专利名称：沼泽红假单胞菌菌株及应用、菌剂药剂及其制备方法和应用的制作方法
技术领域：
本发明属于生物农药技术领域，尤其涉及一种沼泽红假单胞菌菌株及其药剂在防治水稻病害中的应用。
背景技术：
水稻是我国主要的粮食作物之一，然而水稻病害的持续发生一直影响着水稻生产。稻曲病是水稻主要的病害之一，在世界水稻产区广泛分布并且有逐年加重的趋势，由稻曲病引起的水稻病害每年可造成上亿元的直接经济损失，因此，研究和防治水稻稻曲病刻不容缓。目前，稻曲病的防治主要是采用化学农药防治的方法。化学农药虽具有应用方便、防效较高的优点，但化学农药的过度使用将会产生以下问题①研制新品种化学抗菌药难度加大，费用提高；②抗药性问题越来越严重由于化学杀菌剂的长期使用，使得植物病原菌普遍出现了较高水平的抗药性，其中最常见的是植物病原真菌对杀菌剂的抗药性；抗药性的产生往往导致植物病害的化学防治失败，并且还会给以后的防治带来连锁反应，同时给农业生产带来巨大的损失；③生态污染化学杀菌剂对野生和非靶标生物有毒，环境相容性差，使用甚至滥用化学杀菌剂，将导致大量化学农药流失到生态环境中，对生态系统造成严重的危害；同时，化学农药不易降解，高残留，对人畜极不安全，这些都严重限制了其在将来农业生产上的应用。因此，在推行无公害农药和可持续农业生产的今天，开发研制不易产生抗性、环境相容性较好的生物农药已成为当今农药发展的必然趋势。
发明内容
本发明针对目前农业生产中稻曲病防治难度大、成本高、农药残留、化学抗药性日益突出等问题，目的是要克服现有技术的不足，提供一种生产成本低、无毒、绿色环保、使用方便的沼泽红假单胞菌菌株及其制备的相应菌剂、药剂，并同时提供相应菌剂、药剂的制备方法和应用，该应用可防治水稻稻曲病、提高水稻的抗病性。为解决上述技术问题，本发明提出的技术方案为一株沼泽红假单胞菌菌株，所述沼泽红假单胞菌(Rhodopseudomonas palustris)菌株的名称为沼泽红假单胞菌CS-1 (即Rhodopseudomonas palustris CS-1),具体为一株光合细菌(Photosynthetic Bacterium)菌株，其在中国典型培养物保藏中心(简称CCTCC)的保藏编号为CCTCC No M 2012224，保藏单位地址位于中国武汉大学，保藏日期为2012年6月12日。本发明的上述菌株经菌落和形态观察、染色反应、常规生理生化特征实验以及16SrDNA序列分析，鉴定为是沼泽红假单胞菌属中的光合细菌菌株，上述本发明的光合细菌菌株具有以下主要特征①在表观形态上，菌落表面光滑，成规则圆形，红色，湿润易挑起在生理生化特性上，淀粉水解试验反应阳性，过氧化氢酶试验反应阳性，柠檬酸盐试验反应阳性，G-, V-P反应阴性，甲基红试验反应阴性，吲哚试验反应阴性，脲酶试验反应阴性，革兰氏染色反应阴性；耐盐性良好，氯化钠浓度低于3%能很好生长，4% 7%生长很缓慢，大于7%时不生长；16S rDNA序列长度为1450bp，在Genbank中的登录号为JQ863308。作为一个总的技术构思，本发明提供上述的沼泽红假单胞菌菌株在防治水稻稻曲病或提高水稻体内过氧化氢酶活性中的应用。作为一个总的技术构思，本发明还提供一种沼泽红假单胞菌菌株的生防菌剂，所述生防菌剂是由上述沼泽红假单胞菌菌株经活化、种子培养、生产培养后得到。作为一个总的技术构思，本发明相应提供上述沼泽红假单胞菌菌株的生防菌剂的制备方法，包括以下步骤 (I)活化将上述本发明的沼泽红假单胞菌菌株的保存种按双层平板培养法进行培养，培养至红色单菌落出现；(2)种子培养将步骤(I)培养出的红色单菌落接入至血清瓶中，在温度为30°C 35°C、光照条件为2000Lx 3000Lx条件下，用光合细菌液体培养基培养至对数生长期；(3)生产培养将步骤(2)种子培养后得到的菌液按光合细菌菌株生产培养基总体积的1% 5%的接种量接种到生产瓶中，用光合细菌培养基进行生产培养，在温度为30°C 35°C、光照条件为2000Lx 3000Lx，培养至对数生长期；得到的培养液即为所述沼泽红假单胞菌菌株的生防菌菌剂。作为一个总的技术构思，本发明还提供一种沼泽红假单胞菌菌株的生防药剂，所述生防药剂为上述生防菌剂经发酵、离心后制得的发酵上清液。作为一个总的技术构思，本发明还提供上述生防药剂的制备方法，包括以下步骤将所述沼泽红假单胞菌菌株的生防菌剂发酵培养5d 7d,培养完成后在6000rpm 8000rpm条件下离心2min 4min，收集离心后的上清液，再经细菌过滤器过滤，得到生防药剂。作为一个总的技术构思，本发明还提供另一种沼泽红假单胞菌菌株的生防药剂，所述生防药剂为上述生防菌剂经发酵培养、破碎后制得的菌体破碎液。本发明还相应提供上述第二种生防药剂的制备方法，包括以下步骤(I)将上述沼泽红假单胞菌菌株的生防菌剂发酵培养5d 7d，培养完成后在6000rpm 8000rpm条件下离心4min 8min,弃上清，收集菌体；(2)将步骤(I)中收集的菌体用缓冲液清洗后再置于缓冲液中进行超声波破碎；(3)将经过步骤(2)中超声波破碎后的菌液于2°C 6°C、10000rpm HOOOrpm条件下离心8min 12min,收集的上清液即为生防药剂。上述的制备方法中，超声波破碎时的工艺条件优选为超声波强度控制在200W 400W,破碎8s IOs间隔8s IOs,超声波破碎IOmin 15min。作为一个总的技术构思，本发明提供上述的生防菌剂或生防药剂在防治水稻稻曲病或提高水稻体内过氧化氢酶活性中的应用。与现有技术相比，本发明的优点在于
I、本发明的沼泽红假单胞菌CS-I的培养方法简单，生产成本低，且该菌株可通过简单、快捷、低成本的操作方法制备得到防治水稻稻曲病的生防菌剂及生防药剂；2、本发明菌株制备得到的生防菌剂及药剂不仅对水稻稻曲病害有显著防效，而且具有低毒、对人畜无害、对农作物无药害、绿色环保、使用方便等特点；3、本发明的沼泽红假单胞菌CS-I不但对水稻稻曲病有显著的防效，而且，菌株本身具有多种营养成分及活性物质，能够有效促进作物生长，提高作物体内防御酶活性，能在一定程度上提高作物抗病性。一种沼泽红假单胞菌 CS-1 (Rhodopseudomonas palustris CS-1),其在中国典型培养物保藏中心(简称CCTCC)的保藏编号为CCTCC No M 2012224，保藏单位地址位于中国武汉大学，保藏日期为2012年6月12日。
图I为本发明实施例I中沼泽红假单胞菌CCTCC M 2012224的双层平板培养图。图2为本发明实施例5中沼泽红假单胞菌CS-I生防药剂(发酵上清液)皿内抑制稻曲病菌生长的结果照片，其中a为I : 3，b为I : 2，c为I : l，d为CK，e为3 1，f 为 2 I。图3为本发明实施例5中沼泽红假单胞菌CS-I生防药剂(菌体破碎液)皿内抑制稻曲病菌生长的结果照片，其中a为CK，b为CKt^c为I : 3，d为I : 2，e为3 l，f为
2: 1， g为 I : I。图4为本发明实施例6中沼泽红假单胞菌CS-I生防药剂(发酵上清液)摇瓶内抑制稻曲病菌生长的结果照片，其中a为CK，b为CKtl, c为I : 3，d为I : 2，e为3 1，f 为 2 1，g 为 I : I。图5为本发明实施例6中沼泽红假单胞菌CS-I生防药剂(菌体破碎液)摇瓶内抑制稻曲病菌生长的结果照片，其中a为CK，b为CKtl, c为I : 3，d为I : 2，e为3 1，f 为 2 1，g 为 I : I。图6为本发明实施例8中沼泽红假单胞菌CS-I生防药剂对稻曲病菌致畸作用结果照片，其中，a为CK对照；b为本发明发酵上清液处理过的稻曲病菌菌丝照片。
具体实施例方式以下结合说明书附图和具体优选的实施例对本发明作进一步描述，但并不因此而限制本发明的保护范围。实施例I :一株本发明的沼泽红假单胞菌菌株，其名称为沼泽红假单胞菌CS-1，具体为一株光合细菌菌株，其在中国典型培养物保藏中心的保藏编号为CCTCC No M 2012224，保藏单位地址位于中国武汉大学，保藏日期为2012年6月12日。本发明菌株的初始样品是在2010年11月2日采集于湖南省农业科学院内的一口干涸水塘。当初进行初始样品的采集时，为了保持厌氧环境及样品新鲜，截取了水塘污泥中3cm 4cm深处的沉积物及池塘泥水混合物。将采集来的水样取5ml、水泥样沉淀后取5ml、污泥样用适量的无菌水混匀后取5ml分别加入装有IlOml光合细菌液体培养基的吊瓶中，置于光照强度为7500Lx、温度为30°C的光照培养箱恒温光照培养，定期观察至菌液变红时，分别取出Iml培养液至新鲜光合细菌液体培养基((NH4) 2S040. I %、MgSO4O. 02%, NaHCO3O. 5 %、K2HPO4O. 05%, NaCl O. 02%,酵母膏O. 15%，pH 7. O 7. 2)中，继续培养，如此连续富集三次。用接种环分别沾取富集三代后的培养液，双层平板划线培养，于上述同等条件下培养至平板出现红色菌落。将得到的不同单菌落继续双层平板划线纯化，反复转接3代以上，直至获得纯化的单菌落(本实施例中沼泽红假单胞菌菌株的双层平板培养图参见图I)。本实施例培养筛选的上述菌株经菌落和菌体形态观察、染色反应、常规生理生化特征实验以及16S rDNA基因PCR扩增和序列分析，鉴定为是沼泽红假单胞菌属中的光合细菌菌株，上述本发明的光合细菌菌株具有以下主要特征①在表观形态上，菌落表面光滑，成规则圆形，红色，湿润易挑起在生理生化特性上，淀粉水解试验反应阳性，过氧化氢酶试验反应阳性，柠檬酸盐试验反应阳性，G-, V-P 反应阴性，甲基红试验反应阴性，吲哚试验反应阴性，脲酶试验反应阴性，革兰氏染色反应阴性；耐盐性良好，氯化钠浓度低于3%能很好生长，4% 7%生长很缓慢，大于7%时不生长；16S rDNA序列长度为1450bp，在Genbank中的登录号为JQ863308 (具体鉴定结果参见下表I)。表I :沼泽红假单胞菌CS-I生理生化特征实验结果
特性结果
~淀粉水解试验+
过氧化氢酶实验+
柠檬酸盐试验+
Π引哚试验=
甲基红与V.P试验二
脲酶试验-
革兰氏染色反应一
耐盐性试验氯化钠浓度0% 3%生长良好,4% 7% __生长很缓t曼，>7%时不生长。_注表I中，“ + ”表示反应结果为阳性表示反应结果为阴性。实施例2 :沼泽红假单胞菌CS-I生防菌剂及其制备方法。一种沼泽红假单胞菌菌株的生防菌剂，该生防菌剂是由上述实施例I中获得的沼泽红假单胞菌菌株经活化、种子培养、生产培养后得到。本实施例的生防菌剂的具体制备方法包括以下步骤(I)活化将实施例I的沼泽红假单胞菌CCTCC M 2012224的超低温保存种按双层平板培养法进行培养，培养至红色单菌落出现；采用的光合细菌固体培养基为(NH4)2SO4O. I %, MgSO4O. 02%, NaHCO3O. 5%, K2HPO4O. 05%, NaCl O. 02 %、酵母膏 O. 15% 和琼脂 I. 5%, pH7. O 7· 2 ;(2)种子培养将步骤(I)培养出的红色单菌落接入至容积为120mL左右的血清瓶中，在温度为30°C 35°C、光照条件为2000Lx 3000Lx，用光合细菌液体培养基培养至对数生长期；所用的光合细菌液体培养基为(NH4)2SO4O. I %、MgSO4O. 02%, NaHCO3O. 5%,K2HPO4O. 05%, NaCl O. 02%、酵母膏 O. 15%, pH 7. O 7. 2 ;(3)生产培养将步骤(2)培养得到的菌液按光合细菌菌株生产培养基总体积的1% 5%的接种量接种到生产瓶中，用光合细菌培养基培养，在温度为30°C 35°C、光照条件为2000Lx 3000Lx条件下，培养至对数生长期；(4)出瓶分装将步骤(3)培养得到的培养液出瓶分装得到沼泽红假单胞菌CCTCCM2012224生防菌剂。上述步骤(I) (4)的全流程培养时间为25天，培养结束后，菌体数量达到lX109cfu/mL 以上。实施例3 :沼泽红假单胞菌CS-I生防药剂及其制备方法。一种本发明沼泽红假单胞菌菌株的生防药剂，该生防药剂为实施例2中得到的生防菌剂经发酵、离心后制得的发酵上清液。本实施例的生防药剂的制备方法，具体包括以下步骤取实施例2中制得的生防菌剂再发酵培养6d 8d，得到沼泽红假单胞菌CCTCC M 2012224发酵液，在8000rpm条件下离心2min，收集离心后的上清液，将离心后的上清液用细菌过滤器过滤，得到无光合细菌菌体的无菌发酵上清液，4°C保存备用。实施例4 :沼泽红假单胞菌CS-I生防药剂及其制备方法。一种本发明的沼泽红假单胞菌菌株的生防药剂，该生防药剂为实施例2中得到的生防菌剂经发酵培养、破碎后制得的菌体破碎液。本实施例的生防药剂的制备方法，具体包括以下步骤(I)取实施例2中制得的生防菌剂发酵培养6d，培养完成后在5000rpm条件下离心5min,弃上清,收集菌体；(2)将步骤(I)中收集的菌体用pH = 7. 5的磷酸缓冲液漂洗2 3次，再置于适量的缓冲液中进行超声波破碎；超声波破碎时的工艺条件控制为超声波强度控制在300w，破碎IOs间隔IOs,超声波破碎过程控制在IOmin冰浴；为确定合适的超声次数及强度,应随时镜检观察菌体是否破碎完全；(3)将经过步骤⑵中超声波破碎后的菌液于4°C、12000rpm条件下离心IOmin,将得到的上清液加无菌水定容到和原始培养体积一致，4°C冰箱保存备用。实施例5 :沼泽红假单胞菌CS-I生防药剂抑制稻曲病菌生长应用实验。取上述实施例3、实施例4得到的沼泽红假单胞菌CS-I生防药剂与45°C 50°C熔融态的5XPSA培养基分别按照I : 3、1 2、1 1、2 1、3 I的配比混匀，制成混合平板；以不加入上述生防药剂的PSA的培养基和加入光合细菌培养基的PSA培养基为对照，分别记为CK、Cl。在平板中央接入预先培养12d的直径为6mm的稻曲病菌菌饼，每平板接种一片，每处理重复3次，倒置于28°C恒温箱中恒温培养，逐日观察菌丝的生长情况并记录菌落直径的大小，按照下列公式计算抑菌率抑菌率(％ )=(对照菌落直径-处理菌落直径)/对照菌落直径X 100 %，菌落直径单位厘米(cm)。经过观察、检测和实验分析后，实施例3得到的沼泽红假单胞菌CS-I生防药剂(发酵上清液)对稻曲病菌皿内生长的抑制作用实验结果如下表2所示(皿内抑制稻曲病菌生长应用实验的结果照片参见图2)，实施例4得到的沼泽红假单胞菌CS-I生防药剂(菌体破碎液)对稻曲病菌皿内生长的抑制作用实验结果如下表3所示(皿内抑制稻曲病菌生长应用实验的结果照片参见图3)。表2 :沼泽红假单胞菌CS-I的生防药剂(发酵上清液)对稻曲病菌皿内生长的抑制作用
权利要求
1.一株沼泽红假单胞菌菌株，其特征在于所述沼泽红假单胞菌(Rhodopseudomonaspalustris)菌株的名称为沼泽红假单胞菌CS-1,其在中国典型培养物保藏中心的保藏编号为 CCTCC No M 2012224。
2.一种如权利要求I所述的沼泽红假单胞菌菌株在防治水稻稻曲病或提高水稻体内过氧化氢酶活性中的应用。
3.—种沼泽红假单胞菌菌株的生防菌剂，其特征在于所述生防菌剂是由权利要求I所述沼泽红假单胞菌菌株经活化、种子培养、生产培养后得到。
4.一种沼泽红假单胞菌菌株的生防菌剂的制备方法，包括以下步骤 (1)活化将权利要求I所述沼泽红假单胞菌菌株的保存种按双层平板培养法进行培养，培养至红色单菌落出现； (2)种子培养将步骤(I)培养出的红色单菌落接入至血清瓶中，在温度为30°C 35°C、光照条件为2000Lx 3000Lx、自然pH条件下，用光合细菌液体培养基培养至对数生长期； (3)生产培养将步骤(2)种子培养后得到的菌液按光合细菌菌株生产培养基总体积的1% 5%的接种量接种到生产瓶中，用光合细菌培养基进行生产培养，在温度为30°C 35°C、光照条件为2000LX 3000LX，培养至对数生长期；得到的培养液即为所述沼泽红假单胞菌菌株的生防菌剂。
5.一种沼泽红假单胞菌菌株的生防药剂，所述生防药剂为权利要求3所述生防菌剂经发酵、离心后制得的发酵上清液。
6.一种如权利要求5所述生防药剂的制备方法，包括以下步骤将所述沼泽红假单胞菌菌株的生防菌剂发酵培养5d 7d,培养完成后在6000rpm 8000rpm条件下离心2min 4min，收集离心后的上清液，再经细菌过滤器过滤，得到生防药剂。
7.—种沼泽红假单胞菌菌株的生防药剂，所述生防药剂为权利要求3所述生防菌剂经发酵培养、破碎后制得的菌体破碎液。
8.—种如权利要求7所述生防药剂的制备方法，包括以下步骤 (1)将所述沼泽红假单胞菌菌株的生防菌剂发酵培养5d 7d,培养完成后在6000rpm 8000rpm条件下离心4min 8min,弃上清，收集菌体； (2)将步骤(I)中收集的菌体用缓冲液清洗后再置于缓冲液中进行超声波破碎； (3)将经过步骤(2)中超声波破碎后的菌液于2°C 6°C、IOOOOrpm HOOOrpm条件下离心8min 12min,收集的上清液即为生防药剂。
9.根据权利要求8所述的制备方法，其特征在于，超声波破碎时的工艺条件为超声波强度控制在200W 400W，破碎8s IOs间隔8s 10s，超声波破碎IOmin 15min。
10.一种如权利要求3所述生防菌剂、权利要求5或7所述生防药剂在防治水稻稻曲病或提高水稻体内过氧化氢酶活性中的应用。
全文摘要
本发明公开了一种沼泽红假单胞菌CCTCC M 2012224及其在防治水稻稻曲病或提高水稻体内过氧化氢酶活性中的应用，还公开了该菌株经活化、种子培养、生产培养后制得的生防菌剂；用该生防菌剂经发酵、离心后制得的发酵上清液可以作为生防药剂，用该生防菌剂经发酵培养、破碎后制得的菌体破碎液也可作为生防药剂，本发明的生防菌剂、生防药剂均可用于防治水稻稻曲病或提高水稻体内过氧化氢酶活性。本发明产品具有生产成本低、无毒、绿色环保、使用方便等优点，可有效防治水稻稻曲病，提高水稻的抗病性。
文档编号A01P3/00GK102876615SQ20121039495
公开日2013年1月16日 申请日期2012年10月17日 优先权日2012年10月17日
发明者刘勇, 陈莎, 张松柏, 张德咏, 罗香文, 彭静, 程菊娥, 谭新球, 成飞雪, 朱春晖, 杨春晓 申请人:湖南省植物保护研究所