本发明涉及植物生物技术领域。更具体地说，本发明涉及一种提高罗汉果中罗汉果醇含量的方法。
背景技术：
罗汉果(Siraitia grosvenorii)为中国特有的珍贵药用和甜料植物。其果实性凉、味甘，具有清热润肺，利咽开音，滑肠通便和抗癌等功效，活性成分甜苷V为世界上最强的非糖甜味物质之一，是蔗糖甜度的300-400倍，广泛应用于食品、保健品和药品中，是糖尿病人、肥胖者和高血压患者的理想糖替代品。研究发现，罗汉果醇是甜苷V生物合成的中间产物，在罗汉果果实发育后期，罗汉果醇被完全消耗殆尽转化成甜苷V，然而，罗汉果醇只存在占果重不足15％的果肉内，且含量极低，严重制约了罗汉果产业的健康发展。
茉莉酸甲酯广泛地存在于植物体中，外源应用能够激发防御植物基因的表达，诱导植物的化学防御，产生与机械损伤和昆虫取食相似的效果。现有技术中未见有茉莉酸甲酯提高罗汉果醇含量的报道。
技术实现要素：
本发明的一个目的是解决至少上述问题，并提供至少后面将说明的优点。
本发明还有一个目的是提供一种提高罗汉果中罗汉果醇含量的方法，其能够有效提高罗汉果醇的产量，具有见效快、成本低、操作简单、方便实施、产品无毒无残留等优点，以满足罗汉果醇的大规模生产，具有较强的实用性和推广价值。
为了实现根据本发明的这些目的和其它优点，提供了一种提高罗汉果中罗汉果醇含量的方法，在罗汉果组培过程或栽培过程中施加茉莉酸甲酯。
优选的是，所述的提高罗汉果中罗汉果醇含量的方法，组培过程中，将罗汉果组培苗接种在含有茉莉酸甲酯的MS固体培养基中，置于相对湿度60～66％、光照强度1300～1500Lux、光照时间8h/d、温度21～25℃条件下培养28～31d，其中，茉莉酸甲酯的添加量为50～400μmol/L。
优选的是，所述的提高罗汉果中罗汉果醇含量的方法，栽培过程中，将茉莉酸甲酯配成浓度为50～400μmol/L的茉莉酸甲酯溶液，罗汉果授粉20～30d后，每天喷洒茉莉酸甲酯溶液于罗汉果表面，至表面滴水为止，早、中、晚各喷洒一次，连续喷施8～12d。
优选的是，所述的提高罗汉果中罗汉果醇含量的方法，包括：
步骤一、将罗汉果组培苗接种在含有茉莉酸甲酯的MS固体培养基中，置于相对湿度60～66％、光照强度1300～1500Lux、光照时间8h/d、温度21～25℃条件下培养28～31d，其中，茉莉酸甲酯的添加量为50～400μmol/L；
步骤二、将步骤一培养后的组培苗移栽至田间，罗汉果授粉20～30d后，每天喷洒浓度为50～400μmol/L的茉莉酸甲酯溶液于罗汉果表面，至表面滴水为止，早、中、晚各喷洒一次，连续喷施8～12d。
优选的是，所述的提高罗汉果中罗汉果醇含量的方法，用体积分数为2％的乙醇水溶液溶解茉莉酸甲酯，配制成浓度为50mmol/L茉莉酸甲酯的乙醇母液，并用0.22μm的微孔滤膜灭菌，将灭菌后的茉莉酸甲酯的乙醇母液添加到MS固体培养基中，至茉莉酸甲酯浓度为50～400μmol/L，灭菌并冷却至24～26℃，其中，MS固体培养基包括：MS、1.5mg/L6-苄氨基腺嘌呤、0.3mg/L吲哚丁酸、3.5g/L琼脂、30g/L蔗糖、以及1.0g/L活性炭。
优选的是，所述的提高罗汉果中罗汉果醇含量的方法，用体积分数为2％的乙醇水溶液溶解茉莉酸甲酯，配制成浓度为50～400μmol/L的茉莉酸甲酯溶液。
优选的是，所述的提高罗汉果中罗汉果醇含量的方法，MS固体培养基还包括调节剂，调节剂的添加量为5μmol/L，调节剂包括质量比为2:1:0.2的竹醋液、扯根菜水提物、香豆素。
优选的是，所述的提高罗汉果中罗汉果醇含量的方法，组培过程包括两阶段，第一阶段培养15d，每隔3～5d更换一次MS固体培养基，被更换的MS固体培养基加热至熔化为液态混合物，将海绵浸泡在液态混合物中充分吸收，然后覆盖在更换的MS固体培养基上方，直至下次更换培养基时移除并更换；第二阶段培养15d，每隔5～7d更换一次MS固体培养基，每次更换后的第2d对接种有组培苗的MS固体培养基进行雾化处理，雾化剂为质量分数为1％的酪蛋白溶液。
优选的是，所述的提高罗汉果中罗汉果醇含量的方法，授粉后每隔5d喷施促进剂，促进剂包括质量比为3:3:2:0.1:0.1:10的赤霉素、萘乙酸、吲哚乙酸、芹菜素、复合维生素B以及皂角米蛋白，皂角米蛋白的制备方法为：将皂角米溶解于碱液中，震荡、离心、分离，上清液即得皂角米蛋白。
本发明至少包括以下有益效果：
第一、本发明通过在组培和/或栽培过程施加茉莉酸甲酯，能够诱导罗汉果醇代谢关键酶(如细胞色素P450酶等)基因的高表达，从而在短期内快速提高罗汉果醇的含量；组培过程或栽培过程优选茉莉酸甲酯的施加浓度和施用时间，将组培苗接种在含有茉莉酸甲酯的MS固体培养基中，或将茉莉酸甲酯溶液喷洒于授粉20～30d后的罗汉果表面，促进苗木中罗汉果醇的积累，可以最大限度地提高药用植物活性成分的含量；
第二、本发明通过在MS固体培养基中加入由竹醋液、扯根菜水提物、香豆素复配的调节剂，辅助促进对细胞色素P450酶防御蛋白的活性水平，实现次生物质的积累，扯根菜水提物还具有抗真菌作用，促进蛋白质沉积，香豆素提高调节剂在罗汉果组培苗的附着力，竹醋液促进罗汉果组培苗生长，浓度配比避免香豆素沉淀；
第三、两阶段分别不同时间间隔更换培养基，补充罗汉果生长不同阶段因消耗而所需的营养物质，第一阶段浸泡海绵避免使用过的培养基营养物质浪费，同时覆盖在上方具有保水作用、营养物质下沉吸收，第二阶段利用酪蛋白溶液雾化处理，避免组培苗叶片表面营养物质的流失，促进根部对培养基中茉莉酸甲酯的吸收；
第四、栽培阶段授粉后喷洒由赤霉素、萘乙酸、吲哚乙酸、芹菜素、复合维生素B以及皂角米蛋白复配的促进剂，授粉后芹菜素抑制生物酶的渗出，复合维生素B促进氨基酸的代谢，皂角米蛋白含有丰富必需氨基酸优于小麦、玉米蛋白，还具有一定驱虫作用，形成防御结构，促进后期对茉莉酸甲酯的吸收。
本发明的其它优点、目标和特征将部分通过下面的说明体现，部分还将通过对本发明的研究和实践而为本领域的技术人员所理解。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明做进一步的详细说明，以令本领域技术人员参照说明书文字能够据以实施。
应当理解，本文所使用的诸如“具有”、“包含”以及“包括”术语并不配出一个或多个其它元件或其组合的存在或添加。
需要说明的是，下述实施方案中所述实验方法，如无特殊说明，均为常规方法，所述试剂和材料，如无特殊说明，均可从商业途径获得。
<实施例1>
步骤一、用体积分数为2％的乙醇水溶液溶解茉莉酸甲酯，配制成浓度为200mmol/L茉莉酸甲酯的乙醇母液，并用0.22μm的微孔滤膜灭菌，将灭菌后的茉莉酸甲酯的乙醇母液添加到MS固体培养基中，至茉莉酸甲酯的添加量为200μmol/L，灭菌并冷却至24～26℃，其中，MS固体培养基包括：MS、1.5mg/L 6-苄氨基腺嘌呤、0.3mg/L吲哚丁酸、3.5g/L琼脂、30g/L蔗糖、以及1.0g/L活性炭；
步骤二、将罗汉果组培苗接种在步骤一得到的含有茉莉酸甲酯的MS固体培养基中，置于相对湿度60～66％、光照强度1300～1500Lux、光照时间8h/d、温度21～25℃条件下培养30d，然后将组培苗移栽至田间进行常规田间培养。
<实施例2>
用体积分数为2％的乙醇水溶液溶解茉莉酸甲酯，配制成浓度为200μmol/L的茉莉酸甲酯溶液，罗汉果授粉25d后，每天喷洒茉莉酸甲酯溶液于罗汉果表面，至表面滴水为止，早、中、晚各喷洒一次，连续喷施10d。
<实施例3>
步骤一、用体积分数为2％的乙醇水溶液溶解茉莉酸甲酯，配制成浓度为50mmol/L茉莉酸甲酯的乙醇母液，并用0.22μm的微孔滤膜灭菌，将灭菌后的茉莉酸甲酯的乙醇母液添加到MS固体培养基中，至茉莉酸甲酯的添加量为50μmol/L，灭菌并冷却至24～26℃，其中，MS固体培养基包括：MS、1.5mg/L 6-苄氨基腺嘌呤、0.3mg/L吲哚丁酸、3.5g/L琼脂、30g/L蔗糖、以及1.0g/L活性炭；
步骤二、将罗汉果组培苗接种在步骤一得到的含有茉莉酸甲酯的MS固体培养基中，置于相对湿度60～66％、光照强度1300～1500Lux、光照时间8h/d、温度21～25℃条件下培养28d；
步骤三、用体积分数为2％的乙醇水溶液溶解茉莉酸甲酯，配制成浓度为50μmol/L的茉莉酸甲酯溶液，将步骤一培养后的组培苗移栽至田间，罗汉果授粉20d后，每天喷洒浓度为50μmol/L的茉莉酸甲酯溶液于罗汉果表面，至表面滴水为止，早、中、晚各喷洒一次，连续喷施8d。
<实施例4>
步骤一、用体积分数为2％的乙醇水溶液溶解茉莉酸甲酯，配制成浓度为400mmol/L茉莉酸甲酯的乙醇母液，并用0.22μm的微孔滤膜灭菌，将灭菌后的茉莉酸甲酯的乙醇母液添加到MS固体培养基中，至茉莉酸甲酯的添加量为400μmol/L，灭菌并冷却至24～26℃，其中，MS固体培养基包括：MS、1.5mg/L 6-苄氨基腺嘌呤、0.3mg/L吲哚丁酸、3.5g/L琼脂、30g/L蔗糖、以及1.0g/L活性炭；
步骤二、将罗汉果组培苗接种在步骤一得到的含有茉莉酸甲酯的MS固体培养基中，置于相对湿度60～66％、光照强度1300～1500Lux、光照时间8h/d、温度21～25℃条件下培养31d；
步骤三、用体积分数为2％的乙醇水溶液溶解茉莉酸甲酯，配制成浓度为400μmol/L的茉莉酸甲酯溶液，将步骤一培养后的组培苗移栽至田间，罗汉果授粉30d后，每天喷洒浓度为400μmol/L的茉莉酸甲酯溶液于罗汉果表面，至表面滴水为止，早、中、晚各喷洒一次，连续喷施12d。
<实施例5>
步骤一、用体积分数为2％的乙醇水溶液溶解茉莉酸甲酯，配制成浓度为200mmol/L茉莉酸甲酯的乙醇母液，并用0.22μm的微孔滤膜灭菌，将灭菌后的茉莉酸甲酯的乙醇母液添加到MS固体培养基中，至茉莉酸甲酯的添加量为200μmol/L，灭菌并冷却至24～26℃，其中，MS固体培养基包括：MS、1.5mg/L 6-苄氨基腺嘌呤、0.3mg/L吲哚丁酸、3.5g/L琼脂、30g/L蔗糖、以及1.0g/L活性炭；
步骤二、将罗汉果组培苗接种在步骤一得到的含有茉莉酸甲酯的MS固体培养基中，置于相对湿度60～66％、光照强度1300～1500Lux、光照时间8h/d、温度21～25℃条件下培养30d；
步骤三、用体积分数为2％的乙醇水溶液溶解茉莉酸甲酯，配制成浓度为200μmol/L的茉莉酸甲酯溶液，将步骤一培养后的组培苗移栽至田间，罗汉果授粉25d后，每天喷洒浓度为200μmol/L的茉莉酸甲酯溶液于罗汉果表面，至表面滴水为止，早、中、晚各喷洒一次，连续喷施10d。
<实施例6>
步骤一、用体积分数为2％的乙醇水溶液溶解茉莉酸甲酯，配制成浓度为200mmol/L茉莉酸甲酯的乙醇母液，并用0.22μm的微孔滤膜灭菌，将灭菌后的茉莉酸甲酯的乙醇母液添加到MS固体培养基中，将调节剂加入MS固体培养基，调节剂的添加量为5μmol/L，茉莉酸甲酯的添加量为200μmol/L，灭菌并冷却至24～26℃，调节剂包括质量比为2:1:0.2的竹醋液、扯根菜水提物、香豆素，MS固体培养基包括：MS、1.5mg/L 6-苄氨基腺嘌呤、0.3mg/L吲哚丁酸、3.5g/L琼脂、30g/L蔗糖、以及1.0g/L活性炭；
步骤二、将罗汉果组培苗接种在步骤一得到的含有茉莉酸甲酯的MS固体培养基中，置于相对湿度60～66％、光照强度1300～1500Lux、光照时间8h/d、温度21～25℃条件下培养30d；组培过程包括两阶段，第一阶段培养15d，每隔3d更换一次MS固体培养基，被更换的MS固体培养基加热至熔化为液态混合物，将海绵浸泡在液态混合物中充分吸收，然后覆盖在更换的MS固体培养基上方，直至下次更换培养基时移除并更换；第二阶段培养15d，每隔5d更换一次MS固体培养基，每次更换后的第2d对接种有组培苗的MS固体培养基进行雾化处理，雾化剂为质量分数为1％的酪蛋白溶液；
步骤三、用体积分数为2％的乙醇水溶液溶解茉莉酸甲酯，配制成浓度为200μmol/L的茉莉酸甲酯溶液，将步骤一培养后的组培苗移栽至田间，授粉后每隔5d喷施促进剂，罗汉果授粉25d后，每天喷洒浓度为200μmol/L的茉莉酸甲酯溶液于罗汉果表面，至表面滴水为止，早、中、晚各喷洒一次，连续喷施10d；其中，促进剂包括质量比为3:3:2:0.1:0.1:10的赤霉素、萘乙酸、吲哚乙酸、芹菜素、复合维生素B以及皂角米蛋白，皂角米蛋白的制备方法为：将皂角米溶解于碱液中，震荡、离心、分离，上清液即得皂角米蛋白。
<对比例1>
将罗汉果种子浸泡在浓度为200μmol/L的茉莉酸甲酯溶液中进行浸种处理，然后进行常规组织培养得到组培苗，最后将组培苗移栽至田间进行常规田间培养。
<对比例2>
将罗汉果外植体浸泡在浓度为200μmol/L的茉莉酸甲酯溶液中进行预处理，然后进行常规组织培养得到组培苗，最后将组培苗移栽至田间进行常规田间培养。
<对比例3>
将罗汉果组培苗接种在MS固体培养基中，置于相对湿度60～66％、光照强度1300～1500Lux、光照时间8h/d、温度21～25℃条件下培养30d；其中，MS固体培养基包括：MS、1.5mg/L 6-苄氨基腺嘌呤、0.3mg/L吲哚丁酸、3.5g/L琼脂、30g/L蔗糖、以及1.0g/L活性炭；然后将组培苗移栽至田间进行常规田间培养。
<罗汉果品质试验>
对实施例2、5、6连续喷施茉莉酸甲酯溶液后的次日采样，对实施例1、对比例1～3果实发育中期授粉30d后采样，统计立枯病发病率以及罗汉果苗成活率，同时采用HPLC法进行罗汉果醇含量检测。
提取：精确称取罗汉果冻干粉(过40目筛)20g，按固液比1:8比例，加入160mL不同浓度甲醇浸泡2h，于50℃和40kHz条件下，用90％甲醇提取30min。提取液用布氏漏斗减压抽滤两次，合并两次滤液，滤液用旋转蒸发仪回收甲醇至体积50mL，加入到分液漏斗内15mL石油醚中萃取2次，回收甲醇层，继续用旋转蒸发仪浓缩甲醇层得到浸膏用于HPLC含量测定。
测定：精确称取样品1.0g，加入90％甲醇100mL超声提取30min，过滤后精密吸取20μL注入高效液相色谱仪。罗汉果醇对照品的浓度为1mg/mL(甲醇溶解)，进样量为2μL。
高效液相色谱检测条件：Agilent 1200高效液相色谱仪，Agilent ZORBAX SBC-18 Column(5μm，250×4.6mm)柱子，50％-100％乙腈梯度洗脱，流动相流速1.0mL/min，检测波长210nm。
数据如下表所示。
由上表可知，对比例1～2相较于对比例3，罗汉果醇的含量没有明显升高，说明浸种、外植体浸泡在茉莉酸甲酯溶液没有明显提升罗汉果醇的含量，实施例1、2的含量相较于对比例3，罗汉果醇的含量有明显升高，说明组培或栽培期间通过茉莉酸甲酯诱导植株生长，能够明显提升罗汉果醇的含量，实施例5、6的含量相较于对比例3，罗汉果醇的含量有显著升高，说明在组培、栽培期间均通过茉莉酸甲酯诱导植株生长，能够显著提升罗汉果醇的含量。此外，实施例1、2、5、6、对比例1、2的立枯病发病率均显著低于对比例3，茉莉酸甲酯还可以显著降低罗汉果的立枯病患病率，实施例1、2、5、6的罗汉果苗成活率均高于对比例1～3，说明组培和/或栽培期间通过茉莉酸甲酯诱导植株生长能提高罗汉果苗成活率。
这里说明的设备数量和处理规模是用来简化本发明的说明的。对本发明的应用、修改和变化对本领域的技术人员来说是显而易见的。
尽管本发明的实施方案已公开如上，但其并不仅仅限于说明书和实施方式中所列运用，它完全可以被适用于各种适合本发明的领域，对于熟悉本领域的人员而言，可容易地实现另外的修改，因此在不背离权利要求及等同范围所限定的一般概念下，本发明并不限于特定的细节和这里示出与描述的实施例。