为范例，将涂布有针对心脏肌钙蛋白I (CTnI)分子第一抗原决定基的抗体的磁性颗粒与涂布有针对cTnl第二抗原决定基的抗体的磁性颗粒混合。最后，还增加cTnl(浓度为800pM)并在聚类化验中分析完成的混合物。作为控制，还分析两种磁性颗粒单独的(没有cTnI)混合物。测量数据(可以与图11和12相比)表明，存在800pM cTnl导致严重聚类，因为cTnl分子可以被两个颗粒同时结合。图15示出了从这些测量获得的相对幅度Irel的时间过程。因为这种化验格式不需要颗粒结合到表面，其中常常有大部分颗粒不能参与形成分子夹层结构，这是效率很高的化验格式。尽管SOOpM仍然是较高浓度，但从图15可以看出，在这一浓度，聚类已经非常严重。在图14中观测到，在小得多程度的聚类下聚类化验已经很敏感，因此预计将能够比这里所示更灵敏地测量。此外，可以进一步优化化验自身(颗粒浓度，单个颗粒上两种抗体，磁性激励方案等)。尽管上文参考特定实施例描述了本发明，但各种修改和扩展是可能的，例如-传感器可以是任何适当的传感器，以基于颗粒的任何性质检测传感器表面上或附近磁性颗粒的存在，例如，它能够通过磁性方法(例如磁阻、霍尔、线圈)、光学方法(例如成像、荧光作用、化学发光、吸收、散射、渐逝场技术、表面等离子体激元谐振、拉曼等)、声学检测(例如表面声波、体声波、悬臂、石英晶体等)、电检测(例如导电、阻抗、电流分析法、氧化还原循环)、其组合等来检测。-除了分子化验之外，还可以利用根据本发明的传感器装置检测更大的一半(moiety)，例如细胞、病毒或细胞或病毒的部分、组织提取液等。-可以在有或没有相对于传感器表面扫描传感器元件的情况下进行检测。-可以将测量数据推导为终点测量，以及通过动态地或间歇地记录信号。-可以由感测方法直接检测充当标签的颗粒。还可以在检测之前进一步处理颗粒。进一步处理的范例是，增加材料或修改标签的(生物)化学或物理性质以便于检测。-可以将该装置和方法用于几种生物化学化验类型，例如结合/释放化验、夹层化验、竞争化验、转移化验、酶催化验等。它尤其适于DNA检测，因为大规模复用容易成为可能，可以通过喷墨印刷找衬底上喷写不同的寡量(oligo)。
-该装置和方法适于传感器复用(即并行使用不同的传感器和传感器表面)、标签复用(即并行使用不同类型的标签)和反应室复用(即并行使用不同的反应室)。-该装置和方法能够用作针对小样本体积的快速、鲁棒和易用的护理点生物传感器。反应室可以是用于紧凑读取器的一次性物品，包含一个或多个场产生模块和一个或多个检测模块。而且，本发明的方法和系统可用于自动化高处理量测试。在这种情况下，反应室例如是井形板或透明小容器，配合到自动化仪器中。-纳米颗粒表示至少一个尺度在3nm和5000nm之间,优选在IOnm和3000nm之间，更优选在50nm和IOOOnm之间的颗粒。最后要指出，在本申请中，术语“包括”不排除其他元件或步骤，“一”或“一个”不 排除多个，并且单个处理器或其他单元可以完成几个模块的功能。本发明体现于每个新颖特征和特征的每种组合。此外，权利要求中的参考符号不应被解释为限制其范围。
权利要求
1.一种用于检测样本室(111, 211，311，411)中的磁性颗粒(MP)的方法，包括 a)确定与第一检测区域(P，C；DR1)中的磁性颗粒(MP)的量相关的颗粒参数(S)； b)确定与第二检测区域(P，C；DR2)中的磁性颗粒(MP)的聚类的程度相关的聚类参数(Irel); C)基于所述聚类参数评估所述颗粒参数。
2.根据权利要求I所述的方法， 其特征在于，如果所述聚类参数(Irel)偏离预定值集合则生成警报信号。
3.根据权利要求I所述的方法， 其特征在于，基于所述聚类参数(Irei)校正所述颗粒参数(S)。
4.一种用于在根据权利要求I所述的方法中应用的设备(100)，包括 a)磁场发生器(140)，其用于在样本室(111)中生成磁场(B)，所述磁场在所述样本室的结合表面(112)的第一场区域(P)和第二场区域(C)中分别相对于所述结合表面(112)具有不同的倾斜； b)传感器元件(121，131)，其用于检测第一和第二场区域(P，C)中的磁性颗粒(MP)； c)评估单元(132)，其用于使所述第一和第二场区域(P，C)的检测信号彼此相关。
5.一种用于在根据权利要求I所述的方法中应用的设备(100)，包括 a)磁场发生器(140)，其用于在样本室(111)中生成磁场(B)，所述磁场在所述样本室(111)的结合表面(112)的第一场区域(P)中倾斜于所述结合表面(112)； b)传感器元件(121，131)，其用于检测所述第一场区域(P)中的磁性颗粒(MP)； c)评估单元(132)，其用于使在永久去激活所述磁场(B)之前和之后获得的检测信号相关。
6.一种用于在根据权利要求I所述的方法中应用的设备(200, 300,400),包括 a)颗粒检测单元(220，320，420)，其用于检测所述第一检测区域(DRl)中的磁性颗粒(MP)； b)聚类检测单元(260，360，460)，其用于检测所述第二检测区域(DR2)中的磁性颗粒(MP)的聚类的程度(Irel)。
7.根据权利要求6所述的设备(200，300，400)， 其特征在于，所述聚类检测单元包括光源(261，361，461)和光检测器(262，362，462)，所述光检测器被布置成测量所述第二检测区域(DR2)中的光透射。
8.根据权利要求7所述的设备(300，400)， 其特征在于，所述聚类检测单元包括至少一个反射和/或折射界面(363)，光在其从所述光源(361，461)到所述光检测器(362，462)的途中遇到所述界面。
9.根据权利要求I所述的方法或根据权利要求4到6中的任一项所述的设备(100，200,300,400), 其特征在于，有磁场发生器(140，141，142 ;241，242 ;341，342 ;441，442)，其用于生成作用于所述磁性颗粒(MP)的磁场(B)。
10.根据权利要求9所述的方法或设备(100，200，300，400)， 其特征在于，所述磁场(B)在所述磁性颗粒(MP)上向着所述样本室(111，211，311，411)的结合表面(112，212，312，412)生成吸引力。
11.根据权利要求9所述的方法或设备(100，200，300,400), 其特征在于，所述磁场(B)被调制，尤其是被反复开关。
12.根据权利要求6和11所述的设备(200，300，400)， 其特征在于，关于所述聚类检测单元(260，360，460)的检测信号的局部相对幅度(Irel)对其进行评估。
13.根据权利要求I所述的方法或根据权利要求4到6中的任一项所述的设备(100，.200.300.400), 其特征在于，所述样本室(111，211，311，411)包括覆盖有针对磁性颗粒(MP )的结合部位的结合表面(112，212，312，412)。
14.根据权利要求I所述的方法或根据权利要求4到6中的任一项所述的设备(100，.200.300.400), 其特征在于，利用光学、磁性、机械、声学、热或电检测流程来检测所述磁性颗粒(MP)。
全文摘要
本发明涉及一种用于检测样本室(111)中的磁性颗粒(MP)的方法和关联设备(100)。该方法包括确定与第一检测区域(P，C)中的磁性颗粒(MP)的量相关的“颗粒参数”，确定与第二检测区域(P，C)中的磁性颗粒(MP)的聚类的程度相关的“聚类参数”，以及基于所述聚类参数评估所述颗粒参数。公开了可以在所述方法中应用的各种设备。在一种设备(100)中，在样本室(111)中生成磁场(B)，使其在第一和第二场区域(P，C)中具有不同的倾斜和/或使其相对于至少一个场区域中的结合表面(112)倾斜。然后在持久关闭倾斜磁场之前和之后检测所述第一和第二场区域中和/或所述至少一个场区域中的磁性颗粒(MP)。所得到的检测信号彼此相关以确定聚类参数。在其他实施例中，可以在施加开关的磁场期间从光透射测量确定聚类参数。
文档编号H01F1/00GK102947900SQ201080067561
公开日2013年2月27日 申请日期2010年11月30日 优先权日2010年6月22日
发明者J·B·A·D·范佐恩, M·M·奥夫扬科, T·H·埃弗斯, M·J·J·希伯尔斯 申请人:皇家飞利浦电子股份有限公司