一种文冠果的组织培养快繁方法
【专利摘要】本发明公开了一种文冠果的组织培养快繁方法，即通过植物细胞工程技术解决文冠果（ Xanthocerassorbifolia Bunge）发芽率低、嫁接成活率低和扦插生根困难的问题，在短时间内获得具有人们所需要的优良性状的文冠果试管苗。本发明以文冠果种胚为外植体，通过愈伤组织诱导、继代培养、不定芽分化、生根培养以及试管苗驯化移栽等阶段实现了文冠果的组织培养快速繁殖。为大力发展文冠果大规模种植提供大量优质茁壮的种苗，同时也为文冠果的遗传转化等基因工程研究提供实验材料。
【专利说明】 一种文冠果的组织培养快繁方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及农业生物技术中植物组织培养的方法，具体地说，涉及一种文冠果的组织培养快繁方法。
【背景技术】
[0002]文冠果Uanthoceras sorbifolia^unge)属无患子科文冠果属的一种落叶灌木或者是小乔木，是我国极其珍贵的木本药用、油用植物。文冠果的树干和树枝叫文冠木，味甘、性凉，具有祛风湿，消肿止痛，敛干黄水等疗效，是治疗类风湿性关节炎、风湿性心瓣膜病和淋巴结肿大的传统药物。另外，文冠果油的脂肪酸种类非常丰富，脂肪酸的含量接近60%，有的品种含量更高，且不饱和脂肪酸的含量达90%以上，因此文冠果是一种优质的能源植物。
[0003]文冠果作为一种木本植物，在组织培养过程中出现很多问题，如愈伤诱导率低、褐变、生根困难等，其研究仍处于初期阶段，尚未建立完整的离体快繁体系，因此有必需建立文冠果的组织培养快繁技术，为文冠果规模化种植提供大量优质茁壮的文冠果种苗。
【发明内容】
[0004]本发明的目的在于提供一种文冠果的组织培养快繁方法，本发明以文冠果种胚为外植体，通过愈伤组织诱导、继代培养、不定芽分化、生根培养以及试管苗驯化移栽等阶段实现了文冠果的组织培养快速繁殖。从而在人工控制的条件实现文冠果种苗的快速繁殖，获得大量试管苗，进而实现了本发明的目的。
[0005]本发明的一种文冠果的组织培养快繁方法，包括以下的工艺步骤:
(I)外植体的处理:选择文冠果成熟种胚为外植体，置于60?80°C温水中自然晾却至室温浸泡5?8h，然后用含有0.01?0.05%吐温-20的0.1?0.5%升汞溶液消毒2?1min,无菌水冲洗3?5次，剥去种皮后置于75?80%乙醇溶液中浸泡20?60s，无菌水冲洗3?5次，再用含有0.01?0.05%吐温-20的0.1?0.5%升汞溶液消毒2?5min，无菌水冲洗3?5次后备用。
[0006](2)愈伤组织诱导:将消毒好的种胚切成大约3?5mm3的组织块，并接种到诱导培养基上进行愈伤组织诱导培养，接种后先在25?28°C条件下全暗培养20?30天，然后置于每天光照10?11小时，光照强度为1500?25001x，培养温度为25?28°C的条件下培养直至形成愈伤组织。
[0007](3)继代培养:愈伤组织生长至15?25天后，将长势良好的愈伤组织转接至继代培养基中进行继代培养，接种后先在25?28°C条件下全暗培养3?7天，然后置于每天光照12?15小时，光照强度为2000?30001x，培养温度为25?28°C的条件下培养，25?30天继代一次。
[0008](4)不定芽诱导:将培养至30?40天的长势良好的愈伤组织转接至芽诱导培养基中进行不定芽诱导培养，接种后先在25?28°C条件下全暗培养10?15天，然后置于每天光照12?15小时，光照强度为2000?30001x，培养温度为25?28°C的条件下培养直至形成不定芽。
[0009](5)生根培养:将分化出的芽长至3?5cm接种至生根培养基中进行根诱导，接种后先在25?28°C条件下全暗培养5?7天，然后置于每天光照12?15小时，光照强度为2000?30001x，培养温度为25?28°C的条件下培养直至长出根。
[0010](6)试管苗移栽:将长至8?1cm的生根试管苗的培养瓶瓶盖打开并置于自然光照下炼苗5?7天后，将试管苗从培养瓶中取出，洗掉根部培养基，尽量不伤害根部，栽入由黄沙土和火碳泥(I:1)混合成的基质中并定植于大田中。
[0011]上述步骤(2)所述的诱导培养基为:MS+ L O?2.0mg/L2, 4-D+2.5%?3.5%蔗糖+0.35%?0.5%琼脂+0.05%?0.1%活性炭，pH值为5.4?5.8。
[0012]上述步骤(3)所述的继代培养基为:MS+0.1?1.0mg/L 2，4-D+0.5?2.0mg/LΝΑΑ+0.5 ?1.0mg/L 6-BA+2.5% ?3.5% 蔗糖 +0.35% ?0.5% 琼脂 +0.05% ?0.1% 活性炭，pH值为5.4?5.8。
[0013]上述步骤(4)所述的芽诱导培养基为:MS+0.1?1.0mg/L NAA+1.0?3.0mg/L6-BA+2.5% ?3.5% 蔗糖 +0.35% ?0.5% 琼脂 +0.05% ?0.1% 活性炭，pH 值为 5.4 ?5.8。
[0014]上述步骤(5 )所述的生根培养基为:1/2MS+1?3mg/L ΙΒΑ+0.1?0.5mg/LNAA+2.0% ?2.5% 蔗糖 +0.4% ?0.6% 琼脂 +0.05% ?0.1% 活性炭，pH 值为 5.4 ?5.8。
[0015]本发明解决文冠果(ZafliAocera1S sorbifolia^mge)发芽率低、嫁接成活率低和扦插生根困难的问题，在短时间内获得具有人们所需要的优良性状的文冠果试管苗。
【具体实施方式】
[0016]以下实施例是对本发明的进一步说明，不是对本发明的限制。
[0017]实施例1
1、外植体的处理:选择文冠果成熟种胚为外植体，置于60°C温水中自然晾却至室温浸泡5h，然后用含有0.01%吐温-20的0.1%升汞溶液消毒2min，无菌水冲洗5次，剥去种皮后置于75%乙醇溶液中浸泡20s，无菌水冲洗5次，再用含有0.01%吐温-20的0.1%升汞溶液消毒2min，无菌水冲洗5次后接种，成功率达65%。
[0018]2、愈伤组织诱导:将消毒好的种胚切成大约3?5mm3的组织块，并接种到诱导培养基上进行愈伤组织诱导培养，接种后先在25°C条件下全暗培养20天，然后置于每天光照10小时，光照强度为1500X，培养温度为25°C的条件下培养直至形成愈伤组织，所述的诱导培养基为:MS+ 1.0mg/L2, 4-D+2.5%蔗糖+0.35%琼脂+0.05%活性炭，pH值为5.8，愈伤组织诱导率达87%以上。
[0019]3、继代培养:愈伤组织生长至15天后，将长势良好的愈伤组织转接至继代培养基中进行继代培养，接种后先在25°C条件下全暗培养3天，然后置于每天光照12小时，光照强度为20001x，培养温度为25°C的条件下培养，26天继代一次，所述的继代培养基为:MS+0.lmg/L 2，4-D+0.5mg/L NAA+0.5mg/L 6-BA+2.5%% 蔗糖 +0.35% 琼脂 +0.05%% 活性炭，pH值为5.8。
[0020]4、不定芽诱导:将培养至30天的长势良好的愈伤组织转接至芽诱导培养基中进行不定芽诱导培养，接种后先在25°C条件下全暗培养10天，然后置于每天光照12小时，光照强度为20001x，培养温度为25°C的条件下培养直至形成不定芽，所述的芽诱导培养基为:MS+0.lmg/L NAA+1.0mg/L 6-BA+2.5% 蔗糖 +0.35% 琼脂 +0.05% 活性炭，pH 值为 5.8。
[0021]5、生根培养:将分化出的芽长至3?5cm接种至生根培养基中进行根诱导，接种后先在25°C条件下全暗培养5天，然后置于每天光照12小时，光照强度为2000χ，培养温度为25°C的条件下培养35天后长出根，所述的生根培养基为l/2MS+lmg/L IBA+0.lmg/LNAA+2.0% 蔗糖 +0.4% 琼脂 +0.05% 活性炭，pH 值 5.8。
[0022]6、试管苗移栽:将长至8?1cm的生根试管苗的培养瓶瓶盖打开并置于自然光照下炼苗5天后，将试管苗从培养瓶中取出，洗掉根部培养基，尽量不伤害根部，栽入由黄沙土和火碳泥(I:1)混合成的基质中并定植于大田中，成活达89%。
[0023]实施例2
1、外植体的处理:选择文冠果成熟种胚为外植体，置于70°C温水中自然晾却至室温浸泡5h，然后用含有0.03%吐温-20的0.1%升汞溶液消毒5min，无菌水冲洗3次，剥去种皮后置于78%乙醇溶液中浸泡25s，无菌水冲洗5次，再用含有0.03%吐温-20的0.1%升汞溶液消毒5min，无菌水冲洗5次后接种，成功率达73%。
[0024]2、愈伤组织诱导:将消毒好的种胚切成大约3?5mm3的组织块，并接种到诱导培养基上进行愈伤组织诱导培养，接种后先在28°C条件下全暗培养23天，然后置于每天光照11小时，光照强度为1500x，培养温度为28°C的条件下培养直至形成愈伤组织，所述的诱导培养基为:MS+ 1.5mg/L2, 4-D+2.8%蔗糖+0.38%琼脂+0.07%活性炭，pH值为5.8，愈伤组织诱导率达88%以上。
[0025]3、继代培养:愈伤组织生长至20天后，将长势良好的愈伤组织转接至继代培养基中进行继代培养，接种后先在28°C条件下全暗培养7天，然后置于每天光照12小时，光照强度为25001x，培养温度为28°C的条件下培养，30天继代一次，所述的继代培养基为:MS+0.6mg/L 2，4_D+2mg/L NAA+0.8mg/L 6-BA+2.5%% 蔗糖 +0.35%% 琼脂 +0.05% 活性炭，pH值为5.8。
[0026]4、不定芽诱导:将培养至32天的长势良好的愈伤组织转接至芽诱导培养基中进行不定芽诱导培养，接种后先在28°C条件下全暗培养10天，然后置于每天光照13小时，光照强度为20001x，培养温度为25°C的条件下培养直至形成不定芽，所述的芽诱导培养基为:MS+0.3mg/L NAA+1.2mg/L 6-BA+2.5% 蔗糖 +0.35% 琼脂 +0.05% 活性炭，pH 值为 5.8。
[0027]5、生根培养:将分化出的芽长至3?5cm接种至生根培养基中进行根诱导，接种后先在25°C条件下全暗培养6天，然后置于每天光照12小时，光照强度为2000χ，培养温度为25°C的条件下培养35天后长出根，所述的生根培养基为1/2MS+1.2mg/L IBA+0.4mg/LNAA+2.0% 蔗糖 +0.4% 琼脂 +0.05% 活性炭，pH 值 5.8。
[0028]6、试管苗移栽:将长至8?1cm的生根试管苗的培养瓶瓶盖打开并置于自然光照下炼苗5天后，将试管苗从培养瓶中取出，洗掉根部培养基，尽量不伤害根部，栽入由黄沙土和火碳泥(I:1)混合成的基质中并定植于大田中，成活达90%。
【权利要求】
1.一种文冠果的组织培养快繁方法，其特征在于包括以下工艺步骤: (1)外植体的处理:选择文冠果成熟种胚为外植体，置于60?80°C温水中自然晾却至室温浸泡5?8h，然后用含有0.01?0.05%吐温-20的0.1?0.5%升汞溶液消毒2?1min,无菌水冲洗3?5次，剥去种皮后置于75?80%乙醇溶液中浸泡20?60s，无菌水冲洗3?5次，再用含有0.01?0.05%吐温-20的0.1?0.5%升汞溶液消毒2?5min，无菌水冲洗3?5次后备用； (2)愈伤组织诱导:将消毒好的种胚切成大约3?5mm3的组织块，并接种到诱导培养基上进行愈伤组织诱导培养，接种后先在25?28°C条件下全暗培养20?30天，然后置于每天光照10?11小时，光照强度为1500?25001x，培养温度为25?28°C的条件下培养直至形成愈伤组织； (3)继代培养:愈伤组织生长至15?25天后，将长势良好的愈伤组织转接至继代培养基中进行继代培养，接种后先在25?28°C条件下全暗培养3?7天，然后置于每天光照12?15小时，光照强度为2000?30001x，培养温度为25?28°C的条件下培养，25?30天继代一次； (4)不定芽诱导:将培养至30?40天的长势良好的愈伤组织转接至芽诱导培养基中进行不定芽诱导培养，接种后先在25?28°C条件下全暗培养10?15天，然后置于每天光照12?15小时，光照强度为2000?30001x，培养温度为25?28°C的条件下培养直至形成不定芽； (5)生根培养:将分化出的芽长至3?5cm接种至生根培养基中进行根诱导，接种后先在25?28°C条件下全暗培养5?7天，然后置于每天光照12?15小时，光照强度为2000?30001x，培养温度为25?28°C的条件下培养直至长出根； (6)试管苗移栽:将长至8?1cm的生根试管苗的培养瓶瓶盖打开并置于自然光照下炼苗5?7天后，将试管苗从培养瓶中取出，洗掉根部培养基，尽量不伤害根部，栽入由黄沙土和火碳泥(I:1)混合成的基质中并定植于大田中。
2.根据权利要求1所述的一种文冠果的组织培养快繁方法，其特征在于步骤(2)所述的诱导培养基为:MS+ 1.0?2.0mg/L2, 4-D+2.5%?3.5%蔗糖+0.35%?0.5%琼脂+0.05%?0.1%活性炭，pH值为5.4?5.8。
3.根据权利要求1所述的一种文冠果的组织培养快繁方法，其特征在于步骤(3)所述的继代培养基为:MS+0.1 ?1.0mg/L 2，4-D+0.5 ?2.0mg/L ΝΑΑ+0.5 ?1.0mg/L6-BA+2.5% ?3.5% 蔗糖 +0.35% ?0.5% 琼脂 +0.05% ?0.1% 活性炭，pH 值为 5.4 ?5.8。
4.根据权利要求1所述的一种文冠果的组织培养快繁方法，其特征在于步骤(4)所述的芽诱导培养基为:MS+0.1?1.0mg/L NAA+1.0?3.0mg/L 6-BA+2.5%?3.5%蔗糖+0.35%?0.5%琼脂+0.05%?0.1%活性炭，pH值为5.4?5.8。
5.根据权利要求1所述的一种文冠果的组织培养快繁方法，其特征在于步骤(5)所述的生根培养基为:1/2MS+1 ?3mg/L ΙΒΑ+0.1 ?0.5mg/L NAA+2.0% ?2.5% 蔗糖 +0.4% ?.0.6%琼脂+0.05%?0.1%活性炭，pH值为5.4?5.8。
【文档编号】A01H4/00GK104285816SQ201410607808
【公开日】2015年1月21日 申请日期:2014年11月3日 优先权日:2014年11月3日
【发明者】杨业容 申请人:杨业容