一种甲基营养型芽孢杆菌可湿性粉剂及其制备方法和应用的制作方法
【专利摘要】本发明公开了一种甲基营养型芽孢杆菌可湿性粉剂，包含100质量份的甲基营养型芽孢杆菌原药、4～10质量份的润湿剂和4～10质量份的分散剂；所述甲基营养型芽孢杆菌的制备方法是：按比例称取甲基营养型芽孢杆菌原药、润湿剂和分散剂，混合均匀；然后经气流粉碎机粉碎后，即得甲基营养型芽孢杆菌可湿性粉剂。该可湿性粉剂质量稳定、便于长期保存和使用，对黄瓜灰霉病和苹果腐烂病具有较强的防治效果，克服了化学药剂所带来的环境毒副作用和农药残留问题，具有高效、无毒、安全无残留的特性，是一种安全有效、残留低的环境友好型绿色微生物农药，在微生物防治领域具有广阔的应用前景。
CCTCC NO:M2010343
2010.12.09
【专利说明】一种甲基营养型芽孢杆菌可湿性粉剂及其制备方法和应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种甲基营养型芽孢杆菌可湿性粉剂及其制备方法和应用，属于微生 物农药领域。
【背景技术】
[0002] 微生物农药，是指应用活体微生物及其代谢产物对农业病虫害进行防治。微生物 农药具有选择性强，对人、畜、农作物和自然环境安全，不易产生抗药性等特点，因此得到了 广泛研究。目前市场上已经有较为成熟的微生物农药产品，例如苏云金芽孢杆菌、地衣芽孢 杆菌、枯草芽孢杆菌等。
[0003] 随着经济全球化的迅速发展，我国在国际农产品和食品贸易中将面对越来越苛刻 的农药残留标准，这就要求我国农产品从传统种植方式逐步向绿色产业进行过渡，使用生 物农药逐步替代化学农药施用，才能适应国际贸易中对出口农产品的高标准和新要求。同 时，随着我国对生态环境可持续发展的要求，对微生物农药的需求也必然会逐渐增加。因 此，微生物农药具有良好的发展前景和巨大的发展空间。
[0004] 近年来，随着保护地蔬菜生产规模的不断扩大，灰霉病对蔬菜生产造成的危害越 来越严重。灰霉病不仅在黄瓜、番茄、草莓、韭菜等蔬菜品种上大量发生，而且在棉花、果树 等经济类作物上也时有发生，一旦发病往往给农业生产造成巨大损失。尤其是在黄瓜的保 护地栽培中，灰霉病发病极为频繁，灰霉病会使黄瓜的花及果实发生腐烂，导致减产。一般 发病时黄瓜的减产率可达20%?30%，发病严重时减产率甚至高达70%以上。因此，黄瓜 灰霉病已成为黄瓜生产中的限制性障碍。目前用于防治灰霉病的常用药剂包括苯并咪唑类 农药（多菌灵、苯菌灵、甲基硫菌）和二甲酰胺类农药（速克灵、菌核利、腐霉利等）。在上 世纪80年代后又有乙霉威、嘧霉胺、环己酰胺、啶菌恶唑等化学药剂被相继开发。这些化学 药剂对生物的伤害性很大、环境污染严重，有的药剂在蔬菜上的药物残留有蓄积作用，会对 人体造成危害；有的药剂容易使农作物的病原菌产生抗药性，引起防治效果的逐年下降。
[0005] 对于保护地栽培的苹果来说，最大的病害为苹果腐烂病。苹果腐烂病菌是弱寄生 菌，凡是能够导致树势变弱的因素都能诱发苹果腐烂病，从而引起苹果树枝的枯萎、腐烂、 致死。苹果腐烂病的防治药物也多为毒副作用大的化学类药剂，对环境、果树和人体都有很 大的危害。
[0006] 因此，针对黄瓜灰霉病和苹果腐烂病，研制一种绿色环保型的、安全有效且无毒副 作用的生物农药迫在眉睫。
[0007] 中国科学院沈阳应用生态研究所胡江春等人从辽宁黄渤海海域的海泥样品中成 功筛选、分离出一株海洋细菌；根据该菌的形态学特征、生物化学特征以及分子遗传学鉴定 结果，将其鉴定为甲基营养型芽孢杆菌（Bacillus methylotro-phicus)，简称BAC-9912。 BAC-9912被保藏在中国典型培养物保藏中心，保藏地址为中国.武汉.武汉大学，保藏号 为CCTCC No. M2010343,保藏日期为2010年12月9日。BAC-9912经培养后产生的物质具 有很强的抗菌活性，其发酵产物对蔬菜根腐病、大豆根腐病、苹果腐烂病等真菌病毒具有很 强的拮抗左右，而且对人畜没有不良影响，对环境无害，是一种有着广泛应用前景的新型微 生物农药。但是，BAC-9912发酵液的稳定性差、不能长时间存放，且发酵液中的杀菌有效成 分的含量不固定，作为微生物农药使用时多有不便，杀菌效果不能保证，因此必须将其制备 成合适的农药剂型。
[0008] 中国专利CN103039530A提供了一种甲基营养型芽孢杆菌的可湿性粉剂及其制备 方法。所述可湿性粉剂采用特定方法制得的甲基营养型芽抱杆菌的原粉、轻质碳酸钙、十二 烷基苯磺酸钠、磷酸二氢钾、磷酸氢二钾和分散剂亚甲基双甲基蔡磺酸钠组成；该发明的可 湿性粉剂具有防治柑橘病害、特别是柑橘溃疡病的用途。但是，该发明的甲基营养型芽孢杆 菌可湿性粉剂主要针对柑橘病害，对保护地蔬菜种植中常见的黄瓜灰霉病和苹果腐烂病的 防治效果不佳。
【发明内容】
[0009] 本发明需要解决的技术问题是提供一种甲基营养型芽孢杆菌可湿性粉剂及其制 备方法和应用；该可湿性粉剂高效、稳定、无毒，能够快速杀灭致病菌，对黄瓜灰霉病和苹果 腐烂病具有良好的防治效果。
[0010] 为解决上述技术问题，本发明所采取的技术方案是：
[0011] 一种甲基营养型芽孢杆菌可湿性粉剂，包含100质量份的甲基营养型芽孢杆菌原 药、4?10质量份的润湿剂和4?10质量份的分散剂；所述甲基营养型芽孢杆菌原药的制 备方法是：向含有甲基营养型芽孢杆菌的发酵液中加入絮凝剂并混合均匀，待菌体凝聚后 加入助滤剂，然后经固液分离步骤收集菌体，干燥后即得原药。
[0012] 本发明的进一步改进在于：所述可湿性粉剂优选包含100质量份的甲基营养型芽 孢杆菌原药、6?8质量份的润湿剂和6?8质量份的分散剂。
[0013] 本发明的进一步改进在于：所述润湿剂是十-烧基硫酸纳、十-烧基苯横酸纳、烧 基丁二酸磺酸盐、GSWP复合助剂中的任意一种或几种；所述分散剂是剛0、1^、50?八、羟甲基 纤维素中的任意一种或几种。
[0014] 本发明的进一步改进在于：所述制备原药时，含有甲基营养型芽孢杆菌的发酵 液的加入量为1质量份，絮凝剂的加入量为IOOppm?600ppm质量份，助滤剂的加入量 为0. 5%?3%质量份；所述固液分离步骤是过滤或离心；所述干燥过程为真空干燥，温度 50°C?80°C，真空度为 0· 07Mpa ?0· 09Mpa。
[0015] 本发明的进一步改进在于：所述制备原药时，含有甲基营养型芽孢杆菌的发酵 液的加入量为1质量份，絮凝剂的加入量为300ppm?500ppm质量份，助滤剂的加入量为 1%?2%质量份；所述干燥过程中，温度60°C?70°C，真空度为0. 07Mpa?0. 09Mpa。
[0016] 本发明的进一步改进在于：所述絮凝剂为聚丙烯酰胺，所述助滤剂为硅藻土。
[0017] 本发明的进一步改进在于：所述可湿性粉剂中活芽孢的含量> 30亿/克。
[0018] 一种甲基营养型芽孢杆菌可湿性粉剂的制备方法，其特征在于所述制备方法为： 按比例称取甲基营养型芽孢杆菌原药、润湿剂和分散剂，混合均匀；然后经气流粉碎机粉碎 后，即得甲基营养型芽孢杆菌可湿性粉剂。
[0019] 所述粉碎过程中物料的温度不大于70°C ;所述甲基营养型芽孢杆菌可湿性粉剂过 45 μ m标准筛网，通过率不小于95%。
[0020] -种甲基营养型芽孢杆菌可湿性粉剂的应用，其特征在于：所述甲基营养型芽孢 杆菌可湿性粉剂经稀释后喷雾，用于防治黄瓜灰霉病和苹果腐烂病。
[0021] 用于防治黄瓜灰霉病时，将甲基营养型芽孢杆菌可湿性粉剂稀释至500?800倍 液后喷雾；用于防治苹果腐烂病时，将甲基营养型芽孢杆菌可湿性粉剂稀释至50?200倍 液后喷雾。
[0022] 由于采用了上述技术方案，本发明所取得的技术进步在于：
[0023] 本发明提供了一种甲基营养型芽孢杆菌可湿性粉剂。该可湿性粉剂中活芽孢的含 量大于30亿/克，有效保证了对黄瓜灰霉病和苹果腐烂病的防治效果，而且质量稳定、便于 长期保存和使用；本发明可湿性粉剂以甲基营养型芽孢杆菌为活性成分，克服了化学药剂 所带来的环境毒副作用和农药残留问题，具有高效、无毒、安全无残留的特性，是一种安全 有效、残留低的环境友好型绿色微生物农药，在微生物防治领域具有广阔的应用前景。
[0024] 本发明可湿性粉剂所使用的活性成分为源自海洋的甲基营养型芽孢杆菌 BAC-9912。BAC-9912是从辽宁渤海沿海的海泥中分离、筛选得到的，对番茄灰霉病、番茄枯 萎病、番茄茎腐病、黄瓜灰霉病、苹果腐烂病、苹果干腐病、梨树枯萎病等植物病害都有较强 的拮抗作用，非常适宜作为微生物农药的原料使用。
[0025] 本发明提供的原药制备方法，首先向含有甲基营养型芽孢杆菌的发酵液中添加絮 凝剂，使得原本分散在发酵液中的菌体凝聚在絮凝剂上；然后加入助滤剂，以提高固液分离 效率，收集到菌体湿品；最后通过真空干燥蒸发除去菌体湿品中残存的少量水分，真空干燥 温度限定为50°C?80°C，有效地避免了高温对甲基营养型芽孢杆菌菌体的损伤。与目前常 用的现将发酵液浓缩、然后进行喷雾干燥的方法相比，本发明有效解决了发酵液粘度大、菌 体含量小、不易获得菌体的问题，制备过程简单快速，过滤时间短，能耗显著降低，发酵液处 理量大、处理效率高，所用设备皆为常规化工设备，生产成本低。
[0026] 本发明甲基营养型芽孢杆菌可湿性粉剂选用十二烷基硫酸钠、十二烷基苯磺酸 钠、烷基丁二酸磺酸盐或GSWP复合助剂作为润湿剂，这几种润湿剂与甲基营养型芽孢杆菌 原药具有良好的相容性，而且具有合适的亲水亲油平衡值，能够有效改善可湿性粉剂在水 中的润湿分散性能。本发明选用NN0、MF、羟甲基纤维素或SOPA作为分散剂，这几种分散剂 与甲基营养型芽孢杆菌原药、润湿剂都具有良好的相容性，显著提高了可湿性粉剂溶于水 后形成的悬浮药液的均一性和稳定性。
[0027] 本发明还提供了一种甲基营养型芽孢杆菌可湿性粉剂的制备方法。该制备方法进 一步限定使用气流粉碎机对原料进行粉碎，气流粉碎机以压缩空气为动力，气体在喷嘴处 的膨胀造成较低的温度，所以在操作过程中不会产生大量的热，能够将物料温度稳定控制 在70°C以下，不会损伤甲基营养型芽孢杆菌原药，使甲基营养型芽孢杆菌可湿性粉剂中原 药含量的恒定，进而保证了可湿性粉剂的防效；而且气流粉碎机的粉碎产品粒度均匀，有利 于可湿性粉剂的均匀性。本发明产品过45 μ m筛网的通过率在95%以上，有利于可湿性粉 剂的快速溶解稀释、以及在病株表面的铺展渗透。
[0028] 本发明还提供了一种甲基营养型芽孢杆菌可湿性粉剂的应用。将该可湿性粉剂经 适度稀释后喷洒在患有黄瓜灰霉病或苹果腐烂病的病株上，能够起到与化学农药相近的防 效，实现对黄瓜灰霉病或苹果腐烂病的有效防治。
【具体实施方式】
[0029] 下面结合实施例对本发明做进一步详细说明：
[0030] 本发明所涉及的甲基营养型芽孢杆菌菌株的分类命名为Bacillus methylotro-phicus，简称BAC-9912,保藏单位为中国典型培养物保藏中心，保藏地址为中 国·武汉·武汉大学，保藏号为CCTCC No. M2010343,保藏日期为2010年12月9日。
[0031] 本发明制备甲基营养型芽孢杆菌原药时所使用的含有甲基营养型芽孢杆菌的发 酵液的制备方法参照中国专利CN102533579A :-种产芽孢培养基及其优化过程与应用。培 养基的组成及重量配比为：玉米粉1. 8 %，麸皮0. 35 %，黄豆饼粉0. 1 %，十二水磷酸二氢钾 0. 05%，无水碳酸钙0. 07%，其余为水；培养基体系的pH为6. 5。
[0032] -种甲基营养型芽孢杆菌可湿性粉剂，包含100质量份的甲基营养型芽孢杆菌原 药、4?10质量份的润湿剂和4?10质量份的分散剂；优选包含100质量份的甲基营养型 芽孢杆菌原药、6?8质量份的润湿剂和6?8质量份的分散剂；最优选包含100质量份的 甲基营养型芽孢杆菌原药、6质量份的润湿剂和6质量份的分散剂。
[0033] 所述润湿剂是十二烷基硫酸钠、十二烷基苯磺酸钠、烷基丁二酸磺酸盐、GSWP复合 助剂中的任意一种或几种，优选为GSWP复合助剂。所述GSWP复合助剂由石家庄奇正精细 化工厂生产，主要成分为木质素磺酸盐、0P-10 (烷基酚聚氧乙烯基醚）和二氧化硅。
[0034] 所述分散剂是ΝΝ0(萘磺酸钠甲醛缩合物）、MF(甲基萘磺酸钠甲醛缩合物）、 SOPA(烷基酚聚氧乙烯基醚甲醛缩合物磺酸盐）、羟甲基纤维素中的任意一种或几种，优选 的为MF。·
[0035] 所述可湿性粉剂中活芽孢的含量3 30亿/克。
[0036] 所述甲基营养型芽孢杆菌原药是按下列方法制得的：向含有甲基营养型芽孢杆菌 的发酵液中加入絮凝剂并混合均匀，待菌体凝聚后加入助滤剂，然后经固液分离步骤收集 菌体，干燥后即得原药。
[0037] 所述含有甲基营养型芽孢杆菌的发酵液的加入量为1质量份，絮凝剂的加入量为 IOOppm?600ppm质量份，助滤剂的加入量为0. 5%?3%质量份；优选：含有甲基营养型芽 孢杆菌的发酵液为1质量份，絮凝剂的加入量为300ppm?500ppm质量份，助滤剂的加入量 为1%?2%质量份；最优选：含有甲基营养型芽孢杆菌的发酵液为1质量份，絮凝剂的加 入量为300ppm质量份，助滤剂的加入量为1%质量份。
[0038] 所述絮凝剂优选为聚丙烯酰胺絮凝剂，助滤剂优选硅藻土；加入絮凝剂后的菌体 凝聚时间为20?40min，优选30min。
[0039] 所述固液分离步骤可采用离心或过滤方式。所述干燥过程为真空干燥，干燥设备 优选真空双锥回转干燥机；真空干燥温度为50°C?80°C，优选60°C?70°C ;干燥真空度为 0· 07Mpa ?0· 09Mpa。
[0040] 甲基营养型芽孢杆菌原药的最优制备工艺为：向1质量份的含有甲基营养型芽孢 杆菌的发酵液中加入300ppm?500ppm的聚丙烯酰胺絮凝剂，待菌体凝聚后加入1. 0%? 2.0%质量份的硅藻土，混合均匀；然后通过离心或过滤收集菌体，在60°C?70°C、真空度 0. 07Mpa?0. 09Mpa条件下进行真空干燥，干燥至水分< 5. 0%，即得甲基营养型芽孢杆菌 原药。
[0041] 一种甲基营养型芽孢杆菌可湿性粉剂的制备方法，其制备过程为：按比例称取甲 基营养型芽孢杆菌原药、润湿剂和分散剂，混合均匀；然后经气流粉碎机粉碎，粉碎过程中 物料的温度不大于70°C，即得甲基营养型芽孢杆菌可湿性粉剂。所述甲基营养型芽孢杆菌 可湿性粉剂过45 μ m标准筛网，通过率不小于95 %。
[0042] 甲基营养型芽孢杆菌可湿性粉剂的最优制备工艺为：向100质量份的甲基营养型 芽孢杆菌原药中加入6质量份的GSWP复合助剂、6质量份的分散剂MF，混合均匀，然后经气 流粉碎，粉碎过程物料温度< 70°C，粉碎细度应达到45 μ m筛通过率> 95%，即得甲基营养 型芽孢杆菌可湿性粉剂。
[0043] 所述甲基营养型芽孢杆菌可湿性粉剂满足下列条件：
【权利要求】
1. 一种甲基营养型芽孢杆菌可湿性粉剂，其特征在于：所述可湿性粉剂包含100质量 份的甲基营养型芽孢杆菌原药、4?10质量份的润湿剂和4?10质量份的分散剂；所述甲 基营养型芽孢杆菌原药的制备方法是：向含有甲基营养型芽孢杆菌的发酵液中加入絮凝剂 并混合均匀，待菌体凝聚后加入助滤剂，然后经固液分离步骤收集菌体，干燥后即得原药。
2. 根据权利要求1所述的一种甲基营养型芽孢杆菌可湿性粉剂，其特征在于：所述可 湿性粉剂包含100质量份的甲基营养型芽孢杆菌原药、6?8质量份的润湿剂和6?8质量 份的分散剂。
3. 根据权利要求1或2任一项所述的一种甲基营养型芽孢杆菌可湿性粉剂，其特征在 于：所述润湿剂是十二烷基硫酸钠、十二烷基苯磺酸钠、烷基丁二酸磺酸盐、GSWP复合助剂 中的任意一种或几种；所述分散剂是NNO、MF、SOPA、羟甲基纤维素中的任意一种或几种。
4. 根据权利要求1所述的一种甲基营养型芽孢杆菌可湿性粉剂，其特征在于：所述 制备原药时，含有甲基营养型芽孢杆菌的发酵液的加入量为1质量份，絮凝剂的加入量为 lOOppm?600ppm质量份，助滤剂的加入量为0. 5%?3%质量份；所述固液分离步骤是过 滤或离心；所述干燥过程为真空干燥，温度50°C?80°C，真空度为0. 07Mpa?0. 09Mpa。
5. 根据权利要求4所述的一种甲基营养型芽孢杆菌可湿性粉剂，其特征在于：所述 制备原药时，含有甲基营养型芽孢杆菌的发酵液的加入量为1质量份，絮凝剂的加入量 为300ppm?500ppm质量份，助滤剂的加入量为1%?2%质量份；所述干燥过程中，温度 60°C?70°C，真空度为 0· 07Mpa ?0· 09Mpa。
6. 根据权利要求4或5任一项所述的一种甲基营养型芽孢杆菌可湿性粉剂，其特征在 于：所述絮凝剂为聚丙烯酰胺，所述助滤剂为硅藻土。
7. 根据权利要求1所述的一种甲基营养型芽孢杆菌可湿性粉剂，其特征在于：所述可 湿性粉剂中活芽孢的含量> 30亿/克。
8. -种如权利要求1?7任一项所述的一种甲基营养型芽孢杆菌可湿性粉剂的制备方 法，其特征在于所述制备方法为：按比例称取甲基营养型芽孢杆菌原药、润湿剂和分散剂， 混合均匀；然后经气流粉碎机粉碎后，即得甲基营养型芽孢杆菌可湿性粉剂。
9. 根据权利要求8所述的一种甲基营养型芽孢杆菌可湿性粉剂的制备方法，其特征在 于：粉碎过程中物料的温度不大于70°C ;所述甲基营养型芽孢杆菌可湿性粉剂过45 μ m标 准筛网，通过率不小于95%。
10. -种如权利要求1?7任一项所述的一种甲基营养型芽孢杆菌可湿性粉剂的应用， 其特征在于：所述甲基营养型芽孢杆菌可湿性粉剂经稀释后喷雾，用于防治黄瓜灰霉病和 苹果腐烂病。
11. 根据权利要求10所述的一种甲基营养型芽孢杆菌可湿性粉剂的应用，其特征在 于：用于防治黄瓜灰霉病时，将甲基营养型芽孢杆菌可湿性粉剂稀释至500?800倍液后喷 雾；用于防治苹果腐烂病时，将甲基营养型芽孢杆菌可湿性粉剂稀释至50?200倍液后喷 雾。
【文档编号】A01N25/14GK104222076SQ201410303095
【公开日】2014年12月24日 申请日期:2014年6月30日 优先权日:2014年6月30日
【发明者】杨德昌, 李学红, 胡江春, 李春田, 潘华奇, 刘书琴, 杨永军, 赵少品, 王晓宏, 胡艳霞, 苑丽蒲 申请人:华北制药集团爱诺有限公司