酸－稳定性蛋白酶在动物饲料中的用途的制作方法

专利名称：：酸－稳定性蛋白酶在动物饲料中的用途的制作方法
技术领域：
：本发明涉及酸-稳定性蛋白酶在动物饲料中的(体内)用途，以及这种蛋白酶处理植物蛋白质的(体外)用途。蛋白质是动物和人必不可少的营养因子。大多数牲畜和很多人从植物蛋白质来源中摄取必需的蛋白质。重要地植物蛋白质来源是例如油料种子作物，豆类和谷类。例如，当在单胃动物，如猪和家禽的饲料中含有豆粉时，大部分豆粉固体不能被消化。例如，小猪和处于生长期的猪的表观回肠蛋白质消化能力仅为80％左右。单胃动物和多种鱼的胃表现出强酸性pH。然而，大多数的蛋白质消化发生在小肠。因此，需要一种在流经胃之后仍能存活的酸-稳定性蛋白酶。
背景技术：
：从下列文献中可以了解蛋白酶在动物饲料中的用途，或其处理植物蛋白质的用途WO95/28850公开了一种含有植酸酶和蛋白酶的动物饲料添加剂。第7页详细说明了多种蛋白酶。WO96/05739公开了含有木聚糖酶和蛋白酶的酶饲料添加剂。第25页列出了适当的蛋白酶。WO95/02044公开了得自棘孢曲霉(Aspergillusaceleatus)的蛋白酶及其在动物饲料中的用途。US3966971公开了通过用酸性植酸酶并任选一种蛋白酶处理，由植物蛋白质来源获取蛋白质的方法。第2栏中详细说明了适当的蛋白酶。US4073884，US5047240，US3868448，US3823072和US3683069描述了得自多个链霉菌属(Streptomyces)菌株的蛋白酶制品及其在动物饲料中的用途。然而，这些蛋白酶不是酸-稳定性的和/或不与本文所述的蛋白酶同源。发明简述本发明鉴定出的蛋白酶具有很好的酸-稳定性，有望在动物饲料中具有改良的性能。附图简述以下将参照附图进一步阐明本发明，其中图1显示了5种蛋白酶(2种得自拟诺卡氏菌属(Nocardiopsis)的酸-稳定性蛋白酶，和3种参照蛋白酶(得自解淀粉芽孢杆菌(Bacillusamyloliquefaciens)〔的Sub.Novo和Sub.Novo(Y217L)，以及SAVINASETM))在温度为37℃，pH值范围为pH2至pH11的条件下保温2小时之后的pH-稳定性曲线，即残留的蛋白酶活性；所述活性是相对于在pH9.0和5℃下保温2小时之后的残留活性而言的；图2显示了相同的5种蛋白酶在pH3至pH11的范围内的pH-活性曲线，即蛋白酶活性，所述活性是相对于最适pH时的蛋白酶活性而言的；和图3显示了相同的5种蛋白酶在15℃至80℃的范围内，pH为9.0时的温度-活性曲线，即pH为9.0时的蛋白酶活性，所述活性是相对于最适温度下的蛋白酶活性而言的。发明详述本文所用术语蛋白酶是水解肽键(具有蛋白酶活性)的酶。蛋白酶也被称为例如肽酶，肽水解酶或蛋白水解酶。本发明优选使用的蛋白酶是在多肽链内部起作用的内在(endo)-型蛋白酶(内肽酶)。内肽酶对N-和C-末端被封闭的肽底物显示出活性，所述肽底物与所述蛋白酶的特异性相关。上述的蛋白酶定义中包括属于EC目录(源自NC-IUBMB的酶名称1992版，1992)EC34酶组(包括其13种亚-亚类的每一种)的任何酶，该目录被定期添加和更新，具体可参见环球网(www)，网址为http∥www.chem.qmw.ac.Luk/iubmb/enzyme/index.html。基于蛋白酶的催化机理将其分为以下几组丝氨酸蛋白酶(S)，半胱氨酸蛋白酶(C)，天冬氨酸蛋白酶(A)，金属蛋白酶(M)和未知的，或未被分类的蛋白酶(U)，参见蛋白酶手册，A.J.Barrett，N.D.Rawlings，J.FWoessner(编)，AcademicPress(1998)，尤其是总引言部分。本文公开的拟诺卡氏菌属蛋白酶是丝氨酸蛋白酶。在特定的实施方案中，本发明所用的蛋白酶是丝氨酸蛋白酶。术语丝氨酸蛋白酶指的是上述手册中定义的丝氨酸肽酶及其异种集团。在1998年版的该手册中，第1-175章涉及丝氨酸肽酶及其异种集团。丝氨酸蛋白酶被定义为肽酶，其催化机理依赖于丝氨酸残基的羟基，所述羟基作为攻击肽键的亲核体起作用。本发明所用丝氨酸蛋白酶的例子是上述手册中定义的SA异种集团的蛋白酶，例如S2家族(streptogrisin)，如S2A亚族(α-裂解蛋白酶)。可使用任何测定法测定蛋白酶活性，所述测定法中利用了底物，底物中包括与所述蛋白酶的特异性相关的肽键。类似地，使pH-试验和温度-试验适应于所述蛋白酶。pH值-试验的例子是pH5，6，7，8，9，10或11。温度-试验的例子是25，30，35，37，40，45，50，55，60，65或70℃。蛋白酶底物的例子是酪蛋白和pNA-底物，如Suc-AAPF-pNA(可得自例如SigmaS-7388)。该pNA-底物中的大写字母指的是单字母氨基酸密码。另一个例子是ProtazymeAK(由MegazymeT-PRAK制备成片剂的经天青精(azurine)染色的交联酪蛋白)。pH-活性和pH-稳定性研究优选pNA-底物，而温度-活性研究优选ProtazymeAK底物。实验部分描述了蛋白酶检测法的例子。对本发明所用蛋白酶的来源没有限制。因此，术语蛋白酶不仅包括天然或野生型蛋白酶，也包括其表现出蛋白酶活性的任何突变体，变体，片段等，以及合成的蛋白酶，如经改组的蛋白酶和共有蛋白酶。可以按照本领域公知的技术，例如通过定点诱变，PCR(使用含有所需突变的PCR片段作为PCR反应中的一个引物)，或随机诱变制备经基因工程改造的蛋白酶。共有蛋白质的制备描述于例如EP897985。本发明所用酸-稳定性蛋白酶的例子是(i)得自拟诺卡氏菌属菌种NRRL18262和Nocardiopsisalba的蛋白酶；(ii)与(i)中的任何蛋白酶具有至少60，65，70，75，80，85，90或至少95％的氨基酸同一性的蛋白酶；(iii)与SEQIDNO1和/或SEQIDNO2中的任何一个具有至少60，65，70，75，80，85，90或至少95％的同一性的蛋白酶。为了计算同一性百分比，可以使用本领域已知的任何计算机程序。所述计算机程序的例子有ClustalV算法(Higgins，D.G和Sharp，P.M.(1989)，Gene(Amsterdam)，73，237-244)；和GCG第8版程序包中提供的GAP程序(ProgramManualfortheWisconsinPackage，Version8，GeneticsComputerGroup，575ScienceDrive，Madison，Wisconsin，USA53711)(Needleman，S.B和Wumsch，C.D.，(1970)，JoumalofMolecularBiology，48，443-453)。当使用ClustalV算法计算两个蛋白质序列之间的同一性百分比时，使用PAM250残基量(weight)表以及Lasergene软件包(DNASTARInc.，1228SouthParkStreet，Madison，Wisconsin53715，US)中的MegAlign程序，4.03版的缺省设置。多重序列比对的缺省设置为缺口罚分为10，缺口长度罚分为10。为了计算两个蛋白质序列之间的同一性百分比，使用下列设置ktuple为1，缺口罚分为3，窗口为5，保存5个对角线。当使用GAP时，使用下列设置进行多肽序列比较GAP生成罚分为5.0，GAP延伸罚分为0.3。在特定的实施方案中，本发明所用的蛋白酶是微生物蛋白酶，术语微生物表示蛋白酶得自，或源自微生物，或是得自微生物的蛋白酶类似物，片段，变体，突变体，或合成的蛋白酶。可在原始的野生型微生物菌株，在另一个微生物菌株或在植物中产生或表达所述蛋白酶，即该术语覆盖了表达野生型，天然蛋白酶，以及在任何宿主中表达重组的，经基因工程改造的或合成的蛋白酶。本文所用术语微生物包括古细菌，细菌，真菌，病毒等。微生物的例子是细菌，例如放线细菌门新门的细菌，例如I纲Actinobacteria，V亚纲Actinobacteridae，I目Actinomycetales，XII亚目Streptosporangineae，II科Nocardiopsaceae，I属拟诺卡氏菌属的细菌，如拟诺卡氏菌属菌种NRRL18262和Nocardiopsisalba；或其表现出蛋白酶活性的突变体或变体。此分类学的基础是伯捷氏系统细菌学手册，第2版，2000年，Springer(预印RoadMaptoBergey′s)。微生物的其它例子是真菌，如酵母或丝状真菌。在另一个实施方案中，蛋白酶是植物蛋白酶。源自植物的蛋白酶的例子是得自瓜果果肉的蛋白酶(Kaneda等，J.Biochem，78，1287-1296(1975))。术语动物包括所有动物，包括人。动物的例子有非-反刍动物和反刍动物，如奶牛，绵羊和马。在特定的实施方案中，动物是非-反刍动物。非-反刍动物包括单胃动物，如猪(包括但不限于小猪，处于生长期的猪和大母猪)；家禽，如火鸡和鸡(包括但不限于适于烤焙的小鸡，蛋鸡)；小牛；和鱼(包括但不限于鲑鱼)。术语饲料或饲料组合物指的是适于或给动物摄入的任何化合物，制剂，混合物或组合物。在本发明的应用中，可在喂食之前，之后或同时给动物饲喂蛋白酶。优选在喂食之后饲喂蛋白酶。在本发明的上下文中，术语酸-稳定性指的是于37℃，在下列缓冲液100mM琥珀酸，100mMHEPES，100mMCHES，100mMCABS，1mMCaCl2，150mMKCl，0.01％Triton_X-100，pH3.5中保温2小时之后，稀释度相当于A280＝1.0的纯蛋白酶的蛋白酶活性至少为参照活性的40％，所述活性是使用本文实施例2C中所述的检测法测定的(底物Suc-AAPF-pNA，pH9.0，25℃)。在上述酸-稳定性定义的特定实施方案中，蛋白酶活性至少为参照活性的45，50，55，60，65，70，75，80，85，90，95或至少为参照活性的97％。术语参照活性指的是稀释度相当于A280＝1.0的纯品形式的相同蛋白酶于5℃，在下列缓冲液100mM琥珀酸，100mMHEPES，100mMCHES，100mMCABS，1mMCaCl2，150mMKCl，0.01％Triton_X-100，pH9.0中保温2小时之后的蛋白酶活性，其中按上文所述测定活性。换句话说，测定酸-稳定性的方法包括下列步骤a)将待测的蛋白酶样品(纯品形式，A280＝1.0)分成两等份(I和II)；b)于37℃，pH3.5将等份I保温2小时；c)测定等份I的残留活性(pH9.0和25℃)；d)于5℃，pH9.0将等份II保温2小时；e)测定等份II的残留活性(pH9.0和25℃)；f)计算相对于等份II之残留活性的等份I残留活性的百分比。或者，在上述酸-稳定性定义中，步骤b)缓冲液的pH值可以是1.0，1.5，2.0，2.5，3.0，3.1，3.2，3.3或3.4。在与上述可替换的步骤b)缓冲液的pH值相关的上述酸-稳定性定义的其它可替换的实施方案中，与参照活性相比，残留的蛋白酶活性至少为5，10，15，20，25，30，35，40，45，50，55，60，65，70，75，80，85，90，95或至少为97％。在其它实施方案中，步骤d)缓冲液的pH值可以是6.0，6.5，7.0，7.5，8.0或8.5。在上述酸-稳定性定义中，术语A280＝1.0指的是在光程长度为1cm的样品池中，280nm下相对于缓冲液空白对照的光吸收值为1.0时的所述纯蛋白酶浓度(稀释度)。在上述酸-稳定性定义中，术语纯蛋白酶指的是A280/A260的比率大于或等于1.70(见实施例2E)，且通过扫描经考马斯-染色的SDS-PAGE凝胶测得其扫描强度至少约为对应于所述蛋白酶之带的扫描强度的95％(见实施例2A)的样品。或者，A280/A260的比率大于或等于1.50，1.60，1.65，1.70，1.75，1.80，1.85，或大于或等于1.90。然而，对于本发明的应用而言，蛋白酶不必是纯的；它可以例如包括其它酶，甚至其它蛋白酶，此时可将其称为蛋白酶制品。然而，明确定义的蛋白酶制品是有利的。例如，正确确定饲料中的蛋白酶剂量则要容易得多，所述蛋白酶基本上不含干扰的或污染的其它蛋白酶。术语正确确定剂量特指获得持久不变的结果的目的，和基于所需结果最优化剂量的能力。在特定的实施方案中，明确定义了添加至饲料中的，或包含在饲料添加剂中的蛋白酶。明确定义指的是经大小排阻层析测定，蛋白酶制品至少为50％纯(见实施例8)。在其它特定的实施方案中，经此方法测定，蛋白酶制品至少为60，70，80，85，88，90，92，94纯或至少为95％纯。在其它实施方案中，术语明确定义指的是蛋白酶制品在适当大小排阻柱上的分级分离仅显示出一个主要的蛋白酶成分。本领域技术人员会知道如何选择适当的大小排阻层析柱。起初可以在例如AmershamPharmaciaBiotech的Hiload26/60Superdex75pg柱上分级分离蛋白酶制品(见实施例8)。如果不能清楚地分开峰，可以尝试不同的柱(例如改变柱颗粒的大小和/或柱的长度)，和/或改变样品的体积。通过简单而常用的尝试法，可以选择出具有足够分辨率(能清楚地分开峰)的柱，以此为基础，按实施例8所述进行纯度的计算。蛋白酶制品可以(a)直接加入饲料中(或直接用于植物蛋白质的处理方法)，或(b)用于生产一种或多种随后要添加至饲料中(或用于处理方法)的中间体组合物，如饲料添加剂或预混物。上文所述的纯度指的是上述(a)或(b)用途中的原始蛋白酶制品的纯度。使用重组生产方法可以特别地获得纯度为此数量级的蛋白酶制品，而当通过传统的发酵法生产蛋白酶时，获得它们却并非易事，而且批与批之间的变化较大。当然可以将这种蛋白酶制品与其它酶混合。在一个特定的实施方案中，本发明所用的蛋白酶除了具有酸-稳定性外，还具有接近中性的pH-活性最适值。术语接近中性的pH-活性最适值指的是下列一个或多个pH-最适值范围为pH6.0-11.0，或pH7.0-11.0，或pH6.0-10.0，或pH7.0-10.0，或pH8.0-11.0，或pH8.0-10.0(参见本文实施例2B和图2)。在另一个特定实施方案中，本发明所用的蛋白酶除了具有酸-稳定性外，还具有热稳定性。术语热稳定性指的是下列一个或多个温度最适值至少为50℃，52℃，54℃，56℃，58℃，60℃，62℃，64℃，66℃，68℃，或至少为70℃，参见本文实施例2D和图3。在另一个特定的实施方案中，根据本文实施例4的体外模型，本发明所用的蛋白酶能溶解植物蛋白质。本文所用术语植物蛋白质指的是包括至少一种得自或源自植物的蛋白质，包括经修饰的蛋白质和蛋白质衍生物的任何化合物，组合物，制品或混合物。在特定的实施方案中，植物蛋白质的蛋白质含量至少为10，20，30，40，50或60％(w/w)。植物蛋白质可得自植物蛋白质来源，例如豆类和谷类，例如豆科(Fabaceae)，十字花科(Cruciferaleae)，藜科(Chenopodiaceae)，禾本科(Poaceae)的植物材料，如大豆粉，羽扇豆粉和油菜籽粉。在特定的实施方案中，植物蛋白质来源是豆科的一种或多种植物，如大豆，羽扇豆，豌豆或蚕豆的材料。在另一个特定的实施方案中，植物蛋白质来源是藜科的一种或多种植物，如甜菜，糖用甜菜，菠菜或奎奴亚藜的材料。植物蛋白质来源的其它例子是油菜籽和甘蓝。大豆是优选的植物蛋白质来源。植物蛋白质来源的其它例子是谷类植物，如大麦，小麦，黑麦，燕麦，玉米，水稻和高粱。根据本发明，用至少一种酸-稳定性蛋白酶处理植物蛋白质导致植物蛋白质的溶解性增加。以下是使用本发明的蛋白酶可以获得的溶解蛋白质的百分比至少为74.0％，74.5％，75.0％，75.5％，76.0％，76.5％，77.0％或至少为77.5％，参见本文实施例4的体外模型。术语溶解蛋白质基本上指将蛋白质释放至溶液中。这种溶解可能是在蛋白酶的介导下，从通常为复合的天然组合物，如饲料的其它成分中释放出蛋白质而引起的。溶解可被测定为相对于未经蛋白酶处理的样品而言，可溶性蛋白质量的增加(参见本文实施例4)。在处理方法的特定实施方案中，所述蛋白酶影响，或作用于植物蛋白质或蛋白质来源，或对它们发挥其溶解作用。为此，一般将植物蛋白质或蛋白质来源悬浮于溶剂，如含水溶剂，如水中，并根据所述酶的特征调节pH和温度值。例如，可在使实际蛋白酶的相对活性至少为50，或60，或70，或80或90％的pH值下进行处理。类似地，例如，可在使实际蛋白酶的相对活性至少为50，或60，或70，或80或90％(本文实施例2中定义了这些相对活性)的温度下进行处理。继续进行酶反应，直至获得所需结果，然后，通过例如经热-处理步骤灭活酶，终止或不终止酶反应。在本发明处理方法的另一个特定实施方案中，蛋白酶的作用是持久的，这意味着例如蛋白酶被加入到植物蛋白质或蛋白质来源中，但其溶解作用可以说并未启动，直至后来在需要时，一旦建立适当的溶解条件，或一旦灭活任何酶抑制剂，或使用任何其它方法延迟酶的作用时才被启动。在一个实施方案中，处理是对动物饲料或动物饲料中所用的植物蛋白质进行预处理，即在摄入前溶解蛋白质。术语改善动物饲料的营养价值指的是改善蛋白质的可利用性，导致蛋白质提取物增加，蛋白质产量提高，和/或蛋白质的利用情况有所改善。因此增加饲料的营养价值，改善动物的生长速率和/或体重的增加和/或饲料的转化(即相对于增加的体重而言所摄取饲料的重量)。可以任何形式在饲料中加入蛋白酶，所述蛋白酶是相对较纯的蛋白酶，或者与欲添加至动物饲料中的其它成分相混合，即为动物饲料添加剂的形式，如所谓的动物饲料预混物。动物饲料添加剂除了酸-稳定性蛋白酶外，本发明的动物饲料添加剂还含有至少一种脂溶性维生素，和/或至少一种水溶性维生素，和/或至少一种痕量矿物质，和/或至少一种宏量矿物质。另外，任选的饲料-添加剂成分有生色剂，芳香化合物，稳定剂和/或至少一种选自下列的其它酶植酸酶EC3.1.3.8或3.1.3.26；木聚糖酶EC3.2.1.8；半乳聚糖酶EC3.2.1.89；和/或β-葡聚糖酶EC3.2.1.4(EC指的是源自NC-IUBMB的酶名称1992版，1992)，也可参见环球网(www)，网址为http∥www.chem.qmw.ac.uk/iubmb/enzyme/index.html。在特定的实施方案中，明确限定了这些其它酶(如同上文对蛋白酶制品所作的限定和举例那样，参见实施例8)。通常，脂溶性和水溶性维生素以及痕量矿物质形成所谓的欲添加至饲料中的预混物的一部分，而宏量矿物质通常被单独加入到饲料中。当加入本发明的酸-稳定性蛋白酶时，这些组合物类型中的任一种都是本发明的动物饲料添加剂。在特定的实施方案中，动物的食物或饲料中欲包含(或按规定必须包含)本发明的动物饲料添加剂，所述添加剂的水平为0.01-10.0％；更特别地为0.05-5.0％；或0.2-1.0％(％指的是每100克饲料中添加剂的克数)。预混物中更是如此。因此，通过将相同成分在饲料中的终浓度分别乘以10-10000；20-2000；或100-500(指的是上述3个百分比包含的区间)，即可得出动物饲料添加剂，如预混物中各个成分的浓度。下表A中显示了各个饲料成分和饲料添加剂成分合乎需要的终浓度，即在饲料中的浓度。以下是这些成分实例非-排他性的列表脂溶性维生素的例子有维生素A，维生素D3，维生素E和维生素K，例如维生素K3。水溶性维生素的例子有维生素B12，生物素和胆碱，维生素B1，维生素B2，维生素B6，烟酸，叶酸和泛酸盐，如D-泛酸钙。痕量矿物质的例子有锰，锌，铁，铜，碘，硒和钴。宏量矿物质的例子有钙，磷和钠。下表A中列出了对这些成分的营养需求-以家禽和小猪/猪举例。营养需求指的是应该在食物中提供所示浓度的这些成分。这些数据汇编自NRC，猪的营养需求，第9次修订版，1988，国立研究委员会农业部动物营养学委员会猪营养学小组委员会。NationalAcademyPress，Washington，D.C.1988；和NRC，家禽的营养需求，第9次修订版，1994，国立研究委员会农业部动物营养学委员会家禽营养学小组委员会。NationalAcademyPress，Washington，D.C.1994。在可替换的实施方案中，本发明的动物饲料添加剂含有至少一种表A中特指的单个成分。至少一种指的是一种，或两种，或三种，或四种，依此类推直至所有13种，或所有15种单个成分中的一种或多种。更具体地，在本发明的添加剂中包含至少一种单个成分，所述成分的量能使其在饲料中的浓度处于表A第4栏，或第5栏，或第6栏所示的范围之内。如上文所解释的，通过将这些范围的区限乘以10-10000；20-2000；或100-500，即可得出相应的饲料添加剂的浓度。例如，考虑到维生素A的预混含量对应于10-10000IU/kg的饲料-含量，此运算会产生下列区间100-108IU；或200-2×107IU；或1000-5×106IU/kg添加剂。表A营养需求-和优选范围动物饲料组合物动物饲料组合物或食物具有相对较高的蛋白质含量。根据上文所述的国立研究委员会(NRC)出版物，家禽和猪的食物具有下表B第2-3栏所示的特征。鱼食具有表B第4栏所示的特征。另外，这种鱼食通常具有的粗脂肪含量为200-310g/kg。以鲑鱼食举例说明这些鱼食，所述鱼食是在Aquaculture，principlesandpractices，T.VR.Pillay编，BlackwellScientificPublicationsLtd.1990；Fishnutrition，第2版，JohnE.Halver编，AcademicPressInc.1989的基础上设计的。本发明的动物饲料组合物的粗蛋白含量为50-800g/kg，另外还含有至少一种本文所要求的蛋白酶。另外，或者在(上述粗蛋白含量的)替代实施方案中，本发明动物饲料组合物所具有的可代谢能量的含量为10-30MJ/kg；和/或钙含量为0.1-200g/kg；和/或可利用的磷的含量为0.1-200g/kg；和/或甲硫氨酸的含量为0.1-100g/kg；和/或甲硫氨酸加半胱氨酸的含量为0.1-150g/kg；和/或赖氨酸的含量为0.5-50g/kg。在特定的实施方案中，可代谢能量，粗蛋白，钙，磷，甲硫氨酸，甲硫氨酸加半胱氨酸，和/或赖氨酸的含量在下表B的范围2，3，4或5(R.2-5)的任一个之内。如AnimalNutrition，第4版，第13章(P.McDonald，R.A.Edwards和J.F.D.Greenhalgh编，LongmanScientificandTechnical，1988，ISBN0-582-40903-9)所述，粗蛋白被计算为氮(N)乘以系数6.25，即粗蛋白(g/kg)＝N(g/kg)×6.25。通过Kjeldahl法(A.O.A.C.，1984，OfficialMethodsofAnalysis14thed.，AssociationofOfficialAnalyticalChemists，WashingtonDC)测定氮含量。可在NRC出版物NutrientRequirementsofSwine(1988)pp.2-6和EuropeanTableofEnergyValuesforPoultryFeed-stuffs，Spelderholtcentreforpoultryresearchandextension，7361DABeekbergen，TheNetherlands.GrafischbedrijfPonsen&looijenbv，Wageningen.ISBN90-71463-12-5的基础上计算出可代谢的能量。可在饲料表的基础上计算出全部的动物食物中钙，可利用的磷和氨基酸的食物含量，所述饲料表如Veevoedertable1997，gegevensoverchemischesamenstelling，verteerbaarheidenvoederwaardevanvoedermiddelen，CentralVeevoederbureau，Runderweg6，8219pkLelystad.ISBN90-72839-13-7。在特定的实施方案中，本发明的动物饲料组合物含有至少一种如上文所定义的植物蛋白质或蛋白质来源。在另一个特定的实施方案中，本发明的动物饲料组合物含有0-80％玉米；和/或0-80％高粱；和/或0-70％小麦；和/或0-70％大麦；和/或0-30％燕麦；和/或0-40％豆粉；和/或0-10％鱼粉；和/或0-20％乳清。例如，可将动物食物制备成捣碎的饲料(非-粒状)或粒状饲料。一般将磨碎的饲料相混合，再根据所需类别的详细说明添加足够量的必需维生素和矿物质。加入固体或液体酶制剂。例如，一般在混合步骤之前或之中加入固体酶制剂；一般在成粒步骤之后加入液体酶制品。也可以将酶掺入饲料添加剂或预混物中。食物中最终的酶浓度范围为0.01-200mg酶蛋白质/kg食物，例如5-30mg酶蛋白质/kg动物食物。实施例7中显示了动物饲料组合物的例子。表B动物食物中能量，蛋白质和矿物质的数值范围在本发明处理植物蛋白质的方法的特定实施方案中，还包括另一个步骤，即加入植酸酶。在另一个特定的实施方案中，除了联合使用植酸酶和蛋白酶进行处理以外，也可以加入其它酶，其中这些酶选自含有其它蛋白酶，植酸酶，脂解酶和葡糖苷酶/糖酶的组。WO95/28850中描述了这些酶的例子。当然，应该使用有效量的蛋白酶，即所述量足以改善饲料的溶解性和/或改善饲料的营养价值。目前，希望以下列的一种或多种量(剂量范围)使用酶0.01-200；或0.01-100；或0.05-100；或0.05-50；或0.10-10，所有这些范围皆为每kg饲料中蛋白酶的mg数(ppm)。为了测定每kg饲料中蛋白酶的mg数，从饲料组合物中纯化出蛋白酶，使用相关测定法(参见蛋白酶活性，底物和测定法一节)测定纯化蛋白酶的比活。也使用相同的测定法测定所述饲料组合物的蛋白酶活性，在这两个测定结果的基础上，计算出以每kg饲料中所含蛋白酶的mg数计的剂量。使用相同的原理测定饲料添加剂中蛋白酶的mg数。当然，如果可获得制备饲料添加剂或饲料所用的蛋白酶样品，可测定该样品的比活(而不必从饲料组合物或添加剂中纯化蛋白酶)。很多植物含有抗-营养因子，如凝集素和胰蛋白酶抑制剂。最重要的大豆抗-营养因子是凝集素大豆凝集素(SBA)和大豆胰蛋白酶抑制剂(STI)。凝集素是以相当强的特异性与特定的含糖分子结合的蛋白质，当其被消化时，可与小肠上皮结合。这可能导致上皮细胞的存活力下降，从而使营养物质的吸收减少。SBA是糖基化的四聚体凝集素，其亚单位的分子量约为30kDa，并对N-乙酰半乳糖胺具有高亲和力。胰蛋白酶抑制剂影响小肠蛋白酶解，降低其消化蛋白质的能力，也会使胰腺分泌的消化酶增加，导致以消化酶的形式损失氨基酸。胰蛋白酶抑制剂的例子有Bowman-Birk抑制剂，其分子量约为8kDa，含有7个二硫键，并具有两个特异于胰蛋白酶-样和胰凝乳蛋白酶-样蛋白酶的抑制性环。其它例子有所谓Kunitz抑制剂因子(例如大豆Kunitz胰蛋白酶抑制剂，其含有一个胰蛋白酶-样蛋白酶的结合位点，分子量约为20kDa)。已证实本发明所用的蛋白酶可以水解抗-营养因子，如SBA凝集素，胰蛋白酶抑制剂BowmanBirk抑制剂和大豆Kunitz因子。参见实施例5的实验部分。因此，本发明还涉及酸-稳定性蛋白酶水解，或减少抗-营养因子的量的用途，所述抗-营养因子如SBA凝集素和胰蛋白酶抑制剂，如BowmanBirk抑制剂和Kumitz因子，如大豆Kunitz因子。实施例1筛选酸-稳定性蛋白酶分析多种蛋白酶在pH3时的稳定性，目的是鉴定出具有必要的稳定性，从而能流经单胃动物酸性胃的蛋白酶。通过常规的层析法，如离子交换层析，疏水作用层析和大小排阻层析(参见例如ProteinPurification，Principles，HighResolutionMethods，andApplications，Jan-ChristerJanson，LarsRyden编，VCHPublishers，1989)纯化蛋白酶。按下述测定蛋白酶活性于25℃，pH9.5中将蛋白酶与1.67％Hammarsten酪蛋白保温30分钟，然后加入TCA(三氯醋酸)至终浓度为2％(w/w)，过滤混合物以除去沉淀物，分析滤液的游离一级氨基(在基于OPA(邻苯二醛)的比色试验中，通过使用丝氨酸标准品，测定340nm处的光吸收值来进行检测(BiochemischeTaschenbuchteiilII，Springer-Verlag(1964)，p.93和p.102))。一个酪蛋白蛋白酶单位(CPU)被定义为在标准条件下，即25℃和pH9.5，每分钟释放1mmolTCA-可溶性一级氨基所需酶的量。用水将蛋白酶稀释至活性为0.6CPU/l，分成两等份，然后分别用100mM柠檬酸盐缓冲液，pH3和100mM磷酸盐缓冲液，pH7将每等份进一步稀释至0.3CPU/l。将稀释的样品置于37℃保温1小时，将20μl样品上样于含有1％脱脂奶的1％琼脂糖平板的孔中。37℃保温平板(pH7.0)过夜，测量清亮的区域。在此试验中，多种蛋白酶表现较好，目前已鉴定出下列两种蛋白酶实施例2中描述的Nocardiopsisalba和拟诺卡氏菌属菌种NRRL18262的蛋白酶。根据有关用于专利程序的微生物保藏的国际认可的布达佩斯条约，按下述将Nocardiopsisalba菌株保藏于德国的DSMZ-DeutscheSammlungvonMikroorganismenundZellkulturenGmbH，MascheroderWeglb，D-38124BraunSchweig保藏日2001年1月22日保藏号NocardiopsisalbaDSM14010由NovozymesA/S进行保藏，后来转让给了Hoffmann-LaRocheAG。实施例2拟诺卡氏菌属蛋白酶的制备，鉴定和比较研究发酵从胰蛋白胨酵母琼脂平板中将Nocardiopsisalba接种于烧瓶中，所述烧瓶各含有100ml具有下列组成的HG-23培养基燕麦粉45g/l，酵母提取物2g/l，磷酸氢二钠12g/l，磷酸二氢钾6g/l，PluronicPE61000.2ml/l，溶于蒸馏水。37℃发酵该菌株9天。纯化在1升烧杯中，以10000×g将培养液离心30分钟。混合上清液，通过流经SeitzK-250纵深滤板(depthfilterplate)进行过滤以进一步澄清上清液。通过在截留分子量为3kDa的聚醚砜盒(Filtron)上进行超滤以浓缩已澄清的滤液。将浓缩的酶转移至G25Sephadex柱(AmershamPharmaciaBiotech)上的50mMH3BO3，5mM3，3′-二甲基戊二酸，1mMCaCl2，pH7(缓冲液A)中，并上样于已用缓冲液A平衡的Bacitracin琼脂糖柱(UpfrontChromatographyA/S)。用缓冲液A清洗Bacitracin柱以除去未结合的蛋白质，然后使用添加有25％2-丙醇和1M氯化钠的缓冲液A从柱上洗脱蛋白酶。集中具有蛋白酶活性的级分，通过在G25Sephadex柱(AmershamPharmaciaBiotech)上层析，将级分转移至20mMCH3COOH/NaOH，1mMCaCl2，pH4.5(缓冲液B)中。将缓冲液交换的蛋白酶收集物上样于已用缓冲液B平衡的SOURCE30S柱(AmershamPharmaciaBiotech)。用缓冲液B清洗SOURCE30S柱，然后用缓冲液B中线性递增的NaCl梯度(0至0.25M)洗脱蛋白酶。检测柱级分的蛋白酶活性，通过SDS-PAGE分析含蛋白酶的级分。集中纯的级分，用于进一步鉴定。按上文针对拟诺卡氏菌属蛋白酶的一般性描述，使用常规方法制备拟诺卡氏菌属菌种NRRL18262的蛋白酶。鉴定已发现得自Nocardiopsisalba的蛋白酶的分子量为Mr＝21kDa(SDS-PAGE)，并测出下列部分(N-末端(MVS))氨基酸序列ADIIGGLAYTMGGRCSV(SEQIDNO2)。得自拟诺卡氏菌属菌种NRRL18262的蛋白酶具有以下188个氨基酸的序列ADIIGGLAYTMGGRCSVGFAATNAAGQPGFVTAGHCGRVGTQVTIGNGRGVFEQSVFPGNDAAFVRGTSNFTLTNLVSRYNTGGYAAVAGHNQAPIGSSVCRSGSTTGWHCGTIQARGQSVSYPEGTVTNMTRTTVCAEPGDSGGSYISGTQAQGVTSGGSGNCRTGGTTFYQEVTPMVNSWGVRLRT(SEQIDNO1)。鉴定的目的是研究它们相对于Sub.Novo，Sub.Novo(Y217L)和SAVINASETM而言的pH-稳定性，pH-活性和温度-活性分布图。Sub.Novo是得自解淀粉芽孢杆菌的枯草蛋白酶，而Sub.Novo(Y217L)是其突变体，该突变体公开于WO96/05739中。使用常规方法从野生型菌株的培养物中制备和纯化Sub.Novo，并按照EP130756的实施例1-2和15-16所述制备突变体。SAVINASETM是得自克劳氏芽孢杆菌(Bacillusclausii)(以前是迟缓芽孢杆菌(Bacilluslentus)NCIB10309)的枯草蛋白酶，可购自丹麦，NovozymesA/S，Krogshoejvej，DK-2880Bagsvaerd。美国专利号3723250中描述了它的制备。实施例2A测定蛋白酶样品的SDS-PAGE纯度通过下列方法测定蛋白酶样品的SDS-PAGE纯度在置于冰上的Eppendorf管中混合40μl蛋白酶溶液(A280浓度＝0.025)与10μl50％(w/v)TCA(三氯醋酸)。在冰上放置半小时之后，离心Eppendorf管(5分钟，0℃，14,000×g)，小心取出上清液。在沉淀中加入20μlSDS-PAGE样品缓冲液(200μlTris-甘氨酸SDS样品缓冲液(2×)(125mMTris/HCl，pH6.8，4％(w/v)SDS，50ppm溴酚蓝，20％(v/v)甘油，得自NOVEXTM的LC2676)+160μl蒸馏水+20μlβ-巯基乙醇+20μl3M未缓冲的TrisBase(SigmaT-1503))，将管煮沸3分钟。短暂离心Eppendorf管，将10μl样品上样于得自NOVEXTM的4-20％梯度Tris-甘氨酸预制凝胶(基于Laemmli化学的聚丙烯酰胺梯度凝胶，但凝胶中不含SDS(Laemmli，U.K.，(1970)自然，vol.227，pp.680-685)，EC60255)。在两种缓冲液的槽中，用Tris-甘氨酸电泳缓冲液(2.9gTrisBase，14.4g甘氨酸，1.0gSDS，加蒸馏水至1升)，以150V的恒定电压进行电泳，直至溴酚蓝示踪染料到达凝胶的底部。电泳之后，通过缓慢振荡，用100ml蒸馏水将凝胶浸洗3次，每次5分钟。然后用Gelcode_BlueStainReagent(得自PIERCE的胶状ComassieG-250产品，PIERCE目录号为24592)缓慢振荡凝胶1小时，再用蒸馏水缓慢振荡清洗8至16小时，其间更换几次蒸馏水。最后，在两片玻璃纸之间干燥凝胶。用装配有Fotolook95v2.08软件，得自AGFA的ArcusII扫描仪扫描干燥的凝胶，并通过具有下列(Fotolook95v2.08)设置的File/Acquire命令，将扫描图像引入Windows介面下的图像评价软件CREAMTM(目录号990001和990005，Kem-En-Tec，丹麦)Original＝Reflective，Mode＝ColorRGB，Scanresolution＝240ppi，Outputresolution＝1201pi，Scalefactor＝100％，Range＝HistogramwithGlobalselection和Min＝0和Max＝215，ToneCurve＝None，Sharpness＝None，Descreen＝None和Flavor＝None，从而产生SDS-PAGE凝胶的*.img图形文件，用于在CREAMTM中进行评价。用菜单命令Analysis/l-D评价*.img图形文件。用LanePlaceTool将两条扫描线置于*.img图形文件上一条为样品扫描线，一条为背景扫描线。将样品扫描线置于自上样狭槽最下方至溴酚蓝示踪染料位置最上方的样品泳道(含所述蛋白酶)的中间。将背景扫描线置于与样品扫描线平行的位置，但此位置是图形化的SDS-PAGE凝胶上没有上样样品的位置，背景扫描线的起点和终点垂直于样品扫描线的起点和终点。背景扫描线代表真实的凝胶背景。扫描线的宽度和外形未经调节。用具有中度敏感性的l-D/Scan菜单命令纪录沿着扫描线的强度。使用l-D/Editor菜单命令，从样品扫描中扣除背景扫描。然后选择l-D/Results菜单命令，将通过CREAMTM软件计算出的蛋白酶峰面积的百分比用作蛋白酶的SDS-PAGE纯度。所有蛋白酶样品都具有大于95％的SDS-PAGE纯度。实施例2BpH-活性试验使用Suc-AAPF-pNA(Sigma_S-7388)获得pH-活性分布图。试验缓冲液100mM琥珀酸(Merck1.00682)，100mMHEPES(SigmaH-3375)，100mMCHES(SigmaC-2885)，100mMCABS(C-5580)，1mMCaCl2，150mMKCl，0.01％Triton_X-100，用HCl或NaOH调节至pH值为3.0，4.0，5.0，6.0，7.0，8.0，9.0，10.0或11.0。试验温度25℃。在各个pH值下，将300μl蛋白酶样品(用0.01％Triton_X-100稀释)与1.5ml试验缓冲液混合，使混合物的pH达到试验缓冲液的pH。通过加入1.5mlpNA底物(50mg溶解于1.0mlDMSO中，再用0.01％Triton_X-100稀释45倍)以开始反应，混合之后，用分光光度计监测A450的增加，作为在所述pH下蛋白酶活性的测量结果。用其它pH值的试验缓冲液重复进行试验，将活性的测量结果作图为针对pH的相对活性。用最高活性(pH-最适值)使相对活性归一化，即将pH-最适值下的活性设置为1，或100％。稀释蛋白酶样品以确保所有的活性测量结果都能落入该试验的剂量-反应曲线的线性部分。实施例2CpH-稳定性试验使用Suc-AAPF-pNA(Sigma_S-7388)获得pH-稳定性分布图。试验缓冲液100mM琥珀酸，100mMHEPES，100mMCHES，100mMCABS，1mMCaCl2，150mMKCl，0.01％Triton_X-100，用HCl或NaOH调节至pH值为2.0，2.5，3.0，3.5，4.0，4.5，5.0，6.0，7.0，8.0，9.0，10.0或11.0。用各个受试pH值下的试验缓冲液稀释各个蛋白酶样品(溶于1mM琥珀酸，2mMCaCl2，100mMNaCl，pH6.0，A280光吸收值＞10)至A280＝1.0。于37℃将经稀释的蛋白酶样品保温2小时。保温之后，用100mM琥珀酸，100mMHEPES，100mMCHES，100mMCABS，1mMCaCl2，150mMKCl，0.01％Triton_X-100，pH9.0稀释蛋白酶样品，使所有样品的pH为pH9.0。在以下的活性测定中，温度为25℃。将300μl经稀释的蛋白酶样品与1.5mlpH9.0试验缓冲液混合。通过加入1.5mlpNA底物(50mg溶解于1.0mlDMSO中，再用0.01％Triton_X-100稀释45倍)以开始活性反应，混合之后，用分光光度计监测A450的增加，作为(残留)蛋白酶活性的测量结果。在不同pH-值下进行37℃保温，将活性的测量结果作图为针对pH的残留活性。用平行保温的活性(对照)使残留活性归一化，其中在测定活性之前用pH9.0的试验缓冲液将蛋白酶稀释至A280＝1.0，5℃保温2小时以作为其它的保温。在测定活性之前稀释蛋白酶样品，以确保所有的活性测量结果都能落入该试验的剂量-反应曲线的线性部分。实施例2D温度-活性试验使用ProtazymeAK片剂获得温度分布图。ProtazymeAK片剂是由Megazyme制备成片剂的经天青精染色的交联酪蛋白。试验缓冲液100mM琥珀酸，100mMHEPES，100mMCHES，100mMCABS，1mMCaCl2，150mMKCl，0.01％Triton_X-100，用NaOH调节至pH值为9.0。通过缓慢搅拌将ProtazymeAK片剂悬浮于2.0ml0.01％Triton_X-100。在Eppendorf管中混合500μl该悬浮液和500μl试验缓冲液，将管置于冰上。加入20μl蛋白酶样品(用0.01％Triton_X-100稀释)。通过将Eppendorf管转移至设置为检测温度的Eppendorf热混合仪来启动试验。在处于最高振荡速率的Eppendorf热混合仪上将管保温15分钟。通过将管移回冰浴以终止试验性保温。在冰冷的离心机中将管离心几分钟，用分光光度计读出上清液的A650。在此试验中包括空白缓冲液(替代酶)。A650(蛋白酶)-A650(空白)为蛋白酶活性的测量结果。在不同温度下进行试验，将活性的测量结果作图为针对保温温度的相对活性。用最高活性(温度最适值)使相对活性归一化。稀释蛋白酶样品，以确保所有的活性测量结果都能落入该试验的剂量-反应曲线的接近线性部分。表1为活性最适值(pH-和温度活性)的一览表。图1-3为pH-稳定性，pH-活性和温度-活性的分布图，表2为蛋白酶在酸性pH-值下的pH-稳定性数据的详细比较。表1多种蛋白酶的pH-和温度最适值表2多种蛋白酶在pH2.0至5.0之间的pH-稳定性实施例2E纯化的蛋白酶样品的光吸收纯度测定A280/A260比率按下述测定纯化的蛋白酶样品的A280/A260比率。A260指的是在光程长度为1cm的样品池中，蛋白酶样品在260mm下相对于缓冲液空白的光吸收值。A280指的是在光程长度为1cm的样品池中，相同蛋白酶样品在280mm下相对于缓冲液空白的光吸收值。用缓冲液稀释实施例2中所得的纯化蛋白酶样品，直至分光光度计的A280读数落入其反应曲线的线性部分。由读数测定A280/A260比率对于拟诺卡氏菌属菌种NRRL18262而言为1.83，对于Nocardiopsisalba而言为1.75。实施例3得自拟诺卡氏菌属菌种NRRL18262的蛋白酶降解大豆粉(SBM)不溶性部分的能力检测得自拟诺卡氏菌属菌种NRRL18262的蛋白酶使SBM的不溶性/不能被消化的部分靠近消化酶和/或添加的外源性酶的能力。将该蛋白酶的性能与两种按照WO95/02044所述制备的天冬氨酸蛋白酶，ProteaseI和ProteaseII相比较。所述文献还公开了这两种酶在饲料中的用途。ProteaseI是II型曲霉胃蛋白酶(Aspergillopepsin)类蛋白酶，ProteaseII是I型曲霉胃蛋白酶类蛋白酶(它们都是天冬氨酸蛋白酶，即非-枯草蛋白酶类的蛋白酶)，它们皆得自Aspergillusaculeatus(参见上文所述的HandbookofProteolyticEnzymes)。在模拟单胃动物消化道(包括在pH2时用胃蛋白酶处理，在pH7时用胰酶制剂处理)的过程中产生了受试底物，即所谓的豆粉残留物。在用胰酶制剂处理的步骤中，加入了一系列高剂量的商品酶，以降解可靠近现存商品酶的SBM成分。加入以下皆可购自丹麦，NovozymesA/S的酶ALCALASETM2.4L，NEUTRASETM0.5L，FLAVOURZYMETM1000L，ENERGEXTML，BIOFEEDTMPlusL，PHYTASENOVOTML。所用SBM是粒状的饲料用标准48％蛋白质SBM。处理后，所得豆粉残留物中仅剩下5％的总蛋白质。FITC标记方法随后，按下述用FITC(MolecularProbes，F-143)标记残留物将豆粉残留物(湿重为25g，干重约为5g)悬浮于100ml0.1M碳酸盐缓冲液，pH9中，40℃搅拌1小时。使悬浮液冷却至室温，黑暗中用5-异硫氰酸荧光素(FITC)处理过夜。通过超滤(截留分子量为10,000)除去未结合的探针。FITC-试验使用下列测定法，用经FITC标记的豆粉残留物检测蛋白酶降解豆粉残留物的能力于37℃混合0.4ml蛋白酶样品(A280＝0.1)与0.4mlFITC-豆粉残留物(0.2M磷酸钠缓冲液pH6.5中的10mg/ml悬浮液)，在0小时之后，和保温22小时之后测定相对荧光单位(RFU485/535nm；激发/监测波长)。测定RFU之前，以20,000×g离心样品1分钟，将250微升上清液转移至黑色的微滴盘中。使用VICTOR1420Multilabel计数器(体外，丹麦)进行测定。RFU的-般性描述可参见IainD.Johnson，IntroductiontoFluorescenceTechniques，HandbookofFluorescentProbesandResearchChemicals，MolecularProbes，RichardP.Haugland，第6版，1996(ISBN0-9652240-0-7)。通过加入0.4ml缓冲液替代酶样品来制备空白对照样品。RFU样品＝ΔRFU样品-ΔRFU空白对照，其中ΔRFU＝RFU(22小时)-RFU(0小时)所得FITC值(RFU样品值)示于下表3。FITC值的误差容限一般为+/-20,000。与ProteaseI和ProteaseII形成对照的是，得自拟诺卡氏菌属菌种NRRL18262的蛋白酶能显著降解豆粉残留物。表3蛋白酶降解豆粉残留物的能力实施例4体外检测得自拟诺卡氏菌属菌种NRRL18262的蛋白酶在体外消化系统(模拟单胃动物的消化)中检测以下蛋白酶溶解玉米-SBM(玉米-豆粉)蛋白质的能力，所述蛋白酶是得自拟诺卡氏菌属菌种NRRL18262的蛋白酶，以及得自芽孢杆菌属菌种NCIMB40484的蛋白酶(“PD498”，按WO93/24623的实施例1所述制备)，和得自米曲霉的含蛋白酶酶制品FLAVOURZYMETM(可购自丹麦的NovozymesA/S，Bagsvaerd)。在缺乏外源性蛋白酶时保温玉米-SBM以用作空白对照。体外模型概况底物使用10g玉米-SBM食物，其中玉米-SBM的比例为6∶4(w/w)。SBM中的蛋白质含量为43％(w/w)，玉米粉中的蛋白质含量为8.2％(w/w)。10g玉米-SBM食物中的蛋白质总量为2.21g。消化酶胃蛋白酶(SigmaP-7000；539U/mg，固体)，胰酶制剂(SigmaP-7545；8xU.S.P.(USPharmacopeia))。酶蛋白质的测定使用S.C.Gill&P.H.vonHippel，AnalyticalBiochemistry182，319-326(1989)概述的原理，基于A280值和氨基酸序列(氨基酸组成)计算蛋白酶酶蛋白质的量。体外模型的实验方法1.称取10g底物置于100ml烧瓶中。2.于0分钟，在烧瓶中边混合边加入46ml含胃蛋白酶(3000U/g食物)的HCl(0.1M)和1ml蛋白酶(0.1mg酶蛋白质/g食物，只有FLAVOURZYMETM例外3.3mg/g食物)。将烧瓶置于40℃下保温。3.于20-25分钟，测定pH。4.于45分钟，加入16mlH2O。5.于60分钟，加入7mlNaOH(0.4M)。6.于80分钟，加入5ml含胰酶制剂(8.0mg/g食物)的NaHCO3(1M)。7.于90分钟，测定pH。8.于300分钟，测定pH。9.于320分钟，取出30ml等分试样离心(10000×g，10分钟，0℃)。10.测定上清液中总的可溶性蛋白质。蛋白质的测定使用Kjeldahl法(测定氮的百分比；A.O.A.C.(1984)，OfficialMethodsofAnalysis，第14版，AssociationofOfficialAnalyticalCheimists，WashingtonDC)分析上清液的蛋白质含量。计算使用下列等式计算所有样品的体外蛋白质溶解性。食物样品的蛋白质量10g的22.1％＝2.21g如果所有蛋白质都溶解于75ml液体，则上清液的蛋白质浓度为2.21g/75ml≈2.95％。应说明的是上清液还包括消化酶和外源性酶。为了测定溶解性，可能的话，应从上清液的蛋白质浓度中减去消化酶和外源性酶贡献出的蛋白质。胰酶制剂(Xmg/g食物)和胃蛋白酶(YU/g食物)中的蛋白质百分比＝((Xmg胰酶制剂/g食物×10g食物×0.69×100％)/(1000mg/g×75g))+((YU胃蛋白酶/g食物×10g食物×0.57×100％)/(539U/mg×1000mg/g×75g))，其中0.69和0.57指的是所用胰酶制剂和胃蛋白酶制品的蛋白质含量(即经上述Kjeldahl法测定，69％的胰酶制剂和57％的胃蛋白酶是蛋白质)。外源性酶的蛋白质百分比(ZmgEP/g食物)＝(ZmgEP/g食物×10g食物×100％)/(1000mg/g×75g)校正后上清液的蛋白质百分比＝分析得到的上清液蛋白质百分比-(消化酶的蛋白质百分比+外源性酶的蛋白质百分比)蛋白质的溶解性(％)＝(校正后上清液的蛋白质百分比×100％)/2.95％下面的结果表明得自拟诺卡氏菌属菌种NRRL18262的蛋白酶对蛋白质的溶解性显著好于空白对照以及芽孢杆菌属菌种NCJMB40484的蛋白酶。a，b，c上表第2栏中上标字母不相同的值显著不同，P＜0.05。SD是标准差；n是观察的例数。实施例5降解凝集素SBA和大豆Bowman-Birk及Kunitz抑制剂检测得自拟诺卡氏菌属菌种NRRL18262和芽孢杆菌属菌种NCIMB40484的蛋白酶水解大豆凝集素(SBA)和大豆Bowman-Birk及Kunitz胰蛋白酶抑制剂的能力。于37℃，pH6.5中将纯的SBA(Fluka61763)，Bowman-Birk抑制剂(SigmaT-9777)或Kunitz抑制剂(大豆胰蛋白酶抑制剂，BoehringerMannheim109886)与蛋白酶保温2小时(蛋白酶∶抗-营养因子＝1∶10，基于A280)。保温缓冲液50mM二甲基戊二酸，150mMNaCl，1mMCaCl2，0.01％TritonX-100，pH6.5。由SDS-PAGE凝胶上本来有的SBA或胰蛋白酶抑制剂带的消失，和低分子量降解产物的出现估计蛋白酶降解SBA和蛋白酶抑制剂的能力。用考马斯蓝染色凝胶，通过扫描测定带的强度。下表4显示了结果，即所降解的抗-营养因子的百分比。也期望在保温豆粉与候选蛋白酶之后，能应用Westem技术，用抗SBA，Bowman-Birk抑制剂或Kunitz抑制剂的抗体估计蛋白酶降解大豆中的抗-营养因子的能力(参见WO98/56260)。表4实施例6酸-稳定性拟诺卡氏菌属蛋白酶对适于烤焙的小鸡的生长性能的作用根据法国官方指导活动物实验的说明进行试验。性别分离的一日龄小鸡(“RossPM3”)由商业孵化所提供。将小鸡圈养在用铁丝网作地面的多层鸡笼中，这些鸡笼被置于环境受控的室内。随意供给饲料和自来水。第8天，按体重将小鸡分组，6只小鸡为一组，对它们进行对照处理，即接受不含酶的实验食物，或酶处理，即接受每kg饲料添加含100mg酶蛋白质的蛋白酶的实验食物。用12组重复每种处理，每个性别6组。在第8和29天给各组称重。测定中间期(intermediateperiod)的饲料消耗，计算体重增加量和饲料转化率。实验食物基于以玉米淀粉和豆粉(44％粗蛋白)为主要成分(表5)。在约70℃使饲料成为粒状(压模形状3×20mm)。以固定量的水稀释适当量的蛋白酶，喷洒在粒状的饲料上。对对照处理而言，用相同的方式使用足够量的水进行处理。为了进行统计学评价，使用SAS包(SASInstituteInc.，1985)中的GLM程序进行方差的双因子分析(因子处理和性别)。当表现出显著的处理效果(p＜0.05)时，用Duncan试验分析处理方式之间的差异。预期可获得改良的体重增加，和/或改良的饲料转化率，和/或改良的豆粉营养价值(考虑到玉米淀粉是很容易消化的成分)。参考文献EEC(1986)DirectivedelaCommissiondu9avril1986fixantlam殚hodedecalculdelavaleurénérgetiquedesalimentscomposésdestinslavolaille.JournalOfficieldesCommunautésEuropéennes，L130，53-54。SASInstituteInc.(1985)SAS_User’sGuide，Version5Edition.CaryNC。表5实验食物的组成1所分析的含量90.6％干物质，45.3％粗蛋白，2.0％粗脂肪，4.9粗纤维2相当于90mg拉沙里菌素-Na/kg饲料作为抗球虫剂(anticoccidial)3基于所分析的营养物质的含量进行计算(EC-等式；EEC，1986)饲料成分的供货商玉米淀粉法国RoquettesFrères，F-62136Lestrem豆粉44德国RekasanGmbH，D-07338Kaulsdorf动物脂法国FondoirsGachotSA，F-67100Strasbourg豆油法国EwocoSarl，F-68970GuemarDL-甲硫氨酸法国ProduitRocheSA，F-92521Neuilly-sur-SeineMCP法国BrenntagLorraine，F-54200Toul盐法国MinoterieModeme，F-68560Hirsingue结合剂法国MinoterieModeme，F-68560Hirsingue预混物(AMvolchairNS4231)法国Agrobase，F-01007Bourg-en-BresseAvatec法国ProduitRocheSA，F-92521Neuilly-sur-Seine实施例7用于火鸡和属于鲑科的鱼的，添加有酸-稳定性拟诺卡氏菌属蛋白酶的预混物和食物制备具有下列组成的预混物(每千克的含量)5000000IE维生素A1000000IE维生素D313333mg维生素E1000mg维生素K3750mg维生素B12500mg维生素B21500mg维生素B67666mg维生素B1212333mg烟酸33333mg生物素300mg叶酸3000mgD-泛酸钙1666mgCu16666mgFe16666mgZn23333mgMn133mgCo66mgI66mgSe5.8％钙在此预混物中加入得自拟诺卡氏菌属菌种NRRL18262的蛋白酶(按实施例2所述制备)，加入量相当于10g蛋白酶酶蛋白质/kg。按下述制备粒状火鸡起始和饲养食物，所述食物具有下表所示的组成(基于Leeson和Summers，1997，但通过使用最优化程序AGROSOFT_重新计算过，不含肉粉)，且每kg含100mg蛋白酶酶蛋白质在级联混合器中混合磨碎的玉米，豆粉，鱼粉和植物油。以10g/kg食物的量加入石灰石，磷酸钙和盐，以及上述预混物，接着进行混合。将所得混合物制成粒状(用蒸汽调节，然后进行成粒步骤)。也按上文的一般性概述制备鲑鱼的两种食物。实际的组成示于下表(汇编自Refstie等(1998)，Aquaculture，vol.162，p.301-302)。通过使用Agrosoft_饲料最优化程序重新计算估计的营养物质含量。在食物中加入按实施例2所述制备的得自Nocardiopsisalba的蛋白酶，加入的量相当于每kg食物100mg蛋白酶酶蛋白质。实施例8测定含蛋白酶的酶产品的纯度可通过基于含蛋白酶的酶产品在大小排阻层析柱上的分级分离的方法，测定含蛋白酶的酶产品，例如商购的多-组分酶产品之类的蛋白酶制品的纯度。大小-排阻层析也被称为凝胶过滤层析，它基于多孔的凝胶基质(填充于柱中)，其孔径大小的分布与待分离的蛋白质分子的大小相当。相对较小的蛋白质分子可从外围的溶液中扩散至凝胶中，而较大的分子因其大小的关系而不能以相同的程度扩散至凝胶中。结果，根据大小即可分离蛋白质分子，较大的分子比较小的分子先从柱中洗脱出来。蛋白质浓度的测定用购自PIERCE的BCA蛋白质检测试剂盒(等同于PIERCE目录号为23225)测定含蛋白酶的酶产品中的蛋白质浓度。双辛可宁酸的钠盐(BCA)是稳定的水溶性化合物，它能与碱性环境中的一价铜离子(Cu1+)形成深紫色复合物。BCA试剂形成BCA蛋白质检测试剂盒的基础，该试剂盒能监测蛋白质与碱性Cu2+反应(Biuret反应)产生的一价铜离子。此反应产生的颜色是稳定的，并且随着蛋白质浓度的增加，而成比例的加深(Smith，P.K.(1985)，AnalyticalBiochemistry，vol.150，pp.76-85)。BCA工作溶液由50份试剂A与1份试剂B混合而成(试剂A是PIERCE目录号23223，它在碱性的碳酸盐缓冲液中含有BCA和酒石酸盐；试剂B是PIERCE目录号23224，它含有4％CuSO4*5H2O)。将300μl样品与3.0mlBCA工作溶液混合。于37℃保温30分钟，然后将样品冷却至室温，读出A490值作为样品中蛋白质浓度的测量结果。在试验中包括牛血清白蛋白(PIERCE目录号23209)的稀释液作为标准。样品预-处理如果含蛋白酶的酶产品是固体，首先于5℃将产品溶解于/悬浮于20倍体积的100mMH3BO3，10mM3，3′-二甲基戊二酸，2mMCaCl2，pH6(缓冲液A)至少15分钟，如果此阶段的酶是悬浮液，则流经0.45μ的滤器以过滤悬浮液，给出清亮的溶液。从此时起，溶液即被处理成含蛋白酶的液体酶产品。如果含蛋白酶的酶产品是液体，首先于5℃将产品置于6-8000Da截留分子量的SpectraPor透析管(得自SpectrumMedicalIndustries，目录号为132670)，对着100倍体积的缓冲液A+150mMNaCl(缓冲液B)透析至少5小时，以除去使含蛋白酶的液体酶产品具有高粘度的制剂化合物，所述化合物对大小-排阻层析不利。如果在透析过程中形成沉淀物，则需流经0.45μ的滤器以过滤经透析的含蛋白酶的酶产品。用上述蛋白质浓度测定法测定经透析的酶产品中的蛋白质浓度，用缓冲液B稀释酶产品，得到准备进行大小-排阻层析的，蛋白质浓度为5mg/ml的样品。如果经透析的酶产品的蛋白质浓度低于5mg/ml，也可以使用。大小-排阻层析用缓冲液B(流速1ml/min)平衡300mlHiLoad26/60Superdex75pg柱(AmershmPharmaciaBiotech)。将1.0ml含蛋白酶的酶样品上样于柱，用缓冲液B(流速1ml/min)洗脱柱。从柱的流出液中收集2.0ml级分，直至所有上样的样品都从柱上洗脱下来。通过适当的检测法分析收集的级分的蛋白质浓度(参见上述蛋白质浓度测定法)和蛋白酶活性。适当检测法的例子是Suc-AAPF-pNA试验(参见实施例2B)。其它适当的检测法是例如CPU试验(参见实施例1)和ProtazymeAK试验(参见实施例2D)。调节蛋白酶活性试验的条件，例如pH，以尽可能多地测定经分级分离的样品中的蛋白酶。上文所提及的检测法的条件是适当条件的例子。其它适当的条件也在上文有关测定蛋白酶活性的章节中提到。将一个或多个蛋白酶检测法中具有活性的蛋白质峰定义为蛋白酶峰。蛋白酶峰纯度的计算方法为用峰中的蛋白质量除以所有被鉴定的蛋白酶峰中的总蛋白质量。使用上述方法将含蛋白酶的酶产品纯度计算为用酸-稳定性蛋白酶峰中的蛋白质量除以所有被鉴定的蛋白酶峰中的蛋白质量。序列表序列表<110>霍夫曼-拉罗奇有限公司(F.Hoffmann-LaRocheAG)<120>酸-稳定性蛋白酶在动物饲料中的用途<130>10094.204-wo<140>DK200000200<141>2000-02-08<160>2<170>PatentInversion3.0<210>1<211>188<212>PRT<213>拟诺卡氏菌属菌株(Nocardiopsissp.)NRRL18262<400>1AlaAspIleIleGlyGlyLeuAlaTyrThrMetGlyGlyArgCysSer151015ValGlyPheAlaAlaThrAsnAlaAlaGlyGlnProGlyPheValThr202530AlaGlyHisCysGlyArgValGlyThrGlnValThrIleGlyAsnGly354045ArgGlyValPheGluGlnSerValPheProGlyAsnAspAlaAlaPhe505560ValArgGlyThrSerAsnPheThrLeuThrAsnLeuValSerArgTyr65707580AsnThrGlyGlyTyrAlaAlaValAlaGlyHisAsnGlnAlaProIle859095GlySerSerValCysArgSerGlySerThrThrGlyTrpHisCysGly100105110ThrIleGlnAlaArgGlyGlnSerValSerTyrProGluGlyThrVal115120125ThrAsnMetThrArgThrThrValCysAlaGluProGlyAspSerGly130135140GlySerTyrIleSerGlyThrGlnAlaGlnGlyValThrSerGlyGly145150155160SerGlyAsnCysArgThrGlyGlyThrThrPheTyrGlnGluValThr165170175ProMetValAsnSerTrpGlyValArgLeuArgThr180185<210>2<211>17<212>PRT<213>Nocardiopsisalba<400>2AlaAspIleIleGlyGlyLeuAlaTyrThrMetGlyGlyArgCysSer151015Val权利要求1.至少一种酸-稳定性蛋白酶在动物饲料中的用途，其中所述蛋白酶与(i)SEQIDNO1和/或(ii)SEQIDNO2具有至少70％的同一性。2.至少一种酸-稳定性蛋白酶在制备用于动物饲料的组合物中的用途，其中所述蛋白酶与(i)SEQIDNO1和/或(ii)SEQIDNO2具有至少70％的同一性。3.权利要求1的用途，其中蛋白酶的剂量是每kg饲料0.01-200mg蛋白酶酶蛋白质。4.权利要求2的用途，其中所需蛋白酶的剂量是每kg饲料0.01-200mg蛋白酶酶蛋白质。5.改善动物饲料营养价值的方法，其中在该饲料中添加至少一种酸-稳定性蛋白酶，且其中所述蛋白酶与(i)SEQIDNO1和/或(ii)SEQIDNO2具有至少70％的同一性。6.动物饲料添加剂，其含有(a)至少一种酸-稳定性蛋白酶；和(b)至少一种脂溶性维生素，和/或(c)至少一种水溶性维生素，和/或(d)至少一种痕量矿物质，和/或(e)至少一种宏量矿物质；其中所述蛋白酶与(i)SEQIDNO1和/或(ii)SEQIDNO2具有至少70％的同一性。7.权利要求6的动物饲料添加剂，其中蛋白酶的量相当于每kg饲料需添加0.01-200mg蛋白酶蛋白质。8.权利要求6-7中任一项的动物饲料添加剂，其进一步含有植酸酶，木聚糖酶，半乳聚糖酶，和/或β-葡聚糖酶。9.动物饲料组合物，其粗蛋白含量为50-800g/kg，且含有至少一种酸-稳定性蛋白酶，其中所述蛋白酶与(i)SEQIDNO1和/或(ii)SEQIDNO2具有至少70％的同一性。10.权利要求9的动物饲料组合物，其中蛋白酶的量为每kg饲料0.01-200mg蛋白酶蛋白质。11.处理植物蛋白质的方法，包括在至少一种植物蛋白质或蛋白质来源中添加至少一种酸-稳定性蛋白酶的步骤，其中所述蛋白酶与(i)SEQIDNO1和/或(ii)SEQIDNO2具有至少70％的同一性。12.权利要求11的方法，其中至少一种植物蛋白质来源中包括大豆。全文摘要与得自拟诺卡氏菌属菌株的蛋白酶同源的酸－稳定性蛋白酶，它们在含有所述蛋白酶的动物饲料，饲料－添加剂和饲料组合物中的用途，以及使用所述蛋白酶处理植物蛋白质的方法。文档编号A23K1/18GK1398162SQ0180470公开日2003年2月19日申请日期2001年2月5日优先权日2000年2月8日发明者彼得·R·奥斯特加尔德,卡斯滕·肖霍姆申请人:霍夫曼-拉罗奇有限公司