专利名称：一种基于mypt1基因敲除建立新型高血压小鼠模型的方法及其用途的制作方法
技术领域：
本发明涉及到病理学、生理学，遗传学，分子生物学领域。本发明通过基因敲除技术，降低小鼠内源性MYPTl的表达，从而达到使小鼠血压升高的目的。
背景技术：
本发明旨在提供一种建立自发的、可遗传的高血压小鼠模型的方法。高血压是一种严重影响人类健康的疾病，其危害性在于它会导致很多并发症，比如心衰，肾衰，脑中风等，从而导致死亡。目前关于绝大多数高血压病的发病机制并不清楚，这一类疾病被称为原发性高血压。因此，利用动物模型研究高血压疾病可以为人类高血压疾病的诊断、治疗提供
理论基础。目前用来研究高血压动物模型主要有以下几种1、慢性实验性高血压类型；2、神经源性高血压；3、肾源性高血压；4、内分泌性高血压。这些建立高血压模型的方法大多要经过外源性药物或其它方法处理，甚至是通过手术手段，不能完全模拟人类的原发性高血压，而遗传性的高血压模型可以最大程度的模拟临床上原发性的高血压，也高有利于研究高血压的发病机制，治疗药物靶点的设计。另外，遗传性高血压模型个体之间不存在手术操作或者药物剂量导致的差异，其背景高度一致，可以作为新药筛选的有用工具。关于高血压的发生机制目前并不是很清楚。经典理论认为，肾脏功能紊乱是引起高血压关键因素，但是，近几年的研究表明，血管平滑肌病变也可以直接导致高血压的产生。因此，研究血管平滑肌收缩机制及其在高血压发生中的作用，可以为高血压的诊断和治疗提供有效指导。
发明内容
本发明的目的是建立一种高血压小鼠模型，该动物模型血压自发性的升高，稳定性强，并且其高血压性状是可遗传的，与人类原发性高血压类似。本发明还提供了一种建立高血压小鼠模型的方法，即通过在平滑肌组织特异性敲除MYPT1，提高MYPTl底物肌球蛋白调节轻链的磷酸化水平，从而导致血管平滑肌收缩增强，外周血管阻力增大，形成高血压。本发明是通过以下技术方法实现的(I)建立MYPTl敲除模型；(2)测量小鼠尾动脉压；(3)通过小动物成像系统检测小鼠的心功能；(4)用ELISA试剂盒检测小鼠血清中肾素、血管紧张素、醛固酮的浓度；(5)用肌张力仪测量小鼠阻力血管的收缩张力；(6)用尿素甘油胶电泳分析小鼠阻力血管中肌球蛋白调节轻链磷酸化；(7)尾静脉注射高血压药物后检测小鼠的尾动脉压。
图I为建立MYPTl平滑肌特异性敲除小鼠的策略。
图2为MYPTl敲除和对照组小鼠的血压值。㈧成年敲除和对照小鼠的收缩压、舒张压以及平均血压。(B)敲除和对照小鼠的收缩压随年龄增长的变化曲线。图3为ELISA检测的MYPTl敲除和对照组小鼠的血清中肾素(A)、血管紧张素(B)、 醛固酮(C)的浓度，图4为MYPTl敲除和对照组小鼠的心功能参数。图5为MYPTl敲除和对照组小鼠的心率。图6为MYPTl敲除后血管在各种刺激下的收缩张力变化，其中包括124mM氯化钾溶液、IOuM去甲肾上腺素(NE), O. IuM内皮素(ETl)、IOuM血管紧张素(AngII)、IuM加压素 (Vasopressin)、0· IuM 血检素类似物(U46619)。图7为MYPTl敲除后血管中的肌球蛋白磷酸化水平变化。(A、C)分别为氯化钾、 去甲肾上腺素刺激后，肠系膜动脉血管中的RLC的磷酸化检测的结果，(B、D)为统计结果。图8为利用MYPTl敲除小鼠检测降压药药效检测实例。(A)为培哚普利片以 I. 2ug/g小鼠体重尾静脉注射，连续五天注射期间小鼠的收缩压变化。(B)为苯磺酸氨氯地平片以I. 5ug/g小鼠体重尾静脉注射，连续五天注射期间小鼠的收缩压变化。
具体实施例方式本发明的实施步骤说明如下I.平滑肌特异性敲除MYPTl的小鼠模型的构建首先，通过同源重组技术将MYPTl基因的序列从BAC克隆(bMQ 363i09，从Sanger 研究所订购)中套取出来的，用来构建打靶载体。在MYPTl基因的第一个外显子两侧插入两个IoxP位点后，将构建好的打靶载体线性化，然后进行胚胎干细胞电转。通过长片段PCR 和SouthernBlot方法筛选打靶载体与胚胎干细胞基因组发生重组的克隆，然后将阳性的干细胞克隆注射到B6小鼠的囊胚中。通过将注射后嵌合囊胚移植到代孕母鼠的子宫，生下嵌合小鼠。通过双IoxP小鼠与平滑肌特异表达的SMA-Cre转基因小鼠交配可以得到在平滑肌中敲除MYPTl的小鼠。经蛋白免疫印迹实验证明，在成年的MYPTl敲除的小鼠的血管平滑肌中，MYPTl被全部剔除了。2.小鼠血压的测量经以上步骤得到的小鼠，饲养到三到八个月可以用来进行血压测量。本发明中采用的是尾动脉套管法测小鼠血压，所用仪器为上海奥尔科特的无创血压仪。在实验数据采集之前，都要对实验组和对照组小鼠进行为期五天的训练，具体方法为，在每天上午十到十一点，每只小鼠置于32度恒温箱中，连续测十到二十分钟。待到小鼠血压测量稳定后开始采集数据，每只小鼠连续测五天，取平均值作为这只小鼠的血压值，敲除组和对照组小鼠各测十只小鼠做统计。3.血管平滑肌张力测定阻力血管的肌张力是通过丹麦DMT仪器公司的四通道肌张力仪记录的。具体方法为将小鼠的肠系膜二级血管从肠系膜结缔组织中分离出来，剪成I. 4毫米长的血管条，然后用两根20微米直径的细钢丝穿入血管腔，用螺丝固定到连接着传感器的组织浴槽中。然后将血管条以最放松的状态在HEPES-Tyrode (H-T)生理溶液中平衡30分钟，通过调节螺旋测微尺逐步将血管内压调到体内IOOmmHg的张力状态，作为初始张力。在调到基础张力状态后，平衡30分钟，然后用124mM氯化钾H-T溶液或者去甲肾上腺素，血管紧张素等激动剂刺激血管，通过张力传感器实时记录血管收缩力。4. MYPTl底物肌球蛋白调节轻链的磷酸化水平检测肌球蛋白轻链的磷酸化水平是通过尿素甘油胶电泳然后做蛋白免疫印迹检测的。 在肠系膜动脉分离出来后，置于H-T溶液中，在37度平衡30分钟，然后用氯化钾或者去甲肾上腺素刺激，在规定的时间内迅速用液氮冷冻来，置于含IOmM的二硫苏糖醇，4%三氯乙酸的丙酮溶液中，然后置于-80度冷藏。样品提取时，将血管组织取出，换用含10毫摩的二硫苏糖醇，4%三氯乙酸的水溶液中匀浆，然后4000rpm离心三分钟，去上清。在用乙醚吹洗蛋白沉淀三次后，晾干，然后溶于样品溶液中。溶好的蛋白样品通过尿素甘油胶电泳，转膜， 然后用识别肌球蛋白调节轻链的抗体孵育，通过二抗孵育后，用辣根过氧化物酶显影。可以检测到磷酸化的和非磷酸化的肌球蛋白调节轻链的两条带。5.肾素血管紧张素系统测定MYPTl敲除组和对照组的小鼠血清中的肾素、醛固酮、血管紧张素是通过商业化的 ELSIA试剂盒检测的。具体过程如下首先从视网膜下毛细血管丛采血到加有抗凝剂EDTA 的管中，1000g、4度离心15分钟，取上清，分装冻存于-80度冰箱。在做ELISA检测时，将血清加到有肾素、醛固酮或者血管紧张素的96孔板中，孵育洗涤后用辣根过氧化物酶法显色，用酶标仪在450nm波长下读取光吸收值，根据标准曲线换算出每一个样本中的肾素、醛固酮或者血管紧张素浓度。6.心功能检测小鼠的心功能参数是通过Vevo 770 小动物超声成像系统检测的。将小鼠用阿佛汀麻醉后，置于37度加热台上，然后用RMV707B探头检测胸骨旁短轴切面M型超声图像。 读取M型超声图像测量左心室内经切面，计算出射血分数、短轴收缩率、左心室内经参数。7.部分高血压药物检测为了检测降压药物的药效，我们通过尾静脉注射的方法将药物注射到MYPTl敲除组和对照组的小鼠体内，然后测量血压变化情况。经过检测的药物有苯磺酸氨氯地平片，培哚普利片。其中，苯磺酸氨氯地平片在MYPTl敲除的小鼠中降压效果不明显，而培哚普利片可以使对照和敲除组的小鼠的血压都降低。
权利要求
1.一种新的通过MYPTl基因敲除建立高血压小鼠模型的方法，其特征是通过在平滑肌组织中特异性的降低MYPTl表达来实现血压升高。
2.根据权利要求I所述的建立高血压小鼠模型的方法，其特征是通过增加外周血管阻力，从而建立高血压小鼠模型。
3.根据权利要求I所述的建立高血压小鼠模型的方法，其特征是通过调节MYPTl底物肌球蛋白调节轻链(RLC)的磷酸化水平来实现外周血管阻力增大，从而形成高血压。
4.根据权利要求I所述的建立高血压小鼠模型方法，其特征是通过基因敲除技术在平滑肌中特异性地剔除MYPT1，是通过以下方法实现的首先利用同源重组的技术构建打靶载体，在从BAC中套取出含有MYPTl基因的序列，然后在其第一个外显子两侧插入LoxP位点。在构建好打靶载体后，线性化载体，电转到小鼠胚胎干细胞中，使其与胚胎干细胞基因组序列重组。通过长片段PCR和Southern Blot筛选，得到发生重组的阳性克隆。然后将阳性克隆注射到小鼠的囊胚中，移植到代孕母鼠子宫内。等到母鼠生下嵌合鼠后，通过嵌合鼠和B6鼠交配，得到杂合子小鼠。杂合鼠和转基因的SMA-Cre小鼠交配，得到的阳性子代再自交一代，可以得到平滑肌特异性敲除MYPTl的小鼠。
全文摘要
本发明提供了一种通过MYPT1基因敲除而建立的新型高血压小鼠模型的方法。这个高血压小鼠模型是通过在平滑肌中特异性剔除MYPT1基因，提高MYPT1底物肌球蛋白调节轻链(RLC)的磷酸化水平，从而导致外周血管阻力增大，小鼠血压升高。MYPT1敲除小鼠收缩压在3月龄时可达到140mmHg，这种高血压状态可十分稳定地维持到15月龄。该高血压小鼠模型是自发性的、可遗传的，与人类的高血压疾病高度类似。该高血压小鼠是一种研究高血压疾病发生机制的理想模型，也可以作为治疗高血压的新药筛选工具。
文档编号A01K67/027GK102586223SQ20121005886
公开日2012年7月18日 申请日期2012年3月8日 优先权日2012年3月8日
发明者乔艳宁, 何伟奇, 朱敏生 申请人:南京大学