专利名称：生物活性食品复合物,制备生物活性食品复合产品的方法和用于控制疾病的方法
技术领域：
本发明涉及生物活性食品复合产品，制备生物复合产品的方法以及利用益生菌和群体数量感受性(quorum sensing)抑制剂如抑制性呋喃酮(furanone)和其它包含于生物活性食品复合产品连续相和分散相中的生物活性化合物来控制疾病的方法。
孵化和抚育操作通常依赖鲜活食用生物如鱿鱼、多毛虫、Artemia生物质、Artemia幼虫和微藻类的供应，来为培养和生产水产养殖物生产水产养殖种苗。这些食物通常携带大量的细菌，这些细菌可能包括病原体如弧菌属细菌，并且可能是病毒疾病传播的载体。鲜活食用生物的使用增加了孵化期感染疾病的危险性而且这些病原体可能会通过种苗被传播到抚育和培养设备中。
在虾养殖过程中主要由细菌，特别是弧菌属菌，和病毒如白斑病毒(White Spot Virus)导致的疾病造成的巨大损失已经对许多国家如中国、泰国、印度尼西亚、印度、菲律宾、巴拿马、厄瓜多尔等国家的该产业造成重创。孵化槽和孵化池中动物的高密度加剧了病原体的传播。水生环境，由于经常加入富含蛋白的饲料而适于细菌生长，其中的许多细菌可能是致病的。这些问题由于微生物的相互作用而愈来愈严重，已经初步从临床病理学角度来考虑密集型生产规模中的动物及其环境。当检测到致病细菌或病毒时，养殖者就向饲料和水中加入抗微生物化合物；甚至当病原体不明显时，许多养殖者也大量地使用抗生素来进行预防。这导致弧菌的增多，也可能是其它细菌的增多，这些菌具有多重抗生素抗性而且是毒性更强的病原体。病原体包括哈氏弧菌、副溶血弧菌、灿烂弧菌、最小弧菌、霍乱弧菌、解藻朊酸弧菌、鳗弧菌等。
利用有益微生物(益生菌)通过竞争过程和直接抑制来取代致病细菌是优于施用抗生素的补救办法。益生菌可被用来控制由弧菌和其它革兰氏阴性菌引起的疾病而且可用来控制包括由气单胞菌和革兰氏阳性病原体引起的其他鱼和虾疾病，所述革兰氏阳性病包括链球菌、肉杆菌等。
目前这些被用于水产养殖业，但是它们的效率是不同的；许多产品不是针对水生养殖来设计的或者不是专用于目的动物或所要控制的病原体。换句话说，它们没有满足益生菌的定义自然存在的活微生物的培养物，该微生物被动物食用后有利于动物健康。
通常，将所使用的益生菌加到水中，或在某些情况下，使用前与饲料迅速混合起来。由于在干颗粒状饲料的制备过程中采用了高温而导致了活菌的死亡，因此益生菌不能在多种颗粒状和大多数挤压饲料的制备过程中加入。
WO9629392记载了通过利用呋喃酮(furanone)来抑制某些革兰氏阴性菌，尤其是弧菌体内的高丝氨酸内酯调节的过程的方法；然而，还没有人提出适于商业规模养殖的呋喃酮使用机制。
在孵化期，还不能通过食物和水有效控制微生物群体。生物包封(bioencapsulation)，即通过给活食用生物喂含有所需含量的化合物的悬浮液、乳浊液或其它制剂来丰富所述食用生物营养的方法已被用来增加和改善活食用生物如海水虾，Artemia属生物的营养物含量(Lavens等，水产养殖和鱼业管理Aquaculture and FisheriesManagement)(1992))，其中所述化合物接下来被用来喂鱼虾幼体。该技术已被用来将生物活性化合物如抗生素(Dixon等，1995，Journalof Aquatic Animal Health742-45)和细菌(Gomez-Gil等.1998，Applied and Evironmental Microbiology64(6)2318-2322)传递给水产养殖品种。生物包封是提供用于将食用生物体内的营养成分和生物活性化合物传递给目的水产养殖品种的载体的有效方法。然而，生物包封给在商业孵化过程中饲养食用生物和目的品种的养殖过程增添了复杂性，所述养殖过程的劳动强度已经很高了。
商品幼体用干饲料已被作为鱼和虾幼体的活食物替代品或食物添加物来进行销售，其中所述饲料包括蛋白-交联的微胶囊、喷雾干燥的聚集物、冻干的颗粒和片状物。然而，以这些不含活食用生物的幼体干饲料为食的鱼虾幼体的存活和/或生长的情况通常很差。因此，海鱼和海虾的孵化可以减少但不能取消应用活食用生物进行种苗生产。
对虾和鱼应用幼体干饲料的有关问题包括(a)在水中物理性质不稳定，即加入到培养槽后饲料颗粒快速分解；和(b)营养成分的高速沥出，即水溶性的有机物质从完整的饲料颗粒/微胶囊中流失到槽水中。销售的幼体饲料的物理分解和沥出导致水质很差。水质差是对鱼虾幼体的压力根源而且由于促进了病原体的生长而降低了孵化中的健康程度和存活率。
幼体饲料的分解和沥出程度可以通过以下方式来降低(a)严格干燥法，该方法能够增加饲料颗粒的硬度从而更难溶于水；(b)将饲料营养物包裹或包封在水不溶性的包衣或基质中；或(c)在幼体饲料制品中采用低水溶性的饲料成分。然而，这些方法改进水稳定性和降低沥出程度的代价是损失了消化系统未发育良好的鱼虾幼体对营养成分的生物利用率，它们不能从这些饲料中获得适当营养。
蛋白交联微胶囊(英国专利79437454和2103568)作为干粉商品取代幼虾食物中的活食用生物。然而，这些胶囊由于沥出而失去了大量的可溶性营养物并且不能完全取代幼虾养殖过程中的活藻类和Artemia。
WO87/01587记载了脂凝胶颗粒的形成，从而营养或药学活性成分被包埋在脂质体中以及该脂质体被包封在水胶体基质中。所述质脂体可在磷脂微球中有效含有小分子的、水溶性的化合物而且所述水胶体基质能够保护所述质脂体。然而，脂凝胶颗粒由于质脂体负荷容积小和较脆的磷脂膜而不可能含有足够的营养成分来构成完全的幼体饲料，在与完全幼体饲料所需的其它饲料营养成分混合时，所述磷脂膜可能会破裂。
Villamar和Langdon(海洋生物学(Marine Biology)，115(4)635-642(1993))描述了复合微胶囊(CXM)，该微胶囊能够显著减少低分子量的水溶性化合物从幼体饲料中沥出。通过将含有水溶液内容物质的脂壁微胶囊(LWM)包埋在较大的凝胶珠子中来制备CXM，所述凝胶大珠子含有饲料营养成分并且由藻酸钠和与钙进行离子交联的明胶组成。LWM能将小的水溶性分子保留在CXM中，但是其负载体积小而且制备困难。
幼体饲料CXM用来解决物理学水稳定性以及由于沥出而造成营养损失的问题，但是并不能传递生物活性化合物或控制疾病。生物包封用来提高活食用生物的营养价值并且能使生物活性化合物传递到目的品种中，但该技术又给已经非常复杂的鱼和甲壳动物幼体的饲养业增添了复杂性和成本。
美国专利US5698246改进了由Villamar和Langdon发展的(海洋生物学(Marine Biology)，115(4)635-642(1993))CXM概念，通过由采用脂质如鱼油包裹或包衣干营养饲料然后将所述的被包裹或被包衣的干营养饲料与作为内-益生菌的杆菌属的细菌一起包封而形成LWM来消除复杂性简化工艺过程。包衣的饲料和细菌的负载混合物被包封在一种水胶体基质如与钙进行离子交联的藻酸钠中。然后通过悬浮在一种有助于保存的液体介质中来稳定被包封的复合物，所述介质含有作为“外益生菌”的益生细菌。在该液体中，幼体饲料的内益生菌被设计成能够同营养成分一同进入目的虾或鱼的Gl道而且外益生菌被设计成能够保留并生长于养殖虾或鱼的水中。
虽然，美国专利5,698,246通过发明新型液体饲料而对水产养殖的传统饲料制品进行了明显的改进，但是该专利既没有提供控制疾病的方法也没有发展制备CXM的技术，而是采用了简单的包裹或包衣所含物质的方法来替代LWM并且提供传递益生细菌的方法而未描述用于水产养殖中控制疾病的方法。
美国专利US5,776,490涉及通过利用含在复合物、交联蛋白微胶囊中而不是离子交联的藻酸钙和明胶的水胶体基质中的LWM对CXM进行了改进。在水产养殖过程中该发明已经被用于将营养物和药传递给有鳍鱼类幼体但没有提供用于疾病控制的方法。
I期USDA/SBIR批准文号93-33610-8500(1993)记载了用于制备水稳定性水生动物饲料的方法，该饲料是在低于85℃的低温下进行加工的从而优化了水生动物对营养成分的生物利用率。通过在水中混合含有饲料成分的浆液和藻酸钠，然后将所述混合物冷挤压或注入模具中来制备凝胶条，该凝胶条与氯化钙进行交联并在低温下进行干燥，这样就制成了所述的水稳定饲料。另外，该技术描述了采用真空鼓干燥所述的浆液从而制成与氯化钙交联的薄片。该技术利用低温加工从而避免了加热对营养物的破坏，该营养物是为水生动物而制备的，但是该技术没有提到生物活性化合物的传递或疾病的控制。
WO95/28830记载了一种“环境温度方法”即3-156℃，该方法包括混合藻酸盐、饲料成分和水来制备浆液，该浆液与二价阳离子接触从而形成水稳定性水生动物饲料颗粒。WO95/28830没有涉及对组合物和方法进行任何改进的方法。
美国专利US6,024,983记载了在加强动物免疫应答的医学应用中用于传递生物活性化合物的微胶囊组合物。该发明涉及一种混合物，该混合物的一级含生物活性物质的生物适应性微胶囊被包封在二级含生物活性物质的生物适应性微胶囊中。该发明对从感冒抗原到淋病抗原的动物或人类疾病抗原提供免疫应答。应用该发明的目的在于对具有成熟的免疫和恒温系统的患病动物应用这种生物活性化合物。然而该发明没有被用于虾、具有非特异性免疫系统的动物，而且由于与生物医学领域有关，没有提供用于水产养殖当中控制疾病的方法。
在另外一种产业中，利用水胶体微胶囊的微囊包封被用来固定包括杂交瘤细胞(US5,116,747，US4,942,129)和胰岛(US4,806,355)的生物学活性物质。所述细胞固定于凝胶珠子，用于生物医学目的包括在生物反应器中大量培养来生产商业用量的生物制剂，或者用于通过医疗植入人或非水产养殖的动物体内进行疾病治疗。
还有另外的产业应用中，为了制备用于乳品发酵的细胞生物质，利用藻酸钙微囊包封来将生物学活性乳酸乳球菌乳脂亚种固定在凝胶珠子(Morin等.，Applied and Environmental Microbiology，58(2)545-550，(1992))。
在研究应用中，Chevalier和de la Noue(Enzyme Microb.Technol.，9；53-56，(1987))通过在气升式发酵罐中将生物活性枯草杆菌固定于离子交联的卡拉胶凝胶珠子而提高了α-淀粉酶的酶产量。
在动物饲养业中，乳酸杆菌属、杆菌属和其它属的细菌是通常被作为直接食用的微生物而添加到饲料中的益生菌，该益生菌能够通过酶作用来增强消化营养物的能力以及能够在牲畜肠道中抑制潜在的致病微生物的生长，尤其是在压力状态下时。牲畜健康状况的改善通常是由于分泌出抑制病原体在肠道中生长的抗菌物质以及由益生菌激活特异性和非特异性的免疫应答。
在水产养殖中，向水生生物，尤其是幼体形式传递如益生菌等的生物活性物质不能通过传统饲料而顺利实现，这些活性物质在水中迅速分解，具有很高的沥出速率，或在制备过程中经历了粗糙加工。尽管美国专利US5,698,246和US5,776,490代表水生生物饲料，尤其是鱼虾幼体饲料的技术领域的改进，但是这些仍属Villamar和Langdon(海洋生物学(Marine Biology)，115(4)635-642(1993))所研究出的方法的变化步骤，没有描述水产养殖过程中的疾病控制方法。
对海鱼的研究结果表明自然存在于肠道内的几种细菌产生抑制细菌病原体如鳗弧菌等的物质并且这些有益的细菌能够粘附到鱼的肠粘液中并在其中进行生长(Olsson等，Applied and EnvironmentalMicrobiology，58(2)551556，(1992))。
本文所记载的发明提供在Villamar和Langdon(MarineBiology)，115(4)635-642(1993)基础上进行改进的物质组合物并且提供其他文献没有记载的用于控制细菌疾病的方法。
本发明的概述本发明提供用于水生生物的生物活性食品复合物的组合物，制备生物活性食品复合物的方法以及用所述生物活性食品复合物饲养水生生物的方法，所述水生生物包括但不限于甲壳动物、软体动物和有鳍鱼类幼体、后期幼体、幼年和成年形式，本发明还提供在水产养殖过程中控制细菌疾病的方法。
本发明提供将所选择益生菌以芽孢形式在制备过程中加到饲料中并且同时提供当所述益生菌投喂动物或将加到池塘或槽水中时使这些益生菌激活并萌发的机制。而且，该方法结合了通过抑制调节致病基因活性的基因的表达来控制病原体的方法。这两种方法的结合比每种单个方法更有效并且具有商业可行性。选择生产酶的益生细菌，该酶既降解高丝氨酸内酯又降解由弧菌产生的酰基高丝氨酸内酯并且选择益生菌产生抑制弧菌生长或杀死弧菌的抗生素。
本发明记载将抑制性呋喃酮传递给商业饲养的动物从而抑制革兰氏阴性菌体内的，尤其是致病的弧菌体内的高丝氨酸内酯调控过程的实用方法。本发明将那些抑制性化合物在动物饲料和动物圈养系统中的传递与益生菌和其它生物活性化合物的传递结合了起来。
因此，本发明提供在水生动物中控制和/或预防疾病的方法，包括给水生动物投喂含有至少一种益生细菌和至少一种抑制性或调节性化合物的组合物。在这种方法中，细菌的致病性可以通过下列共同作用的三种机制的结合而得到抑制a.利用益生细菌如杆菌通过以下方法来控制病原体通过竞争性排除法如竞争食物和空间，并通过直接抑制如通过原位产生杀菌或抑菌物质如抗革兰氏阴性和革兰氏阳性病原体的抗生素来减少其数目从而抑制群体数量感受和抑制致病基因的表达；b.利用益生细菌如杆菌通过由益生菌分泌的酶降解病原体分泌的群体数量感受分子来抑制致病基因在革兰氏阴性菌和革兰氏阳性病原体中的表达。；c.施用抑制性或调节性化合物如呋喃酮以便在革兰氏阴性病原菌如弧菌中抑制由高丝氨酸内酯和酰基高丝氨酸内酯调节的致病基因的表达。
在所述生物活性食品复合物的一个实施方案中，含脂溶性生物活性化合物如溶解在脂质中的抑制性呋喃酮组成的第一种油包固体的乳浊液与形成所述稳定乳浊液的分散相的干饲料成分和其它生物活性化合物如所选益生细菌一起形成连续相。所述稳定乳浊液，乳浊液-1在分散相和连续相中提供水生动物正常存活、生长和发育中所需的生物活性物质和必需的营养成分。乳浊液-1本身被水胶体聚合物乳化为分散相，然后水胶体聚合物进行离子胶化从而形成生物活性食品复合物。在下述公开内容中，水胶体是优选类型的聚合物而第二种乳浊液的其它形式的连续相可以包括交联蛋白或其它形式的可生物降解的聚合物。所述生物活性食品复合物含有能够提供必需营养物和/或生物活性化合物的细菌芽孢、细菌营养细胞、细菌细胞壁、酵母细胞、酵母抽提物、酵母细胞壁、藻类细胞、药剂、酶、无脊椎生物胚或生物包封的无脊椎生物，所述必需营养物和/或生物活性化合物有利于促进营养成分的吸收和提高同化作用的效率，增强免疫应答和抑制水生动物的消化道和池塘或水槽或其它饲养水生生物的圈养系统内的致病微生物的生长。
所述生物活性食品复合物可以不需要干燥而以非液体的由微胶囊或珠子组成的半固体、湿糊状物、或以湿条、颗粒、薄片等形式进行保存，或者通过采用防冻剂(cryopreservative)进行冷冻保存。所述生物活性食品复合物可被直接加到水产养殖动物圈养系统内以便被水生动物食用。在本发明的一个实施方案中，所述生物活性食品复合物或第一种生物活性食品复合物可作为颗粒状或挤压的水生生物饲料的表层涂层或包衣加到颗粒状或挤压的水生生物饲料中。
新型的双-乳浊液方法制得所述的生物活性食品复合物。在一个实施方案中，乳浊液-1是由形成分散相的生物活性物质和粉状营养饲料和形成连续相的含溶解的脂溶性生物活性化合物的食用油组成的油包固体乳浊液。乳浊液-2是一种聚合物包油的乳浊液，其中乳浊液-1作为分散相以及水胶体聚合物作为连续相。乳浊液-1含有分散在油中的饲料营养成分和生物活性物质而且它被水胶体聚合物所乳化从而形成乳浊液-2。在本发明的一个实施方案中，含有脂溶性抑制性呋喃酮的生物活性物质被混合到乳浊液-1的连续相中。在本发明的另一方面，在形成乳浊液-1的过程中可能破裂或损坏的生物活性物质如无脊椎生物或胚胎或益生细菌营养细胞可以通过轻度混合被直接包埋到乳浊液-2中。然后乳浊液-2被离子交联或络合成结合了乳浊液-1的生物活物质和营养成分和包埋在乳浊液-2中的完整生物活性物质的物理稳定的基质。在离子胶化方法中，所述生物活性食品复合物可以形成微胶囊或珠子、条状物、颗粒、片状物或其它几何形状。
被用作乳浊液-1的连续相的食用油可以是鱼油、精炼鱼油产品或鱼油、鱼油产品和植物油的混合物。
典型的油包括鲱鱼油、鲑鱼油、凤尾鱼油、沙丁鱼油、金枪鱼油、鲭鱼油、细鳞胡瓜鱼油、鱿鱼油、绿鳕鱼油、鳕鱼肝油、食用鱼油添加剂如Promega(Warner-Lambert公司)，大豆油、红花油、玉米油、棕榈仁油和其它食用油。另外，所述油或油混合物已经添加抑制性呋喃酮、卵磷脂、胆固醇、乳化剂如Santone(Van Den BerghFood Ingr.)、抗氧化剂如乙氧喹、脂溶性维生素A、D、E和K、β胡罗卜素和虾青素色素。
抑制性呋喃酮和其它脂溶性生物活性化合物、卵磷脂、胆固醇、乳化剂、抗氧化剂、脂溶性维生素和虾青素被混合到油中后，干粉饲料成分被乳化到油混合物中从而形成乳浊液-1，该乳浊液是油包固体的乳浊液。在本发明的优选方面，固体对油的比例范围从约0.01∶1至100∶1，优选地0.1∶1至3∶1。因此，取决于固体和油的相对浓度，乳浊液-1的组成可以从油包固体变化到固体包油。
两种类型的乳浊液在本发明的保护范围内。在下述公开内容中，当乳浊也被记载为油包固体乳浊液时，应当理解为所述描述也适用于固体包油乳浊液并且除非另有说明，应当理解为生物活性化合物既被包含在两种类型乳浊液中的分散相中也被含在其连续相中。
在本发明的优选实施方案中，包括细菌细胞壁、细菌细胞或芽孢、酵母、酵母细胞壁、酵母抽提物、藻类细胞、药剂或酶在内的生物活性物质包含于乳浊液-1的固相中。乳浊液-1的油相作为包含脂溶性生物活性化合物如抑制性呋喃酮、脂溶性激素、脂溶性化学诱引剂或化学刺激剂或其它脂溶性生物活性化合物的介质并且还作为粉状饲料成分和生物活性物质的疏水性内层包衣。乳浊液-1还作为水生动物的营养源，提供必需脂肪酸、脂溶性营养物质和维生素和色素。
与脂质体、LWM或已知的被包裹的/被包衣的物质不同，本发明的乳浊液-1是在连续相和分散相都含有重要生物活性的油包固体或固体包油的新型乳浊液，其制备简单，稳定，并能够提供减少水溶性分子从粉状营养物和从生物活性物质向水环境沥出的屏障并且不会受到脂质体或LWM那样的小负荷容积的限制。乳浊液-1在物理和化学方面不同于美国专利US5,698,246中记载的包裹或包衣的简单方法，并且代表对Villamar和Langdon(Marine Biology，115(4)635-642(1993))所描述的络合微胶囊(CXM)的改进。
含有脂溶性的和固体的生物活性物质和饲料成分的乳浊液-1本身被乳化成水胶体聚合物分散体从而形成乳浊液-2，聚合物包油或聚合物包固体的乳浊液。即，乳浊液-2的分散相由乳浊液-1组成以及乳浊液-2的连续相由水胶体聚合物组成。乳化作用可能破损的无脊椎生物胚胎或无脊椎生物、细菌营养细胞或其它物质可通过轻微的混合而被包埋在乳浊液-2中。然后乳浊液-2与用来离子交联水胶体聚合物的离子接触。离子凝胶化用来形成乳浊液-2的连续相的稳定基质，其包含乳浊液-2的分散相和被包埋的物质，形成生物活性食品复合物。
在一个实施方案中，所述生物活性食品复合物形成半固体的湿糊并且在有抗菌介质如氯化钙或氯化钠盐水和霉菌抑制剂如甘油、丙二醇、丙酸(proprionic acid)或其它防腐剂存在下通过将水分(Aw)降到0.8来进行保存。另外，所述生物活性食品复合物可以通过采用防冻剂如二甲亚砜(DMSO)、甘油、丁化羟基甲苯(BHT)、蔗糖、棉子糖、甘露醇(manitol)、乙二醇、丙二醇、甲醇、1，2-丙二醇、1，3-丁二醇、2，3-丁烯二醇来进行冷冻保存。
本发明的详述在制备过程中将抑制性呋喃酮、益生菌如杆菌的芽孢和干的营养细胞整合到生物活性食品复合物中，其中选用产生特异抑制革兰氏阴性病原体如弧菌的抗菌物质和酶的益生菌。然后将生物活性食品复合物直接加到水产养殖的水生生物品种的食物中或动物圈养系统中。所述生物活性食品复合物和生物活性食品复合物的乳浊液-1作为传统动物饲料的外层包衣的活性成分被分别或共同添加，所述传统动物饲料包括颗粒状的或挤压的水生生物饲料。
所述杆菌菌种以产生抑制或杀死致病细菌如弧菌的抗生素为基础进行选择。同种或不同的杆菌种类似它们能够产生通过降解或消化信号分子如高丝氨酸内酯(HSL)和(酰基)高丝氨酸内酯(AHL)来抑制病原体如弧菌中的细胞间信号传递的酶为基础选择。
在本发明的一个实施方案中，所述降解或消化病原体的信号分子而发生的抑制作用联合在虾、鱼、软体动物和其它水生动物肠道内和它们的外表面如甲壳动物的外壳上、软体动物的软组织上的和鱼的粘液层中竞争营养成分和结合位点，从而既抑制致病基因的表达又降低这些表面上的致病菌如弧菌的数量。
在所述生物活性食品复合物和常规动物饲料的制备过程中同时进行加热和加压足以启动(激活)杆菌芽孢的萌发，只要制备温度优选地维持在100℃以下。通过将微生物的可溶性内容物如酵母抽提物添加到颗粒中来提供在生物活性食品复合物或饲料发生水合作用以后能够激活萌发的丙氨酸和其它氨基酸，进一步促进其发育。
在本发明的优选实施方案中，乳浊液-1中的或生物活性食品复合物中的杆菌菌种的芽孢和干营养细胞以及其它的生物活性化合物，尤其是信号分子如HSL和AHL调节的特定群体数量感知过程的抑制剂被作为外层包衣添加到水生生物或挤压的饲料上。通过杆菌属益生菌的竞争和抑制，减少了动物的肠道、体表和/或环境内的革兰氏阴性和革兰氏阳性病原体的数量从而抑制了病原菌的种群数量感知并由于病原体数量的减少而抑制了这些病原体的致病基因的激活。本发明防止病原体的群体密度超过激活致病基因的最低阈值。通过利用本发明的竞争营养、空间并直接杀死病原体的益生菌将病原体的数量保持在低水平来抑制群体感受的调节基因，使致病基因不进行表达从而不产生疾病。
由于本发明提供共同发挥作用最有效的组合方法或机制，所以本发明的方法不同于其它方法。例如如果单独使用抑制性呋喃酮或者HSL和AHL调节分子受到破坏或被消化而没有通过本发明的益生菌竞争性排除或直接抑制病原体，那么病原体的生长就得不到抑制，而只是抑制了致病基因的表达，因此，如果突然停止抑制性呋喃酮的供给，例如如果养殖者用完了经呋喃酮处理的饲料，则出现群体感受而且将分泌致病因子，结果导致疾病而造成动物死亡。杆菌具有两方面的作用(1)由杆菌产生的酶将降解由病原体如弧菌产生的HSL和AHL并且抑制致病基因的表达；(2)病原体如弧菌的数量由于抑制作用和食物和其它资源的竞争而被减少，因此，低群体密度意味不存在特定数量的种群，即所述病原体的数量太低以致于HSL或AHL化合物的浓度太低而无效。结果是致病基因不能进行表达。不能导致疾病。
益生菌竞争营养，因此抑制病原体的快速生长。当病原体含有对由益生菌产生的抗生素由抗性的基因时，单独使用所述益生菌没有效。在本发明的一个较其它过程优选的实施方案中，当益生菌和特定种群数量感知机制一起使用时，较低数量的益生细菌就能有效，从而使得产品的制备简单而成本低。而且，一种病原体更不可能对所有使用的杆菌属菌产生的抗生素产生抗性，而且还避免降解病原体信号分子的酶的作用。
在优选的实施方案中，本发明的乳浊液-1是油包固体的乳浊液，该乳浊液由形成分散相的生物活性物质和粉状的营养饲料以及形成连续相的溶有脂溶性生物活性化合物的食用油组成。在本发明的优选实施方案中，所述油相含有抑制性呋喃酮和其它的生物活性脂溶性化合物。所述油制剂是通过将下列一种或多种混合到食用油中来制备的重量百分含量约为0.0001-50％的脂溶性生物活性化合物如抑制性呋喃酮、重量百分含量约为0.5-5％的乳化剂如Santone(Van DenBergh Food Ingr.)、重量百分含量约为1-10％的卵磷脂、重量百分含量约为1-10％的胆固醇、重量百分含量约为0.01-0.05％的抗氧化剂如乙氧喹、每千克油约2000至8000IU的维生素A、每千克油约1000至4000IU的维生素D3、每千克油约2000至8000IU的维生素E(α-生育酚)、每千克油约20至80mg的维生素K(甲萘醌)、每千克油约2000至8000IU的β-胡萝卜素和每千克油约500至2000mg的虾青素。
典型的食用油包括精炼鲱鱼油、鲑鱼油、凤尾鱼油、沙丁鱼油、金枪鱼油、鲭鱼油、细鳞胡瓜鱼油、鱿鱼油、绿鳕鱼油、鳕鱼肝油、食用鱼油添加剂如Promega(Warner-Lambert公司)，大豆油、红花油、玉米油、棕榈仁油和其它食用油。所述油制品含有总浓度大于约1％重量百分含量的ω-3脂肪酸、总浓度大于约0.1％重量百分含量的二十碳五烯酸(EPA)和总浓度大于约0.1％重量百分含量的二十二碳六烯酸(DHA)。为了制备乳浊液-1，在加入粉状营养饲料和生物活性物质之前，将所述油混合物加热到约25-40℃。
按需要，为提供不同水生生物品种、特定品种的不同生活周期阶段或不同水产养殖应用如常规饲养或在不利时期如后幼体或鱼苗从孵化处向养殖池塘运输时增强对防御和免疫系统的刺激所需的必需食物成分、能量和生物活性物质，可以对乳浊液-1的固相组合物进行调整，所述固相组合物由粉状营养饲料和生物活性物质组成。可以对下列乳浊液-1的固相组合物进行调整来实现更宽范围地应用动物的生物活性食品复合物。
乳浊液-1的固相由下列成分中的一种或多种组成重量百分含量约为0.1-95％的细菌芽孢、细菌细胞壁、细菌细胞、包括但不限于乳酸杆菌、杆菌、链球菌、双歧杆菌、明串珠菌(Leuconostor)和交替单胞菌(Alteromonad)；重量百分含量约为0.1-50％的酵母抽提物、酵母细胞壁、食用酵母、啤酒酵母、包括但不限于圆酵母和Phaffia酵母的酵母细胞；重量百分含量约为1-80％的藻类细胞制品、藻类细胞包括但不限于鞭毛藻、Schizochytrium、杜氏藻、角毛藻、Tetraselmis、骨条藻、Nannochloropsis、海链藻、褐指藻、等鞭金藻、Paylova；重量百分含量约为0.01-50％的包括但不限于抗生素如Sarafin，瑞吡司特，土霉素的药剂；粉状饲料，其浓度被调节用来满足动物饮食需要，包括重量百分含量约为0-95％的动物蛋白产品；重量百分含量约为0-95％的植物蛋白产品；重量百分含量约为0-25％的禽蛋产品；约40-60mg/kg的维生素B12；约5-20mg/kg的D-生物素；约250-350mg/kg的D-泛酸；约10-30mg/kg的叶酸；约1000-4000mg/kg的L-抗坏血酸-2-多磷酸脂(STAY-C，维生素C的稳定形式)；约3000-4000mg/kg的肌醇；约600-800mg/kg的烟酸；约350-450mg/kg的对氨基苯甲酸；约40-60mg/kg的盐酸吡哆素；约125-175mg/kg的核黄素；约50-80mg/kg的氯化硫胺；约6500-7500mg/kg的氯化胆碱。
通过将固体成分以约0.01∶1至100∶1，优选0.1∶1至3∶1的比例混合到油混合物中来制备乳浊液-1，该乳浊液-1取决于所述固体与油组分的相对浓度既可以是油包固体乳浊液也可以是固体包油如浊液。乳浊液-1是稳定的并且在20-25℃下保存至少3小时而不发生相的分离。
根据所述生物活性食品复合物的应用情况，以约5至65％的重量百分含量将乳浊液-1混合到水胶体聚合物中来制备乳浊液-2。对于幼虾来说，优选的组成是水胶体聚合物中的乳浊液-1的重量百分含量约为35-45％。乳浊液-2的连续相由在45-85℃的去离子水中形成的重量百分含量约为0.5-4.0％藻酸钠或κ卡拉胶聚合物组成。所述藻酸盐或卡拉胶聚合物可以以约0.1-3.5％的重量百分含量与水中溶解或分散的明胶、玉米蛋白、多熔素、聚精氨酸、壳聚糖、阿拉伯胶或槐树豆胶制品进行混合从而增加了用于水生生物进行蛋白水解消化的位点并且改进了凝胶基质的构型以及结合强度。所述藻酸盐或卡拉胶相对多肽或蛋白质如明胶或其它水胶体或树胶如槐树豆胶或壳聚糖的比例约为2∶1至约10∶1。
当藻酸钠被用作乳浊液-2的连续相时，将含水介质调节到约pH12以便保证藻酸盐分子带负电从而与钙发生反应形成藻酸钙基质。对于κ卡拉胶聚合物，钾是优选离子，与该聚合物反应从而形成钾卡拉胶复合物。当与钙或钾络合时，含有乳浊液-2的连续相的聚合物或聚合物混合物用来包封或包埋乳浊液-1。
本发明的另一方面，在形成离子型凝胶基质之前，通过以1-50％的重量百分含量将易碎的物质轻轻混合到乳浊液-2中来而将较易碎的生物活性组分如无脊椎生物胚胎或无脊椎生物包埋在乳浊液-2中。所述易碎的物质可以包括任何适当的活的、冷冻的或冻干的后生动物、原生动物或其它微生物或植物或动物组织，条件是所述细胞结构保持相对完整从而含有细胞内的生物活性组分如球蛋白或其它水溶性化合物。优选的物质包括胚胎、幼体、新生动物或成年的枝角目动物如水蚤、轮虫如臂尾轮虫、去壳的Artemia cysts、线虫、寡毛虫、多毛虫或昆虫。
在优选实施方案的另一方面中，所述生物活性食品复合物的大小和形状被制备得与目的水生动物品种的进食机制和行为特性相适应。例如，在幼体悬浮喂料器中，微胶囊或珠子可以通过用氮气将乳浊液-2雾化到重量百分含量约为5-20％的氯化钙的浸液中并收集尺寸范围约为20-200mu的凝胶微胶囊来制得。对于以活猎物或腐质为食的幼体和后幼体动物来说，微胶囊可被制成约100-1000mu的尺寸。湿法筛选被用来收集所需尺寸的微胶囊或珠子。
对于以虫为食的水生动物来说，可以制得类似于大小约0.2mm-20mm(周长)×0.1cm-25cm(长度)的线虫、寡毛虫或多毛虫的蠕虫状或条形。通过将乳浊液-2挤压到重量百分含量为5-20％的氯化钙浸液中来制成条状物。对于动物如海胆、蜗牛、鲍或其它以水生植物为食的动物来说，可以制成约0.1cm-1.0cm(厚度)×1.0-100cm(宽度)×1.0cm-100cm(长度)大小的片状物。可以通过利用适当形状的模具(例如不锈钢的或塑料的)来制备凝胶从而制得片状物，之后浸没在重量百分含量为5-20％的氯化钙中。
所述生物活性食品复合物能在重量百分含量约为10-25％的氯化钙、氯化钠、氯化钾或其它盐溶液中以半固体浆液进行保存而不需干燥。可以添加霉菌抑制剂如甘油、丙二醇或丙酸来保存湿产品。在本发明的另一方面，在-5℃或更低的温度下对所述生物活性食品复合物进行冷冻之前，以占最终制品约1-50％的的重量百分含量使用防冻剂如二甲亚砜(DMSO)、甘油、丁基化羟基甲苯(BHT)、蔗糖、棉子糖、甘露醇、乙二醇、丙二醇、甲醇、1，2-丙二醇、1，3-丁二醇、2，3-丁烯二醇。
所述生物活性食品复合物不需要冷冻而能以湿物质的形式保存在约25℃的标准室温下，或者当需要保持缺乏保护性细胞壁或坚硬膜的软体无脊椎生物、胚胎或其它生物活性细胞的结构完整性时，可以借助防冻剂进行冷冻保存。
在控制疾病的过程中，所述生物活性食品复合物释放益生菌、用于降解或消化特定种群敏感分子的酶和抑制性呋喃酮化合物，作为水生动物饲料产品的一部分。所述生物活性食品复合物直接添加到水生生物品种的存放容器如虾孵化处的幼体养殖槽中，所述生物活性食品复合物在该槽中被吞食。咀嚼和消化所述生物活性食品复合物时，益生菌的芽孢将变成水合形式并萌发为活化状态。以干营养细胞形式传递的益生菌在饲料、肠内和粪便和假粪便中将会萌发得更快而且开始生长。同时，所述抑制性呋喃酮将被释放到肠道内而随后通过粪便和假粪便被释放到圈养系统环境中。益生杆菌开始生长并在损害病原体的情况下竞争空间和食物并且通过原位产生抗生素来抑制病原体的生长。包含于本发明的其它杆菌菌株将产生降解或消化存在于微环境中的HSL和AHL信号分子的酶。呋喃酮将抑制受HSL和AHL调节的致病基因在病原体如弧菌体内的表达。
益生菌和抑制性呋喃酮的共同作用将在孵化环境和其它水生环境中提供最有效的控制疾病的方法。所述生物活性食品复合物为幼虾正常生长和存活所需提供必需微量和大量营养物质从而消除了使用鲜活食物的需要。
应用于水产养殖培育和生长期的传统饲料时，本发明的乳浊液-1或生物活性食品复合物可以包含于常规加工的水生生物饲料如颗粒的表层涂裹层或包衣中。以生物活性食品复合物作为表层制剂的活性成分时，将其混合到用作表层的食用油中，在油中形成悬浮液，然后在包装前将所述悬浮液喷涂或涂裹在饲料颗粒上。或者，直接用乳浊液-1喷涂或包裹所述颗粒，而将乳浊液-1直接用作颗粒饲料的表层。
美国专利US4,352,883描述了在藻酸钠中形成活细胞的悬浮液，然后将该悬浮液滴加到藻酸钙的浸液中从而在藻酸钙中形成固定化的细胞络合物，该络合物进一步与多熔素络合形成比藻酸钙络合物更稳定的聚电解质络合物。该专利的细胞固定化与本发明的主要区别在于(1)该专利中记载的物质不是两相乳浊液系统而只涉及包埋前悬浮在水胶体聚合物中的活细胞；(2)该专利中记载的物质除了动物直接食用的生物活性物质外，不包括本发明配制的用于提供作为动物食品或饲料的营养成分的营养物质。
Sefton和Broughton Biochimica et Biophysica Acta，7171，473(1982)(聚合物科学和工程的百科全书(Encyclopedia ofPolymer Science and Engineering)，/第9卷，第2版(1987))置备了油包水乳浊液，该乳浊液具有分散于水相中的细胞和作为油相的邻苯二甲酸二乙酯。该一级乳浊液被乳化在矿物油中，其中矿物油只是用来形成二级乳浊液。该过程与本发明的主要差别在于本发明中的食用油起的作用是(1)作为动物吸收的必需营养成分和生物活性物质的来源，(2)作为疏水性包衣从而防止有机物质流失到水生环境当中，和(3)作为乳浊液-1的连续相。
美国专利US5,776,490是利用被包含在复合的、交联的蛋白微胶囊中的而不是离子型交联的藻酸钙和明胶的水胶体基质中的LWM对CXM概念的改变。乳浊液-1可被用来取代该发明的LWM。
实施例已经从总体上对本发明进行了描述，通过参照特定实施例可以获得对本发明的进一步理解，除非另有说明，由本文提供的这些实施例只是为了说明目的而不是为了对本发明进行限制。
表1.生物活性食品复合产品的组成实例
实施例2乳浊液-1含有用作如通过造粒和挤压所制备的传统动物饲料的表层包衣的生物活性食品复合物，所述乳浊液-1通过混合2500克表2所列的含有鱼油与脂溶性生物活性化合物如抑制性呋喃酮的脂类混合物制备。然后将脂类混合物与1000克的饲料混合物进行混合，所述混合物含有表2列出的益生细菌和/或其它生物活性化合物。充分混合物所述混合物从而形成乳浊液-1，该实施例中的乳浊液-1是油包固体乳浊液，其连续相为脂类混合物且分散相为饲料混合物。然后通过喷雾或包衣方法以每公吨动物饲料约1至300kg的油乳浊液的浓度来施用全部的乳浊液，优选地以每公吨动物饲料约10至80kg的油乳浊液的浓度进行施用。在该实施例中，将本发明的生物活性化合物用于传统的颗粒或挤压或其它饲料不需要第二种乳浊液，所述饲料已经被制得并且可以用乳浊液-1来包裹。在预防疾病过程中，采用已经被本发明的生物活性乳浊液包衣的传统饲料饲养水生牲畜如虾或鱼。作为本发明饲料混合物的一部分使用的益生细菌在水中和虾的Gl道中萌发并生长，其中一些所选菌株产生抗病原体如弧菌的抗生素并且与病原体竞争空间和营养，而本发明的其它所选菌株产生降解或消化病原体的特定种群敏感信号分子如HSL和AHL的酶。同时，通过本发明的乳浊液-1携带和传递的抑制性呋喃酮抑制由病原体的信号分子如HSL和AHL调控的特定种群敏感过程。通过施用本发明的生物活性化合物和应用本发明的这些不同机制，疾病得到了有效的预防。
表2.用作颗粒状饲料的生物活性表层的乳浊液-1的组成实施
显然，按照上述教导有可能对本发明作出多种改进和改变。因此应当理解为在所附的权利要求的范围内，可以不按本文中的具体描述实施本发明。
权利要求
1.在水生动物中控制和/或预防疾病的方法，其包括给水生动物喂食含有至少一种益生细菌和至少一种抑制性或调节性化合物的组合物。
2.权利要求1的方法，其中所述益生细菌和抑制性或调节性化合物整合于动物饲料中，该饲料加入到含有水生动物的水中。
3.权利要求1的方法，其中所述益生细菌和抑制性或调节性化合物作为生物活性食品复合物的乳浊液-1整合于动物饲料中，所述乳浊液-1用作动物饲料的表层包衣。
4.权利要求1的方法，其中所述益生细菌和抑制性或调节性化合物通过加到生物活性食品复合物中而整合到水生动物的饲料当中，所述生物活性食品复合物用作完全饲料并直接加到水生动物的圈养系统如养鱼池、槽、笼子、水道、池塘或其它圈养形式中。
5.权利要求1的方法，其中所述益生细菌和抑制性或调节性化合物作为生物活性食品复合物的乳浊液-1而应用于水生动物饲料，其中所述生物活性食品复合物用作水生动物饲料的表层包衣。
6.权利要求1的方法，其中所述益生细菌选自包括但不限于枯草芽孢杆菌、侧孢芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、产氮芽孢杆菌、环状芽孢杆菌、短小芽孢杆菌、坚强芽孢杆菌、多粘类芽孢杆菌、浸麻类芽孢杆菌、交替单胞菌属菌的细菌菌株。
7.权利要求1的方法，其中所述抑制性化合物是呋喃酮或其它的脂溶性生物活性化合物。
8.权利要求1的方法，其中被控制的病原体是包括但不限于哈氏弧菌、副溶血弧菌、灿烂弧菌、最小弧菌、霍乱弧菌、解藻朊酸弧菌、鳗弧菌、其它弧菌属菌、气单胞菌属菌的革兰氏阴性菌。
9.权利要求1的方法，其中被控制的病原体是包括但不限于链球菌、心杆菌、微球菌等的革兰氏阳性菌。
10.权利要求1的方法，其中病原体的控制发生在动物消化道9中。
11.权利要求1的方法，其中病原体的控制发生在包括饲料容器、饲料盘、围栏、厩、养鱼池、槽、笼子、水道、池塘的动物的环境内，以及这些环境和其它圈养系统的水、表面和沉积物中。
12.制备生物活性食品复合物的方法，包括制备第一乳浊液(乳浊液-1)，该第一乳浊液含有油包固体或固体包油的乳浊液，该乳浊液由形成固相的生物活性物质和粉状营养物和溶解在形成油相的食用油中的脂溶性生物活性化合物组成，以及制备第二种乳浊液，该第二种乳浊液含有聚合物包油或聚合物包固体的乳浊液，其中分散相含乳浊液-1且水胶体聚合物作为连续相，并且使所述水胶体聚合物暴露给离子，从而离子交联所述聚合物而形成物理学稳定的凝胶基质，将乳浊液-1包埋在第二种乳浊液中，从而制得生物活性复合物。
13.权利要求12的方法，其中第一种乳浊液的油相选自鱼油、精炼鱼油和植物油并且含有脂溶性生物活性化合物。
14.权利要求13的方法，其中所述脂溶性生物活性化合物是抑制性呋喃酮(anfuranone)且所述油选自鲱鱼油、鲑鱼油、凤尾鱼油、沙丁鱼油、金枪鱼油、鲭鱼油、细鳞胡瓜鱼油、鱿鱼油、绿鳕鱼油、鳕鱼油、食用鱼油添加剂、大豆油、红花油、玉米油和棕榈仁油。
15.权利要求12的方法，其中第二种乳浊液的连续相聚合物由重量百分含量约为0.5-4.0％的聚合物组成，所述聚合物选自藻酸盐和卡拉胶聚合物。
16.权利要求12的方法，其中第二种乳浊液的连续相聚合物于45-85℃通过添加至少一种选自钠、钾和钙离子的离子在去离子水中制得。
17.权利要求12的方法，其中所述聚合物以在水中约0.1-3.5％的重量百分含量与选自明胶、玉米蛋白、多熔素、聚精氨酸、壳聚糖、阿拉伯胶和槐树豆胶制品的成分混合。
18.权利要求12的方法，其中所述固体与油的重量比例在约0.01∶1至100∶1之间，优选在0.1∶1至3∶1之间。
19.权利要求13的方法，其中向油中加入了至少一种选自卵磷脂、胆固醇、和乳化剂、抗氧化剂、脂溶性维生素和虾青素的物质。
20.权利要求13的方法，其中所述油含有混合物，该混合物含有食用油、重量百分含量约为0.0001至50％的脂溶性生物活性化合物如抑制性呋喃酮、重量百分含量为0.5至5％的乳化剂、重量百分含量约为1至10％的卵磷脂、重量百分含量约为1至10％的胆固醇和重量百分含量约为0.01至0.5％的抗氧化剂。
21.权利要求20的方法，其中所述油含有每千克约2000至8000IU的维生素A、约1000至4000IU的维生素D3、约2000至8000IU的维生素E、约20至80mg的维生素K和约2000mg的虾青素。
22.权利要求13的方法，其中所述油含有重量百分含量大于1％的ω-3脂肪酸、重量百分含量大于0.1％的二十碳五烯酸和重量百分含量大于0.1％的二十二碳六烯酸。
23.权利要求13的方法，其中在添加所述的生物活性物质和粉状营养物前将所述油加热到25至40℃。
24.权利要求12的方法，其中所述生物活性物质和粉状营养物是选自细菌芽孢、细菌细胞壁、细菌细胞、酵母细胞壁、酵母抽提物、食用酵母、啤酒酵母、酵母细胞和藻类细胞中的至少一种。
25.权利要求24的方法，其中所述细菌细胞是至少一种选自杆菌、乳酸杆菌、链球菌、双歧杆菌、明串珠菌和交替单胞菌的细菌。
26.权利要求12的方法，其中所述油相在加入粉状营养物和生物活性物质之前含有总浓度大于约1％重量百分含量的ω-3脂肪酸、总浓度大于约0.1％重量百分含量的二十碳五烯酸(EPA)和总浓度大于约0.1％重量百分含量的二十二碳六烯酸(DHA)。
27.权利要求24的方法，其中所述藻类细胞是至少一种选自包括但不限于鞭毛藻、Schizochytrium、杜氏藻、角毛藻、Tetraselmis、骨条藻、Nannochloropsis、海链藻、褐指藻、等鞭金藻、Pavlova的藻类细胞
28.权利要求12的方法，其中所述第一种乳浊液的固相含有选自细菌物质、酵母物质、藻类物质、药剂物质、动物蛋白产品、植物蛋白产品和禽蛋产品的固体物质。
29.权利要求12的方法，其中所述第一种乳浊液的固相含有选自细菌物质、酵母物质、藻类物质、药剂、粉状饲料、动物蛋白产品、植物蛋白产品、禽蛋产品、维生素B12、D-生物素、D-泛酸、叶酸、L-抗坏血酸-2-多磷酸脂、肌醇、烟酸、对氨基苯甲酸、盐酸吡哆素、核黄素、氯化硫胺和氯化胆碱的固体物质，其中所述细菌物质选自细菌芽孢、细菌细胞壁和细菌细胞；所述酵母物质选自酵母细胞壁、酵母抽提物、食用酵母、啤酒酵母、酵母细胞。
30.权利要求29的方法，其中所述第一种乳浊液的固相含有选自乳酸杆菌、杆菌、链球菌、双歧杆菌、明串珠菌和交替单胞菌的细菌物质。
31.权利要求30的方法，其中所述细菌物质以占固相的0.1-95％的重量百分含量存在。
32.权利要求28的方法，其中所述第一种乳浊液的固相含有重量百分含量约为0.1-50％的选自圆酵母和Phaffia的酵母物质。
33.权利要求28的方法，其中所述酵母物质以占固相的0.1-50％的重量百分含量存在。
34.权利要求28的方法，其中所述第一种乳浊液的固相含有选自鞭毛藻、Schizochytrium、杜氏藻、角毛藻、Tetraselmis、骨条藻、Nannochloropsis、海链藻、褐指藻、等鞭金藻和Pavlova的藻类物质。
35.权利要求34的方法，其中所述酵母物质以占固相的1-80％的重量百分含量存在。
36.权利要求31的方法，其中所述第一种乳浊液的固相含有选自Sarafin，瑞吡司特和土霉素的抗生素。
37.权利要求36的方法，其中所述抗生素以占固相的0.01-50％的重量百分含量存在。
38.权利要求31的方法，其中所述第一种乳浊液的固相以占固相的0-95％的重量百分含量含有动物蛋白产品。
39.权利要求31的方法，其中所述第一种乳浊液的固相以占固相的0-95％的重量百分含量含有植物蛋白产品。
40.权利要求31的方法，其中所述第一种乳浊液的固相以占固相的0-25％的重量百分含量含有禽蛋产品。
41.权利要求29的方法，其中所述第一种乳浊液的固相含有约40-60mg/kg的维生素B12；约5-20mg/kg的D-生物素；约250-350mg/kg的D-泛酸；约10-30mg/kg的叶酸；约1000-4000mg/kg的L-抗坏血酸-2-多磷酸脂(STAY-C，维生素C的稳定形式)；约3000-4000mg/kg的肌醇；约600-800mg/kg的烟酸；约350-450mg/kg的对氨基苯甲酸；约40-60mg/kg的盐酸吡哆素；约125-175mg/kg的核黄素；约50-80mg/kg的氯化硫胺和约6500-7500mg/kg的氯化胆碱。
42.权利要求12的方法，其中将较易碎的生物活性组分包埋在第二种乳浊液中。
43.权利要求42的方法，其中所述较易碎的生物活性组分选自无脊椎生物胚胎和无脊椎生物。
44.权利要求42的方法，其中所述较易碎的生物活性组分选自活的后生动物、冷冻的后生动物、冻干的后生动物、活的原生动物、冷冻的原生动物、冻干的原生动物、活的植物或动物组织、冷冻的植物或动物组织和冻干的植物或动物组织。
45.权利要求42的方法，其中所述较易碎的生物活性组分选自枝角动物的胚胎、幼体、新生儿和成年体。
46.权利要求41的方法，其中所述较易碎的生物活性组分选自水蚤、轮虫、去壳的Artemia cysts、线虫、寡毛虫、多毛虫和昆虫。
47.权利要求46的方法，其中所述轮虫是臂尾轮虫。
48.用于饲养水生动物的生物活性食品复合物，由以下成分组成第一种乳浊液(乳浊液-1)，为油包固体或固体包油的乳浊液，其生物活性物质和粉状营养物形成固相而脂溶性生物活性化合物溶解于形成油相的食用油；以及第二种乳浊液，由聚合物包油或聚合物包固体的乳浊液组成，其中由乳浊液-1组成分散相而水胶体聚合物作为连续相；将该复合物暴露于离子，从而使得水胶体聚合物离子交联形成物理学稳定的凝胶基质，乳浊液-1包埋于第二种乳浊液中，从而构成生物活性复合物。
49.权利要求48的生物活性食品复合物，其中所述第二乳浊液的连续相聚合物由重量百分含量约为0.5-4.0％的聚合物组成，该聚合物选自藻酸盐和卡拉胶聚合物而且其中所述聚合物通过添加选自钠、钾和钙的离子而交联。
50.权利要求48的生物活性食品复合物，其中所述第一种乳浊液的油相选自鱼油、精炼鱼油和植物油。
51.权利要求48的生物活性食品复合物，其中所述油相选自鲱鱼油、鲑鱼油、凤尾鱼油、沙丁鱼油、金枪鱼油、鲭鱼油、细鳞胡瓜鱼油、鱿鱼油、绿鳕鱼油、鳕鱼油、食用鱼油添加剂、大豆油、红花油、玉米油和棕榈仁油。
52.权利要求48的生物活性食品复合物，其中所述固体与油的重量比例在约0.01∶1至100∶1之间，优选0.1∶1至3∶1。
53.权利要求52的生物活性食品复合物，其中向油中加入至少一种选自卵磷脂、胆固醇、乳化剂、抗氧化剂、脂溶性维生素和虾青素的物质。
54.权利要求48的生物活性食品复合物，其中构成所述油的混合物包括食用油、重量百分含量约为0.5至5％的乳化剂、重量百分含量约为1至10％的卵磷脂、重量百分含量约为1至10％的胆固醇和重量百分含量约为0.01至0.5％的抗氧化剂。
55.权利要求48的生物活性食品复合物，其中所述油含有每千克约2000至8000IU的维生素A、约1000至4000IU的维生素D3、约2000至8000IU的维生素E、约20至80mg的维生素K和约2000mg的虾青素。
56.权利要求48的生物活性食品复合物，其中所述油含有重量百分含量大于1％的ω-3脂肪酸、重量百分含量大于0.1％的二十碳五烯酸和重量百分含量大于0.1％的二十二碳六烯酸。
57.权利要求48的生物活性食品复合物，其中在添加所述的生物活性物质和粉状营养物前将所述油加热到25至40℃。
58.权利要求48的生物活性食品复合物，其中所述生物活性物质是选自细菌芽孢、细菌细胞壁、细菌细胞、酵母细胞壁、酵母抽提物、食用酵母、啤酒酵母、酵母细胞和藻类细胞的至少一种物质。
59.权利要求58的生物活性食品复合物，其中所述细菌细胞含有至少一种选自乳酸杆菌、杆菌、链球菌、双歧杆菌、明串珠菌和交替单胞菌的细菌。
60.权利要求58的生物活性食品复合物，其中所述生物活性物质含有总浓度大于约1％重量百分含量的ω-3脂肪酸、总浓度大于约0.1％重量百分含量的二十碳五烯酸(EPA)和总浓度大于约0.1％重量百分含量的二十二碳六烯酸(DHA)。
61.权利要求58的生物活性食品复合物，其中所述藻类细胞含有至少一种选自包括但不限于鞭毛藻、Schizochytrium、杜氏藻、角毛藻、Tetraselmis、骨条藻、Nannochloropsis、海链藻、褐指藻、等鞭金藻、Pavlova的藻类细胞
62.权利要求48的生物活性食品复合物，其中所述第一种乳浊液的固相含有选自细菌物质、酵母物质、藻类物质、药剂物质、动物蛋白产品、植物蛋白产品和禽蛋产品的固体物质
63.权利要求48的生物活性食品复合物，其中所述第一种乳浊液的固相含有选自细菌物质、酵母物质、藻类物质、药剂、粉状饲料的固体物质，其中所述细菌物质选自细菌芽孢、细菌细胞壁和细菌细胞；所述酵母物质选自酵母细胞壁、酵母抽提物、食用酵母、啤酒酵母、酵母细胞；所述藻类物质选自藻类细胞制品；所述粉状饲料选自动物蛋白产品、植物蛋白产品、禽蛋产品、维生素B12、D-生物素、D-泛酸、叶酸、L-抗坏血酸-2-多磷酸脂、肌醇、烟酸、对氨基苯甲酸、盐酸吡哆素、核黄素、氯代硫胺和氯化胆碱。
64.权利要求48的生物活性食品复合物，其中所述第一种乳浊液的固相含有选自乳酸杆菌、杆菌、链球菌、双歧杆菌、明串珠菌和交替单胞菌的细菌物质。
65.权利要求64的生物活性食品复合物，其中所述细菌物质以占固相的0.1-95％的重量百分含量存在。
66.权利要求48的生物活性食品复合物，其中所述第一种乳浊液的固相含有重量百分含量约为0.1-50％的选自圆酵母和Phaffia的酵母物质。
67.权利要求66的生物活性食品复合物，其中所述酵母物质以占固相的0.1-50％的重量百分含量存在。
68.权利要求48的生物活性食品复合物，其中所述第一种乳浊液的固相含有选自鞭毛藻、Schizochytrium、杜氏藻、角毛藻、Tetraselmis、骨条藻、Nannochloropsis、海链藻、褐指藻、等鞭金藻和Pavlova的藻类物质。
69.权利要求67的生物活性食品复合物，其中所述以占固相的1-80％的重量百分含量存在。
70.权利要求68的生物活性食品复合物，其中所述第一种乳浊液的固相含有选自Sarafin，瑞吡司特和土霉素的抗生素。
71.权利要求69的生物活性食品复合物，其中所述抗生素以占固相的0.01-50％的重量百分含量存在。
72.权利要求62的生物活性食品复合物，其中所述第一种乳浊液的固相以占固相的0-95％的重量百分含量含有动物蛋白产品。
73.权利要求62的生物活性食品复合物，其中所述第一种乳浊液的固相以占固相的0-95％的重量百分含量含有植物蛋白产品。
74.权利要求62的生物活性食品复合物，其中所述第一种乳浊液的固相以占固相的0-25％的重量百分含量含有禽蛋产品。
75.权利要求62的生物活性食品复合物，其中所述第一种乳浊液的固相含有约40-60mg/kg的维生素B12；约5-20mg/kg的D-生物素；约250-350mg/kg的D-泛酸；约10-30mg/kg的叶酸；约1000-4000mg/kg的L-抗坏血酸-2-多磷酸脂(STAY-C，维生素C的稳定形式)；约3000-4000mg/kg的肌醇；约600-800mg/kg的烟酸；约350-450mg/kg的对氨基苯甲酸；约40-60mg/kg的盐酸吡哆素；约125-175mg/kg的核黄素；约50-80mg/kg的氯代硫胺和约6500-7500mg/kg的氯化胆碱。
76.权利要求48的生物活性食品复合物，其中将较易碎的生物活性组分包埋在第二种乳浊液中。
77.权利要求76的生物活性食品复合物，其中所述较易碎的生物活性组分选自无脊椎生物胚胎和无脊椎生物。
78.权利要求76所述的生物活性食品复合物，其中所述较易碎的生物活性组分选自活的后生动物、冷冻的后生动物、冻干的后生动物、活的原生动物、冷冻的原生动物、冻干的原生动物、活的植物或动物组织、冷冻的动物或植物组织和冻干的植物或动物组织。
79.权利要求76的生物活性食品复合物，其中所述较易碎的生物活性组分选自枝角目动物的胚胎、幼体、新生儿和成年体。
80.权利要求76的生物活性食品复合物，其中所述较易碎的生物活性组分选自水蚤、轮虫、去壳的Artemia cysts、线虫、寡毛虫、多毛虫和昆虫中的一种。
81.权利要求80的生物活性食品复合物，其中所述轮虫是臂尾轮虫。
82.用于饲养水生动物的生物活性食品复合物，该复合物含有第一种乳浊液(乳浊液-1)，为油包固体或固体包油的乳浊液，其生物活性物质和粉状营养物形成固相而食用油形成油相，所述油选自鱼油、精炼鱼油和植物油，所述固体与油的重量比例在约0.01∶1至100∶1之间，优选0.1∶1至3∶1；和第二种乳浊液，含有分散在水胶体中的乳浊液-l，所述乳浊液-1分散在所述的第二种乳浊液中，所述水胶体聚合物作为连续相，所述水胶体聚合物离子交联形成物理学稳定的基质，所述水胶体连续相包括分散的无脊椎生物。
83.权利要求82所述的生物活性食品复合物，其中所述油相选自鲱鱼油、鲑鱼油、凤尾鱼油、沙丁鱼油、金枪鱼油、鲭鱼油、细鳞胡瓜鱼油、鱿鱼油、绿鳕鱼油、鳕鱼油、食用鱼油添加剂、大豆油、红花油、玉米油和棕榈仁油。
84.权利要求83的生物活性食品复合物，其中向油中加入至少一种选自卵磷脂、胆固醇、乳化剂、抗氧化剂、脂溶性维生素和虾青素的物质。
85.权利要求82的生物活性食品复合物，其中构成所述油的混合物含有食用油、重量百分含量约为0.0001至50％的脂溶性生物活性化合物如抑制性呋喃酮、重量百分含量约为0.5至5％的乳化剂、重量百分含量约为1至10％的卵磷脂、重量百分含量约为1至10％的胆固醇和重量百分含量约为0.01至0.5％的抗氧化剂。
86.权利要求82的生物活性食品复合物，其中所述生物活性物质含有至少一种选自细菌芽孢、细菌细胞壁、细菌细胞、酵母细胞壁、酵母抽提物、食用酵母、啤酒酵母、酵母细胞和藻类细胞的物质。
87.权利要求86的生物活性食品复合物，其中所述细菌细胞含有至少一种选自乳酸杆菌、杆菌、链球菌、双歧杆菌、明串珠菌和交替单胞菌的细菌。
88.权利要求86的生物活性食品复合物，其中所述生物活性物质含有总浓度大于约1％重量百分含量的ω-3脂肪酸、总浓度大于约0.1％重量百分含量的二十碳五烯酸(EPA)和总浓度大于约0.1％重量百分含量的二十二碳六烯酸(DHA)。
89.权利要求86的生物活性食品复合物，其中所述藻类细胞含有至少一种选自包括但不限于鞭毛藻、Schizochytrium、杜氏藻、角毛藻、Tetraselmis、骨条藻、Nannochloropsis、海链藻、褐指藻、等鞭金藻、Pavlova的藻类细胞。
90.权利要求82的生物活性食品复合物，其中所述第一种乳浊液的固相含有选自细菌物质、酵母物质、藻类物质、药剂物质、动物蛋白产品、植物蛋白产品和禽蛋产品的固体物质。
91.权利要求82的生物活性食品复合物，其中所述第一种乳浊液的固相含有选自细菌物质、酵母物质、藻类物质、药剂、粉状饲料的固体物质，其中所述细菌物质选自细菌芽孢、细菌细胞壁和细菌细胞；所述酵母物质选自酵母细胞壁、酵母抽提物、食用酵母、啤酒酵母、酵母细胞；所述藻类物质选自藻类细胞制品；所述粉状饲料选自动物蛋白产品、植物蛋白产品、禽蛋产品、维生素B12、D-生物素、D-泛酸、叶酸、L-抗坏血酸-2-多磷酸脂、肌醇、烟酸、对氨基苯甲酸、盐酸吡哆素、核黄素、氯化硫胺和氯化胆碱。
92.权利要求91的生物活性食品复合物，其中水胶体连续相进一步含有分散的无脊椎生物。
全文摘要
本发明涉及生物活性食品复合产品，制备生物复合产品的方法以及利用益生菌和群体数量感受性(quorumsensing)抑制剂如抑制性呋喃酮和其它包含于生物活性食品复合物产品连续相和分散相中的生物活性化合物控制疾病的方法。所述产品含形成第一种乳浊液的油包固体或固体包油的乳浊液，该第一种乳浊液本身被聚合物乳化从而形成聚合物包油或聚合物包固体的乳浊液复合物。所述生物活性复合物由两种乳浊液形成，其中第一种乳浊液作为分散相而水胶体聚合物作为连续相。然后第二种乳浊液复合物交联形成物理学稳定的基质。然后，所述生物活性食品复合物或该生物活性食品复合物的第一种乳浊液将包括益生细菌和群体数量感知性抑制剂分子在内的不同生物活性组分传递到动物如虾或鱼或其它商业饲养的动物的消化道和环境中从而通过包括竞争性排除、直接抑制、消化致病细菌细胞间信号分子和直接抑致高丝氨酸内酯和(酰基)高丝氨酸内酯调控的过程在内的机制的新型组合机制有效地控制了细菌疾病。因此，通过所述新型组合地传递和应用益生细菌和群体数量感受抑制性呋喃酮实现对疾病的有效预防和控制。
文档编号A23K1/16GK1454058SQ01812813
公开日2003年11月5日 申请日期2001年6月22日 优先权日2000年6月23日
发明者D·F·维拉马, D·J·W·莫里亚蒂 申请人:阿夸比奥泰克有限责任公司