一种水稻高温抗性突变株的筛选方法与流程

本发明涉及农业生物技术领域，具体地说是一种水稻高温抗性突变株的筛选方法。

背景技术：

我国是稻米生产和消费大国，水稻播种面积和产量均居全国粮食作物首位。现阶段我国稻谷年播种面积在3000万hm以上，产量突破2亿t，约占全国粮食总产量的40%和世界稻谷总产量的30%左右。全国有60%左右的人口以大米为主食，年消费量l.35亿吨。据联合国粮农组织预测，世界人口在2050年将上升至91亿人，全球粮食产出需增长70%才有可能满足迅速增长的人口需求。由此可见水稻生产作为主要粮食来源不仅关系到我国粮食安全而且直接影响到世界粮食安全。

随着社会工业化的不断发展，大量的温室气体被排放到空气中，使得全球温度不断上升，极端高温出现十分常见，有时甚至长时间高温，这使水稻的种植生产受到很大改变，全球热带地区就有超过400万hm²的水稻受热害胁迫，而且还再不断增加。水稻高温热害也是中国稻作的主要自然灾害，主要发生在长江流域以南，较严重的地区是江西的大部、湖南的东部、福建的西部、浙江的西南部、四川的东部和广东的东北部。这些地区的双季早稻开花灌浆期、早熟中稻孕穗期至抽穗开花期，往往处于7-8月盛夏高温季节，从而导致不能正常散粉、受精，籽粒灌浆不饱满，即“高温逼熟”。

高温胁迫导致植物体内O₂^-和大量自由基产生，膜脂过氧化加剧，细胞膜的完整性破坏。研究发现，随高温胁迫时间延长，O₂^-产生速率迅速增大，氧的自由基的产生与清除的平衡被打破。高温使作物质膜饱和程度下降，质膜透性增大，电解质外渗量增大，电导率升高，膜脂过氧化产物-丙二醛的含量增大。高温主要影响类囊体的物理化学性质和结构组织，导致细胞膜的解体和细胞组分的降解。夜间高温胁迫引起水稻叶片叶绿素-蛋白复合体的结合度和叶绿素含量下降，光合效率降低，出现氧化伤害症状。灌浆期高温胁迫引起水稻剑叶叶绿素含量、梭化酶活性降低，光合速率显著下降。高温胁迫后作物体内的蛋白质发生降解，作物体内游离氨基酸含量增加，当氨基酸含量过高时，会使植物产生氨中毒。

研究发现，水稻生殖生长阶段对高温胁迫的敏感程度高于营养生长阶段。水稻减数分裂和抽穗扬花期时期，对温度极为敏感，最适宜的温度是25～30℃，30℃以上就会产生不利影响，当平均温度超过30℃，连续3d以上就会造成花粉的受精程度和花药的生活力下降，以致花粉不能正常发育并最终导致花粉败育，进而影响穗粒数和结实率；水稻抽穗开花期对温度特别敏感，也是受危害最为严重的时期，Satake等研究表明水稻抽穗开花期持续5d的35℃以上高温，就会影响花粉管伸长和正常散粉，导致不能受精而形成空、秕粒；灌浆期遇到高温可以加快水稻灌浆速度，缩短灌浆时间，35℃以上高温就会导致水稻灌浆速率明显下降，子粒的充实度受到影响，使得产量和粒重都显著降低。综合而言，作为产量构成因素中最为重要的结实率的下降是热害最为敏感的指标之一，可综合反映水稻颖花开放、撒粉和受精的综合受害程度，高温下结实率的稳定性是耐热性的重要指标。

加速选育、推广应用耐热性强的优良品种是战胜高温这一自然灾害的根本性措施。常规水稻高温抗性育种工作中，需要给与合适的高温胁迫，从而使不同品种与家系表达出高温抗性遗传特性差异。育种家在进行耐热性品种筛选时，大多采用大田多年多点鉴定的方法，将鉴定田安置于易发生高温热害的地区进行，且当培育出大量后代时，往往给予一定的高温胁迫，然后根据耐热性状差异，再筛选这些后代的耐热性。不同的育种家评价耐热与非耐热品种/家系的标准不尽相同，但是都是根据在高温胁迫下，水稻株高、穗长、粒重、结实率、产量损失等性状进行划分的。由于大田鉴定容易受多种因素（施肥不均等栽培条件差异、水稻抽穗期差异等）的干扰，这些指标往往需要多年多点的重复鉴定才能获得相对可信的结果，因此，常规耐热育种的周期都非常长，一般都7、8年，甚至10年以上，而且需要耗费大量的人力物力。

传统水稻育种的成功主要依赖于一系列优异基因的发掘和利用，突变体的发掘和功能基因组发现的新基因也将大大促进水稻新品种的选育。突变体是某个性状发生可遗传变异的材料，或某个基因发生突变的材料。长期以来，水稻育种家尽力地发现和分离有价值的自然突变和变异材料。我们在早期研究中就发现，水稻花药培养会产生丰富的突变体，由于突变体往往仅是单个性状发生了可遗传变异，因此采用农艺性状优良仅高温抗性不足的育种材料定向筛选水稻高温抗性突变体，是水稻高温抗性育种的一个有效的捷径。

技术实现要素：

本发明的目的是针对现有耐热粳稻育种周期长、育种成本高的缺陷，提供了一种通过选择花培愈伤热处理作为高温抗性突变株筛选压，通过循环热处理、复苏剂处理来保障愈伤的存活，可以有效获得水稻高温抗性突变株，缩短了水稻高温抗性育种周期的水稻高温抗性突变株的筛选方法。

本发明的目的是通过以下技术方案解决的：

一种水稻高温抗性突变株的筛选方法，其特征在于：该筛选方法步骤如下：

1）选择优良的粳稻品种/系作为高温抗性突变株筛选源：选取产量高、米质好、抗性优良但不耐热的粳稻品种/系作为高温抗性突变株的筛选源；

2）取突变株筛选源的花药进行诱导培养，得到花药愈伤后进行热处理：将突变株筛选源正季种植，选取健壮主穗花药进行花药诱导培养，获得花药愈伤组织，待花药愈伤组织普遍长至直径0.3～0.6cm后，调节培养室温度至36～38℃，持续5～7天；

3）挑选花药愈伤转入分化培养基，进行常温分化培养～热处理循环：挑选直径为0.4～0.7cm的花药愈伤组织，转入分化培养基，进行常温分化培养，温度控制为25～27℃，时间控制为7～9天，再变换为热处理，温度控制为36～38℃，时间控制为3～4天，然后恢复至常温分化培养，如此常温分化培养～热处理循环4～5次至褐化愈伤组织部分达到90%；

4）将活性愈伤投入复苏剂中浸泡，然后转入新分化培养基中继续分化培养：热处理后愈伤组织绝大部分褐化变黑，一些愈伤组织白化丧失活性，切下褐化和白化部分，将留下的活性愈伤投入复苏剂中浸泡处理，然后将活性愈伤转入新的分化培养基中继续分化培养；

5）愈伤组织诱导出苗后，转入继代培养基中壮苗，炼苗后移栽入温室：部分愈伤组织经过热处理、复苏剂处理后存活下来，并分化出苗，待花培苗长至2cm之后转接于继代培养基进行壮苗，待花培苗长至8cm后打开封口膜炼苗，10～15天后移栽入温室；

6）花培苗单株收种获得花培家系，进一步高温抗性筛选获得高温抗性突变株：温室内花培单株收种，获得粳稻花培家系若干，正季将收获的花培家系大田种植，以筛选源为对照，筛选耐热性得到改良的水稻高温抗性突变株。

所述步骤2）中进行花药诱导培养的具体过程如下：

（2.1）取材与预处理：将选取的突变株筛选源正季大田常规栽培，取叶枕距为5～7cm、穗与花药呈淡黄绿色、花药长度为颖壳的1/3～1/2且孕穗不裂开的健壮主穗，保留2～3张叶片，75%酒精表面消毒，用湿纱布包裹后置于4℃冰箱中低温预处理2～3天；

（2.2）接种：预处理后，将含主穗的稻苞剪下，然后将该稻苞浸泡于75%的酒精中表面消毒3～4min，接着将该稻苞转移于超净工作台中剥离主穗，进一步剥取小穗为大小均匀的小支梗，接下来用消毒过的纱布包裹小支梗，然后将纱布投入浓度为0.1%的升汞灭菌10min，无菌水漂洗3～4次，打开纱布晾干，最后用消毒过的剪刀剪开花药上部，抖药法接种花药于诱导培养基。

所述步骤（2.2）中的花药诱导培养基配方为：N6大量元素+MS微量元素+MS有机质+2mg/L2,4-D+0.5mg/LNAA+0.5mg/L水解蛋白+5%蔗糖+0.8%植物凝胶，pH值为5.8。

所述步骤2）中诱导培养的培养条件控制为：温度26～28℃，暗培养。

所述步骤3）常温分化培养与热处理的光照条件均为：光照强度为1000～1500Lux，光周期为14h光/10h暗。

所述步骤3）和4）中分化培养基配方为：MS无机盐+MS有机物+蔗糖3%+琼脂0.7%+KT2.0mg/L+NAA0.5 mg/L+水解蛋白1g/L，pH值为5.8。

所述步骤4）中活性愈伤特点为：结构疏松、表面具球形颗粒、颜色浅而透明。

所述步骤4）中复苏剂成分为：维生素C 0.3～0.4g/L，维生素E 0.6～0.8g/L，Na₂-EDTA 0.8～1.0g/L，FeSO₄∙7H₂O 0.5～0.7g/L，ZnSeO₄·5H₂O1.2～1.5g/L，MgSO₄·7H₂O 0.6～0.8g/L，植物硫化激动素PSK-α 0.02～0.03μmol/L。

所述步骤5）中继代培养基配方为：1/2MS大量+MS微量+MS有机物+蔗糖3%+多效唑 0.2～0.3mg/L+琼脂0.8%，pH值为5.8。

本发明相比现有技术有如下优点：

常规耐热粳稻育种中待鉴定水稻材料只有发育到生殖生长阶段再通过热处理后表型差异来鉴定水稻材料的耐热性，由于鉴定表型易受多种因素的干扰，因此需要多年多点的重复才能获得相对可信的结果，所以常规耐热育种周期都非常长，一般都7、8年，甚至10年以上，且需要耗费大量的人力物力。本发明的水稻高温抗性突变株的筛选方法创造性的通过选择花培愈伤热处理来进行筛选水稻高温抗性突变株，不仅节约了大量的人力物力，而且鉴定结果更准确，鉴定周期更短，从而大大降低了育种成本。

水稻愈伤组织是一团结构疏松、表面具球形颗粒、颜色浅而透明的薄壁细胞团，非常娇嫩，通常置于高温下会逐渐衰老褐化，丧失生长活性。本发明通过常温分化培养～热处理循环的方式，既实现了热处理筛选的目的，又减弱了愈伤组织损伤，进而通过复苏剂浸泡处理来提高了愈伤组织的活性，保障了耐热愈伤的存活率。

附图说明

附图1为育种主干品系F199的花培愈伤经过复苏剂处理后恢复活性，转入新分化培养基继续分化生长的照片；

附图2为采用本发明技术路线，不耐热水稻品系的花培愈伤组织中分化出高温抗性突变株的照片。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明作进一步的说明。

一种水稻高温抗性突变株的筛选方法，其特征在于：该筛选方法步骤如下：

1）选择优良的粳稻品种/系作为高温抗性突变株筛选源：

选取产量高、米质好、抗性优良但不耐热的粳稻品种/系作为高温抗性突变株的筛选源；

2）取突变株筛选源的花药进行诱导培养，得到花药愈伤后进行热处理：

将突变株筛选源正季种植，选取健壮主穗花药进行花药诱导培养，花药诱导培养的具体过程如下：

（2.1）取材与预处理：将选取的BCF1杂交种正季大田常规栽培，取叶枕距为5～7cm、穗与花药呈淡黄绿色、花药长度为颖壳的1/3～1/2且孕穗不裂开的健壮主穗，保留2～3张叶片，75%酒精表面消毒，用湿纱布包裹后置于4℃冰箱中低温预处理2～3天；

（2.2）接种：预处理后，将含主穗的稻苞剪下，然后将该稻苞浸泡于75%的酒精中表面消毒3～4min，接着将该稻苞转移于超净工作台中剥离主穗，进一步剥取小穗为大小均匀的小支梗，接下来用消毒过的纱布包裹小支梗，然后将纱布投入浓度为0.1%的升汞灭菌10min，无菌水漂洗3～4次，打开纱布晾干，最后用消毒过的剪刀剪开花药上部，抖药法接种花药于诱导培养基（花药诱导培养基配方为：N6大量元素+MS微量元素+MS有机质+2mg/L2,4-D+0.5mg/LNAA+0.5mg/L水解蛋白+5%蔗糖+0.8%植物凝胶，pH值为5.8）；

花药诱导培养的培养条件控制为：温度25～27℃，暗培养；花药诱导培养获得花药愈伤组织，待愈伤组织普遍长至直径0.3～0.6cm后，调节培养室温度至35～36℃，持续5～7天；

3）挑选花药愈伤转入分化培养基，进行常温分化培养～热处理循环：

挑选直径为0.4～0.7cm的花药愈伤组织，转入分化培养基（分化培养基配方为：MS无机盐+MS有机物+蔗糖3%+琼脂0.7%+KT2.0mg/L+NAA0.5 mg/L+水解蛋白1g/L，pH值为5.8），进行常温分化培养，温度控制为25～27℃，时间控制为7～9天，再变换为热处理，温度控制为35～36℃，时间控制为3～4天，然后恢复至常温分化培养，如此常温分化培养～热处理循环3～4次至褐化愈伤组织部分超过一半，常温分化培养与热处理的光照条件均为：光照强度为1000～1500Lux，光周期为14h光/10h暗；

4）将活性愈伤投入复苏剂中浸泡，然后转入新分化培养基中继续分化培养：

热处理后愈伤组织部分褐化变黑，一些愈伤组织白化丧失活性，切下褐化和白化部分，留下的活性愈伤结构疏松、表面具球形颗粒、颜色浅而透明，将活性愈伤投入湿热灭菌过的复苏剂中浸泡处理（复苏剂成分为：每升水含维生素C 0.3～0.4g、维生素E 0.6～0.8g、Na₂-EDTA 0.8～1.0g、FeSO₄∙7H₂O 0.5～0.7g、ZnSeO₄·5H₂O1.2～1.5g、MgSO₄·7H₂O 0.6～0.8g、植物硫化激动素PSK-α 0.02～0.03μmol），浸泡处理的时间为6-8h；然后将活性愈伤转入新的分化培养基中继续分化培养；

5）愈伤组织诱导出苗后，转入继代培养基中壮苗，炼苗后移栽入温室：

部分愈伤组织经过热处理、复苏剂处理后存活下来，并分化出苗，待花培苗长至2cm之后转接于继代培养基（继代培养基配方为：1/2MS大量+MS微量+MS有机物+蔗糖3%+多效唑 0.2～0.3mg/L+琼脂0.8%，pH值为5.8）进行壮苗，待花培苗长至8cm后打开封口膜炼苗，10～15天后移栽入温室；

6）花培苗单株收种获得花培家系，进一步高温抗性筛选获得高温抗性突变株：

温室内花培单株收种，获得粳稻花培家系若干，正季将收获的花培家系大田种植，以筛选源为对照，筛选耐热性得到改良的水稻高温抗性突变株。

实施例

一、选择F199作为高温抗性突变株筛选源：

多年育种实践我们筛选出育种主干品系F199，F199具有产量高、米质优良、多抗（高抗条纹叶枯病、稻曲病、稻瘟病，中抗纹枯病、黑条矮缩病）的优点，全生育期151天左右，是优良的中熟中粳的育种骨干，但F199高温抗性不足，2013年F199种植于江苏东辛农场，当年7～8月遭受到了高温热害，造成F199高温逼熟，空秕率达到31.2%，千粒重下降了10.3%，高温抗性有待改良。

二、取F199的花药进行诱导培养，得到花药愈伤后进行热处理：

将F199正季种植，选取健壮主穗花药进行花药诱导培养，花药诱导培养的培养条件控制为：温度26℃，暗培养；花药诱导培养25天左右获得花药愈伤组织，42天后愈伤组织普遍长至直径0.3～0.6cm后，调节培养室温度至35.5℃，持续6天。

3）挑选花药愈伤转入分化培养基，进行常温分化培养～热处理循环：

一次热处理后，挑选直径为0.4～0.7cm的花药愈伤组织，转入分化培养基（分化培养基配方为：MS无机盐+MS有机物+蔗糖3%+琼脂0.7%+KT2.0mg/L+NAA0.5 mg/L+水解蛋白1g/L，pH值为5.8），置于培养室培养，培养室光照条件为：光照强度为1300Lux，光周期为14h光/10h暗，先进行常温分化培养，温度控制为26℃，时间控制为8天，再变换为热处理，温度控制为35.5℃，时间控制为3.5天，然后恢复至常温分化培养，如此常温分化培养～热处理循环，1次循环后部分愈伤组织色泽开始变暗，愈伤组织边缘出现褐纹，2次循环后部分愈伤组织褐化，褐化部位从边缘迅速蔓延，3次循环后愈伤组织褐化程度显著，按体积算，约半数愈伤组织发生褐化，4次循环后，愈伤组织褐化程度严重，按体积算，约90%愈伤组织发生褐化或白化，此时停止热处理。

4）将活性愈伤投入复苏剂中浸泡，然后转入新分化培养基中继续分化培养：

将培养室培养的愈伤组织于超净工作台中切下褐化和白化部分，留下的活性愈伤结构疏松、表面具球形颗粒、颜色浅而透明，将活性愈伤投入湿热灭菌过的复苏剂中浸泡处理（复苏剂成分为：每升水含维生素C 0.35g、维生素E 0.7g、Na₂-EDTA 0.9g、FeSO₄∙7H₂O 0.6g、ZnSeO₄·5H₂O 1.35g、MgSO₄·7H₂O 0.7g、植物硫化激动素PSK-α 0.025μmol），浸泡处理的时间为7h；然后将活性愈伤转入新的分化培养基中继续分化培养。

为检验不同处理方式对水稻愈伤组织分化效果的影响，同期进行对比试验，选择培养室培养的相同或相近的愈伤组织进行试验：第一组进行复苏剂浸泡处理试验，处理时间7h；第二组采用灭菌水浸泡处理，处理时间7h；第三组不进行任何处理。第一组和第二组处理后转入新分化培养基，第三组直接转入新分化培养基。35天后愈伤组织分化成苗（如说明书附图1和说明书附图2所示），统计愈伤组织分化率，结果如下表1。

由表1试验结果可以发现，对热处理后的愈伤组织进行复苏剂浸泡处理可以显著提高愈伤组织的活性，从而大大提高了愈伤组织分化率和绿苗比例，保障了少量耐热愈伤的存活，而灭菌水处理对愈伤组织分化没有显著效果。

5）愈伤组织诱导出苗后，转入继代培养基中壮苗，炼苗后移栽入温室：

少数愈伤组织经过热处理、复苏剂处理后存活下来，并分化出苗，待花培苗长至2cm之后转接于继代培养基（继代培养基配方为：1/2MS大量+MS微量+MS有机物+蔗糖3%+多效唑 0.2～0.3mg/L+琼脂0.8%，pH值为5.8）进行壮苗，待花培苗长至8cm后打开封口膜炼苗，13天后移栽入温室。

6）花培苗单株收种获得花培家系，进一步农艺性状、耐热筛选获得耐热粳稻新品系：

2015年8月上旬，温室内花培单株收种，获得花培家系23个，2016年正季将收获的花培家系大田种植，以育种骨干F199为对照，筛选获得2个耐热性得到改良的粳稻新品系（其余21个为假高温抗性突变株），进入后续的品比试验。

本发明通过选择花培愈伤热处理作为高温抗性突变株筛选压，通过循环热处理、复苏剂处理来保障愈伤的存活，可以有效获得水稻高温抗性突变株，缩短了水稻高温抗性育种周期，具有较大的育种应用价值。

以上实施例仅为说明本发明的技术思想，不能以此限定本发明的保护范围，凡是按照本发明提出的技术思想，在技术方案基础上所做的任何改动，均落入本发明保护范围之内；本发明未涉及的技术均可通过现有技术加以实现。