专利名称：：毛果杨离体器官再生植株的方法
技术领域：
：本发明属于植物组培再生
技术领域：
，具体涉及毛果杨离体器官再生植株的方法。
背景技术：
：毛果杨主要分布于北美西部，在我国属较难获得的有关材料。2002年美国能源部橡树岭国家实验室(ORNL)和联合基因组研究所(JGI)启动了杨树全基因组的测序计划，其材料来源于毛果杨(尸op"to加'ctocw/w)的一个无性系(Nisqully—l)。本发明人对这个无性系的组织培养进行了深入研究，建立了快速繁殖体系。
发明内容本发明所要解决的技术问题是提供一种毛果杨离体器官再生植株的方法，以填补国内乃至世界空白。为解决上述技术问题，本发明采用的技术方案如下毛果杨离体器官再生植株的方法，将毛果杨的茎段或叶柄在含0.001~0.005mg/LTDZ的MS培养基上培养9~10天，再转接至含0.001~0.002mg/LTDZ的MS培养基上培养14-16天，诱导出不定芽；将诱导出的不定芽继续继代在含0.0010.002mg/LTDZ的MS培养基上进行壮苗，18~22天后，苗高可达45cm，再转接于大量元素为1/2的MS培养基上，1822天可直接生根。其中，优选的技术方案是将毛果杨的茎段或叶柄在含0.003~0.005mg/LTDZ的MS培养基上培养9~10天，再转接至含0.001mg/LTDZ的MS培养基上培养14-16天，诱导出不定芽。更优选的技术方案是将毛果杨的茎段或叶柄在含0.005mg/LTDZ的MS培养基上培养9~10天，再转接至含O.OOlmg/LTDZ的MS培养基上培养14~16天，诱导出不定芽。最优选的技术方案是将毛果杨的茎段或叶柄在含0.005mg/LTDZ的MS培养基上培养10天，再转接至含0.001mg/LTDZ的MS培养基上培养15天，诱导出不定芽。其中，优选的技术方案是将诱导出的不定芽继续继代在含0.001mg/LTDZ的MS培养基上进行壮苗，18~22天后，苗高可达45cm，再转接于大量元素为1/2的MS培养基上，18~22天可直接生根。最优选的技术方案是:将诱导出的不定芽继续继代在含O.OOlmg/LTDZ的MS培养基上进行壮苗，20天后，苗高可达45cm，再转接于大量元素为1/2的MS培养基上，20天可直接生根。3有益效果本发明的毛果杨离体器官再生植株的方法，易于操作和实现，为开展杨树功能基因研究创造了基本条件。具体实施例方式根据下述实施例，可以更好地理解本发明。然而，本领域的技术人员容易理解，实施例所描述的具体的物料配比、培养条件及其结果仅用于说明本发明，而不应当也不会限制权利要求书中所详细描述的本发明。实施例l:不同细胞分裂素对不定芽诱导的影响。1材料与方法1.1材料毛果杨试管苗。1.2方法分别采用无菌苗的茎段、叶柄及叶片诱导不定芽，以MS为基本培养基，附加不同浓度的6-BA(六-节基嘌呤)、TDZ(噻苯隆)、2ip(异戊烯腺嘌呤)和ZT(玉米素)外源激素，蔗糖浓度均为3%(w/w)，pH5.7，光照强度2000Lx，每日光照16h，温度23~28。C。2结果与分析将长为lcm左右的茎段、叶柄及1Xlcm大小的叶片分别接种于MS附加各种细胞分裂素的培养基上，培养20d后结果见表1。由表1可知，三种外植体在MS分别附加4种不同种类细胞分裂素的培养基上均无法直接诱导出不定芽。茎段和叶柄可诱导出愈伤组织，诱导率在0~100%不等，叶片诱导率为零。在含TDZ的培养基上，随着TDZ浓度的增加茎段愈伤组织诱导率可达100%。不同外源激素组合的培养基产生的愈伤组织均有不同程度的玻璃化现象，且随细胞分裂素浓度增加而有所严重。表1不同细胞分裂素对不定芽诱导的影响<table>tableseeoriginaldocumentpage4</column></row><table>(续表1)ZT0.51500ZT1.01501(A)ZT3.01501(A)玻璃化TDZ0扁1501(B)TDZ0.0031504(A3，B1)玻璃化TDZ0.005"010(A5，B5)玻璃化2ip0.011501(A)玻璃化2ip0.051501(A)玻璃化2ip0.102(A1，B1)玻璃化对照，无激素1500注A为茎段端部产生的愈伤组织，B为叶柄端部产生的愈伤组织，C为叶片产生的愈伤组织(无)实施例2:最佳组培再生条件的摸索。鉴于附加TDZ的MS培养基愈伤组织诱导率最高，故选择其进一步试验诱导不定芽。在本试验中因高浓度细胞分裂素易诱导愈伤组织同时也易产生玻璃化现象，故采用高低浓度TDZ相继培养。在含较高浓度TDZ的MS培养基上培养10d左右，当外植体端部出现膨大但尚未产生玻璃化前继代于TDZ较低浓度的MS培养基上，15d左右在膨大的外植体基部可产生大量不定芽，增殖系数为810倍(结果见表2)。由表2可看知，外植体从MS+TDZ0.0010.005mg/L培养10d后转换到MS+TDZ0.001mg/L或MS+TDZ0.002mg/L，不定芽诱导率逐渐提高，由MS+TDZ0.005~0.5mg/L培养10d转换到MS+TDZ0.001mg/L或MS+TDZ0.002mg/L，不定芽随TDZ浓度增加而减少，其中以MS+TDZ0.005mg/L转换到MS+TDZ0.001mg/L不定芽诱导率最高，且无玻璃化现象。将诱导出的不定芽继续继代在MS+TDZ0.001mg/L培养基上进行壮苗，约20d左右苗高可达45cm.。转接于大量元素为1/2的MS培养基上，20d左右可直接生根。表2高低浓度TDZ相继培养对不定芽诱导及玻璃化现象的影响TDZ浓度(mg/L)(培养10d)茎段接种数(个)TDZ浓度(mg/L)(培养15d)不定芽数(个)愈伤组织数(块)玻璃化现象TDZ0.0015TDZO週10无TDZ0.0025TDZO週50无(续表2)TDZ0.0035TDZO.OOl270无TDZ0.005TDZO.OOl460无TDZO.OlTDZO.OOl382少量TDZ0.05TDZO.OOl253较多TDZ0.1TDZO.OOl93较多TDZ0.5TDZO.OOl64多TDZO.OOlTDZO扁60无TDZ0.002TDZ0.002了0无TDZ0.003TDZ0.002132无TDZ0.005TDZ0.002262无TDZO.OlTDZO扁113少量TDZ0.05TDZ0.002了4较多TDZ0.1TDZ0.002了4较多TDZ0.5TDZ0.00284多对照(MS)5MS注玻璃化现象占接种数20%以下为少量，40~60°/。为较多，70%以上为多。权利要求1、毛果杨离体器官再生植株的方法，其特征在于将毛果杨的茎段或叶柄在含0.001～0.005mg/LTDZ的MS培养基上培养9～10天，再转接至含0.001～0.002mg/LTDZ的MS培养基上培养14～16天，诱导出不定芽；将诱导出的不定芽继续继代在含0.001～0.002mg/LTDZ的MS培养基上进行壮苗，18～22天后，苗高可达4～5cm，再转接于大量元素为1/2的MS培养基上，18～22天可直接生根。2、根据权利要求1所述的毛果杨离体器官再生植株的方法，其特征在于将毛果杨的茎段或叶柄在含0.003~0.005mg/LTDZ的MS培养基上培养9~10天，再转接至含0.001mg/LTDZ的MS培养基上培养14~16天，诱导出不定芽。3、根据权利要求2所述的毛果杨离体器官再生植株的方法，其特征在于将毛果杨的茎段或叶柄在含0.005mg/LTDZ的MS培养基上培养9~10天，再转接至含O.OOlmg/LTDZ的MS培养基上培养14~16天，诱导出不定芽。4、根据权利要求3所述的毛果杨离体器官再生植株的方法，其特征在于将毛果杨的茎段或叶柄在含0.005mg/LTDZ的MS培养基上培养10天，再转接至含O.OOlmg/LTDZ的MS培养基上培养15天，诱导出不定芽。5、根据权利要求1所述的毛果杨离体器官再生植株的方法，其特征在于将诱导出的不定芽继续继代在含0.001mg/LTDZ的MS培养基上进行壮苗，18~22天后，苗高可达45cm，再转接于大量元素为1/2的MS培养基上，1822天可直接生根。6、根据权利要求5所述的毛果杨离体器官再生植株的方法，其特征在于将诱导出的不定芽继续继代在含O.OOlmg/LTDZ的MS培养基上进行壮苗，20天后，苗高可达4~5cm，再转接于大量元素为1/2的MS培养基上，20天可直接生根。全文摘要本发明公开了一种毛果杨离体器官再生植株的方法，将毛果杨的茎段或叶柄在含0.001～0.005mg/LTDZ的MS培养基上培养9～10天，再转接至含0.001～0.002mg/LTDZ的MS培养基上培养14～16天，诱导出不定芽；将诱导出的不定芽继续继代在含0.001～0.002mg/LTDZ的MS培养基上进行壮苗，18～22天后，苗高可达4～5cm，再转接于大量元素为1/2的MS培养基上，18～22天可直接生根。本发明的毛果杨离体器官再生植株的方法，易于操作和实现，为开展杨树功能基因研究创造了基本条件。文档编号A01H4/00GK101642049SQ200910035029公开日2010年2月10日申请日期2009年9月14日优先权日2009年9月14日发明者博张,王光萍,王明庥,强程,猛胥,英陈,黄敏仁申请人:南京林业大学