本发明涉及金叶过路黄组织培养快速繁殖方法，属于金叶过路黄的栽培种植技术领域。
背景技术：
金叶过路黄是报春花科过路黄属多年生匍匐茎宿根草本植物，具丰富的地表匍匐茎，茎节较短，节间能着地生根；叶卵圆形，叶色金黄色，具有较高的观赏价值，是不可多得的耐粗放管理的彩叶地被植物。其生长期长、绿色持续期长，能够平卧匍匐生长，蔓延扩展能力很强，植株极富密集性，平卧整齐。因其耐粗放管理、耐旱、耐寒、耐热性强，近年来金叶过路黄在国内外绿化产业中需求日益旺盛，因此应加快其繁殖速度，满足其日益增加的市场需求，对推动园林建设事业的发展，特别是对绿地建设具有一定的实用价值。自然条件下以种子和分株形式繁殖，种子繁殖的繁殖周期为1年以上，成活率60％～70％；分株繁殖的繁殖周期虽低于1年，但成活率较低，成活率90％左右，繁殖系数小于1。由于其繁殖速度较慢，繁殖系数和成活率低限制了它的推广应用。
技术实现要素：
发明目的：本发明所要解决的技术问题是提供金叶过路黄组织培养快速繁殖方法，通过组培繁殖可以提高金叶过路黄的繁殖系数和成活率及繁殖速度，这对丰富我国彩叶绿化地被植物有一定的意义。本研究以金叶过路黄无芽茎段为外植体材料，通过不同的培养基诱导其产生愈伤组织、不定芽、芽增殖及生根，建立金叶过路黄组培快繁体系，以期采用组培技术进行大量繁殖，丰富种质资源。
技术方案：为解决上述技术问题，本发明所采用的技术方案为：本发提供了金叶过路黄组织培养快速繁殖方法，包括以下步骤：
1)消毒灭菌：选取金叶过路黄的当年生枝条，以顶端芽为起始芽截取第二个芽至第三个芽之间的无芽茎段为外植体，将外植体放在流水下反复冲洗1h～2h，加入适量的洗涤剂浸泡清洗3次，边浸泡边振荡，冲洗干净后移至超净工作台进行下一步的消毒处理：先用体积浓度75％酒精浸泡20s～25s，用无菌水反复冲洗振荡外植体至少3次，每次冲洗时间不少于5min；再转入质量浓度0.1％的升汞消毒10min～15min，用无菌水反复冲洗干净后，用灭菌纸将外植体表面的水分吸干；
2)愈伤组织的诱导：将消毒灭菌好的金叶过路黄外植体横向切成0.2cm～0.4cm长的小段，并用刀片在茎段表面纵向划几刀，然后接种在诱导愈伤组织的培养基上培养获得愈伤组织；
3)愈伤组织的分化培养：外观表现良好的愈伤组织切成2mm～3mm的小块，接入分化培养基中进行分化培养，在愈伤组织上萌发出一定数量的不定芽；
4)壮苗培养：将不定芽切接种于壮苗培养基上进行壮苗培养得到健壮、且色泽翠绿的无根幼苗；
5)生根培养：把健壮的金叶过路黄无根幼苗转移到生根培养基上培养每苗分化出4～6条根；
6)金叶过路黄的炼苗及移栽：生根后的幼苗在温度20±2℃的温室内拧松瓶盖放置3d～5d进行炼苗然后再移栽。
其中，上述步骤2)中的诱导愈伤组织的培养基配方为：ms+6-ba(0.4～0.5)mg/l+zt0.2mg/l+2,4-d0.05mg/l+蔗糖30mg/l+琼脂7mg/l，ph值5.6～5.8。
其中，上述步骤2)中的培养条件为：温度22±2℃、暗培养、培养地点为无菌培养室。
其中，上述步骤3)中的分化培养基的配方为：ms+6-ba(0.4～0.5)mg/l+zt0.3mg/l+naa0.1mg/l+蔗糖30mg/l+琼脂7mg/l，ph值5.8～6.0。
其中，上述步骤3)中的培养条件为：温度22±2℃、光照强度1500～2000lx、光照时间10～12h/d、培养地点为无菌培养室。
其中，上述步骤4)中的壮苗培养基的配方为，ms+6-ba(0.4～0.5)mg/l+zt0.5mg/l+naa0.2mg/l+蔗糖30mg/l+琼脂7mg/l，ph值5.7～6.0。
其中，上述步骤4)中的培养条件为：温度25±2℃、光照强度2000～2500lx、光照时间12～15h/d、培养地点无菌培养室。
其中，上述步骤5)中的生根培养基配方为：1/4ms+naa(0.2～0.5)mg/l+活性炭3g/l+蔗糖25mg/l+琼脂7mg/l，ph值5.7～6.0。
其中，上述步骤5)中的培养条件为：温度20±2℃、光照强度1500～2000lx、光照时间10～12h/d、培养地点无菌培养室。
其中，上述步骤6)中的的移栽的栽培基质由园土、沙、泥炭按(1～2):1:1的体积比混合制成，栽培基质须经过灭菌，充分混匀后使用，移栽后，将栽培基质浇透水，并喷施800倍～1000倍质量百分比50％～60％多菌灵药液，以后每隔两周喷施一次，连续3次，移栽初期要注意保持基质和空气的湿度，湿度保持在70％～80％左右，温度22±2℃，前期应用遮光率25％～50％的遮阳网进行遮阴10d～15d；全封闭管理5d～7d，在10d左右可以逐步通风，20d可除去覆盖物。
有益效果：本发明相对于现有技术，具备如下优点：本发明的金叶过路黄组织培养快速繁殖方法，通过建立金叶过路黄的组培快繁体系，金叶过路黄从无芽茎段的外植体到移栽成活经历时长260d～280d，繁殖系数为6～7，成活率95％以上。
具体实施方式
根据下述实施例，可以更好地理解本发明。然而，本领域的技术人员容易理解，实施例所描述的内容仅用于说明本发明，而不应当也不会限制权利要求书中所详细描述的本发明。
本发明中使用的试剂：iba：吲哚丁酸；naa：萘乙酸；6-ba：6-苄氨基腺嘌呤；zt：玉米素；2,4-d：2，4-二氯苯氧乙酸；以上均为常规试剂，均可在市场上购买得到。
实施例1：
金叶过路黄组培快繁体系的建立，步骤如下：
一、金叶过路黄的组织培养
1.消毒灭菌
选取金叶过路黄的当年生枝条，以顶端芽为起始芽截取第二个芽至第三个芽之间的无芽茎段为外植体。将外植体放在流水下反复冲洗2h，加入适量的洗涤剂浸泡清洗3次，边浸泡边振荡，冲洗干净后移至超净工作台进行下一步的消毒处理。消毒处理为：先用体积浓度75％酒精浸泡20s，用无菌水反复冲洗振荡外植体至少3次，每次冲洗时间不少于5min；再转入质量浓度0.1％的升汞(hgcl2)消毒10min，用无菌水反复冲洗干净后，用灭菌纸将外植体表面的水分吸干。将消毒好的无芽茎段横向切成0.2cm～0.4cm长的小段，并用刀片在茎段表面纵向划几刀，然后接种在诱导愈伤组织的培养基上。
2.接种培养
2.1愈伤组织的诱导
将经过消毒灭菌的金叶过路黄外植体切成相应的小段后接种在诱导愈伤组织的培养基上，诱导愈伤组织的培养基配方为：ms+6-ba0.4mg/l+zt0.2mg/l+2,4-d0.05mg/l+蔗糖30mg/l+琼脂7mg/l，ph值5.6～5.8。培养条件为：温度22±2℃、暗培养、培养地点无菌培养室。外植体接种在诱导愈伤组织的培养基上培养15d，在茎段伤口处开始出现愈伤组织，30d后愈伤组织诱导率达到100％。愈伤诱导率(％)＝诱导出愈伤组织的外植体数/接种的外植体数。形成的愈伤组织绝大多数较致密、呈颗粒状、黄绿色，属于外观表现良好的愈伤组织；极少数较疏松、呈水浸状、黄白色，此类愈伤组织不易分化培养出不定芽。愈伤组织的诱导是在塑料组培瓶内进行，组培瓶的规格为：容量240ml，高90mm，直径68mm，口径62mm。愈伤组织的分化培养、壮苗培养、生根培养均是在同种规格的组培瓶内进行。
2.2愈伤组织的分化培养
将外观表现良好的愈伤组织切成2mm～3mm的小块，接入分化培养基中进行分化培养，培养条件为：温度22±2℃、光照强度1500lx、光照时间10h/d、培养地点无菌培养室。分化培养基的配方为：ms+6-ba0.5mg/l+zt0.3mg/l+naa0.1mg/l+蔗糖30mg/l+琼脂7mg/l，ph值5.8～6.0。分化培养约30d在愈伤组织上萌发出一定数量的不定芽，40d后对分化的不定芽进行观察和统计，计算出分化率(分化出芽的材料数/接种的材料数)，分化率达97.6％。以后每40d转接一次，进行继代分化培养，经过几次分化培养后，达到6～7倍左右时，进行壮苗培养。
2.3壮苗培养
由于分化培养出的不定芽比较幼嫩，有必要进行一定的壮苗培养。将不定芽切接种于壮苗培养基上进行壮苗培养。壮苗培养基的配方为，ms+6-ba0.5mg/l+zt0.5mg/l+naa0.2mg/l+蔗糖30mg/l+琼脂7mg/l，ph值5.7～6.0，培养条件为：温度25±2℃、光照强度2500lx、光照时间15h/d、培养地点无菌培养室。壮苗培养30d后，发现金叶过路黄的不定芽变成健壮、且色泽翠绿的幼苗。
2.4生根培养
把健壮的金叶过路黄无根幼苗转移到生根培养基上培养。生根培养基配方为：1/4ms+naa0.2mg/l+活性炭3g/l+蔗糖25mg/l+琼脂7mg/l，ph值5.7～6.0，培养条件为：温度20±2℃、光照强度2000lx、光照时间12h/d、培养地点无菌培养室。10d左右有根生出，生根率达100％，40d～50d每苗可分化出4～6条根，即可进行炼苗移栽。
二、金叶过路黄的炼苗及移栽
金叶过路黄组培苗炼苗可先在温度20±2℃的温室内拧松瓶盖放置3d～5d，然后进行移栽。移栽时，将幼苗从组培瓶内取出，用清水将金叶过路黄组培苗根部的固体培养基清洗干净。栽培基质由园土、沙、泥炭按2:1:1的体积比混合制成，栽培基质须经过灭菌，充分混匀后使用。移栽后，将栽培基质浇透水，并喷施800倍质量百分比50％多菌灵药液，以后每隔两周喷施一次，连续3次。移栽初期要注意保持基质和空气的湿度，湿度保持在70％～80％左右，温度22±2℃，前期用遮光率25％的遮阳网进行遮阴10d～15d；全封闭管理5d～7d左右，在10d左右可以逐步通风，20d左右可除去覆盖物。移栽后约30d可见金叶过路黄幼苗生长良好，成活率可达96.5％。
实施例2：
金叶过路黄组培快繁体系的建立，步骤如下：
一、金叶过路黄的组织培养
1.消毒灭菌
选取金叶过路黄的当年生枝条，以顶端芽为起始芽截取第二个芽至第三个芽之间的无芽茎段为外植体。将外植体放在流水下反复冲洗1h，加入适量的洗涤剂浸泡清洗3次，边浸泡边振荡，冲洗干净后移至超净工作台进行下一步的消毒处理。消毒处理为：先用体积浓度75％酒精浸泡25s，用无菌水反复冲洗振荡外植体至少3次，每次冲洗时间不少于5min；再转入质量浓度0.1％的升汞(hgcl2)消毒15min，用无菌水反复冲洗干净后，用灭菌纸将外植体表面的水分吸干。将消毒好的无芽茎段横向切成0.2cm～0.4cm长的小段，并用刀片在茎段表面纵向划几刀，然后接种在诱导愈伤组织的培养基上。
2.接种培养
2.1愈伤组织的诱导
将经过消毒灭菌的金叶过路黄外植体切成相应的小段后接种在诱导愈伤组织的培养基上，诱导愈伤组织的培养基配方为：ms+6-ba0.5mg/l+zt0.2mg/l+2,4-d0.05mg/l+蔗糖30mg/l+琼脂7mg/l，ph值5.6～5.8。培养条件为：温度22±2℃、暗培养、培养地点无菌培养室。外植体接种在诱导愈伤组织的培养基上培养15d，在茎段伤口处开始出现愈伤组织，30d后愈伤组织诱导率达到100％。愈伤诱导率(％)＝诱导出愈伤组织的外植体数/接种的外植体数。形成的愈伤组织绝大多数较致密、呈颗粒状、黄绿色，属于外观表现良好的愈伤组织；极少数较疏松、呈水浸状、黄白色，此类愈伤组织不易分化培养出不定芽。愈伤组织的诱导是在塑料组培瓶内进行，组培瓶的规格为：容量240ml，高90mm，直径68mm，口径62mm。愈伤组织的分化培养、壮苗培养、生根培养均是在同种规格的组培瓶内进行。
2.2愈伤组织的分化培养
将外观表现良好的愈伤组织切成2mm～3mm的小块，接入分化培养基中进行分化培养，培养条件为：温度22±2℃、光照强度1500lx、光照时间10h/d、培养地点无菌培养室。分化培养基的配方为：ms+6-ba0.4mg/l+zt0.3mg/l+naa0.1mg/l+蔗糖30mg/l+琼脂7mg/l，ph值5.8～6.0。分化培养约30d在愈伤组织上萌发出一定数量的不定芽，40d后对分化的不定芽进行观察和统计，计算出分化率(分化出芽的材料数/接种的材料数)，分化率达98.2％。以后每40d转接一次，进行继代分化培养，经过几次分化培养后，达到6～7倍左右时，进行壮苗培养。
2.3壮苗培养
由于分化培养出的不定芽比较幼嫩，有必要进行一定的壮苗培养。将不定芽切接种于壮苗培养基上进行壮苗培养。壮苗培养基的配方为，ms+6-ba0.4mg/l+zt0.5mg/l+naa0.2mg/l+蔗糖30mg/l+琼脂7mg/l，ph值5.7～6.0，培养条件为：温度25±2℃、光照强度2000lx、光照时间12h/d、培养地点无菌培养室。壮苗培养30d后，发现金叶过路黄的不定芽变成健壮、且色泽翠绿的幼苗。
2.4生根培养
把健壮的金叶过路黄无根幼苗转移到生根培养基上培养。生根培养基配方为：1/4ms+naa0.5mg/l+活性炭3g/l+蔗糖25mg/l+琼脂7mg/l，ph值5.7～6.0，培养条件为：温度20±2℃、光照强度2000lx、光照时间10h/d、培养地点无菌培养室。10d左右有根生出，生根率达100％，40d～50d每苗可分化出4～6条根，即可进行炼苗移栽。
二、金叶过路黄的炼苗及移栽
金叶过路黄组培苗炼苗可先在温度20±2℃的温室内拧松瓶盖放置3d～5d，然后进行移栽。移栽时，将幼苗从组培瓶内取出，用清水将金叶过路黄组培苗根部的固体培养基清洗干净。栽培基质由园土、沙、泥炭按1:1:1的体积比混合制成，栽培基质须经过灭菌，充分混匀后使用。移栽后，将栽培基质浇透水，并喷施1000倍质量百分比60％多菌灵药液，以后每隔两周喷施一次，连续3次。移栽初期要注意保持基质和空气的湿度，湿度保持在70％～80％左右，温度22±2℃，前期用遮光率50％的遮阳网进行遮阴10d～15d；全封闭管理5d～7d左右，在10d左右可以逐步通风，20d左右可除去覆盖物。移栽后约30d可见金叶过路黄幼苗生长良好，成活率可达95.8％。
实施例3
金叶过路黄组培快繁体系的建立，步骤如下：
一、金叶过路黄的组织培养
1.消毒灭菌
选取金叶过路黄的当年生枝条，以顶端芽为起始芽截取第二个芽至第三个芽之间的无芽茎段为外植体。将外植体放在流水下反复冲洗1h，加入适量的洗涤剂浸泡清洗4次，边浸泡边振荡，冲洗干净后移至超净工作台进行下一步的消毒处理。消毒处理为：先用体积浓度75％酒精浸泡22s，用无菌水反复冲洗振荡外植体至少3次，每次冲洗时间不少于5min；再转入质量浓度0.1％的升汞(hgcl2)消毒12min，用无菌水反复冲洗干净后，用灭菌纸将外植体表面的水分吸干。将消毒好的无芽茎段横向切成0.2cm～0.4cm长的小段，并用刀片在茎段表面纵向划几刀，然后接种在诱导愈伤组织的培养基上。
2.接种培养
2.1愈伤组织的诱导
将经过消毒灭菌的金叶过路黄外植体切成相应的小段后接种在诱导愈伤组织的培养基上，诱导愈伤组织的培养基配方为：ms+6-ba0.45mg/l+zt0.2mg/l+2,4-d0.05mg/l+蔗糖30mg/l+琼脂7mg/l，ph值5.6～5.8。培养条件为：温度22±2℃、暗培养、培养地点无菌培养室。外植体接种在诱导愈伤组织的培养基上培养15d，在茎段伤口处开始出现愈伤组织，30d后愈伤组织诱导率达到100％。愈伤诱导率(％)＝诱导出愈伤组织的外植体数/接种的外植体数。形成的愈伤组织绝大多数较致密、呈颗粒状、黄绿色，属于外观表现良好的愈伤组织；极少数较疏松、呈水浸状、黄白色，此类愈伤组织不易分化培养出不定芽。愈伤组织的诱导是在塑料组培瓶内进行，组培瓶的规格为：容量240ml，高90mm，直径68mm，口径62mm。愈伤组织的分化培养、壮苗培养、生根培养均是在同种规格的组培瓶内进行。
2.2愈伤组织的分化培养
将外观表现良好的愈伤组织切成2mm～3mm的小块，接入分化培养基中进行分化培养，培养条件为：温度22±2℃、光照强度2000lx、光照时间12h/d、培养地点无菌培养室。分化培养基的配方为：ms+6-ba0.45mg/l+zt0.3mg/l+naa0.1mg/l+蔗糖30mg/l+琼脂7mg/l，ph值5.8～6.0。分化培养约30d在愈伤组织上萌发出一定数量的不定芽，40d后对分化的不定芽进行观察和统计，计算出分化率(分化出芽的材料数/接种的材料数)，分化率达98.7％。以后每40d转接一次，进行继代分化培养，经过几次分化培养后，达到6～7倍左右时，进行壮苗培养。
2.3壮苗培养
由于分化培养出的不定芽比较幼嫩，有必要进行一定的壮苗培养。将不定芽切接种于壮苗培养基上进行壮苗培养。壮苗培养基的配方为，ms+6-ba0.45mg/l+zt0.5mg/l+naa0.2mg/l+蔗糖30mg/l+琼脂7mg/l，ph值5.7～6.0，培养条件为：温度25±2℃、光照强度2500lx、光照时间12h/d、培养地点无菌培养室。壮苗培养30d后，发现金叶过路黄的不定芽变成健壮、且色泽翠绿的幼苗。
2.4生根培养
把健壮的金叶过路黄无根幼苗转移到生根培养基上培养。生根培养基配方为：1/4ms+naa0.4mg/l+活性炭3g/l+蔗糖25mg/l+琼脂7mg/l，ph值5.7～6.0，培养条件为：温度20±2℃、光照强度2000lx、光照时间12h/d、培养地点无菌培养室。10d左右有根生出，生根率达100％，40d～50d每苗可分化出4～6条根，即可进行炼苗移栽。
二、金叶过路黄的炼苗及移栽
金叶过路黄组培苗炼苗可先在温度20±2℃的温室内拧松瓶盖放置3d～5d，然后进行移栽。移栽时，将幼苗从组培瓶内取出，用清水将金叶过路黄组培苗根部的固体培养基清洗干净。栽培基质由园土、沙、泥炭按1.5:1:1的体积比混合制成，栽培基质须经过灭菌，充分混匀后使用。移栽后，将栽培基质浇透水，并喷施800倍质量百分比60％多菌灵药液，以后每隔两周喷施一次，连续3次。移栽初期要注意保持基质和空气的湿度，湿度保持在70％～80％左右，温度22±2℃，前期用遮光率50％的遮阳网进行遮阴10d～15d；全封闭管理5d～7d左右，在10d左右可以逐步通风，20d左右可除去覆盖物。移栽后约30d可见金叶过路黄幼苗生长良好，成活率可达97.2％。
实施例4：试验田育苗效果验证
对照组1：与实施例1基本一样，所不同的是诱导愈伤组织的培养基配方为：ms+6-ba0.1mg/l+zt0.2mg/l+2,4-d0.05mg/l+蔗糖30mg/l+琼脂7mg/l；
对照组2：与实施例2基本一样，所不同的是分化培养基的配方为：ms+6-ba0.1mg/l+zt0.3mg/l+naa0.1mg/l+蔗糖30mg/l+琼脂7mg/l；
对照组3：与实施例3基本一样，所不同的是生根培养基配方为：1/2ms+naa0.4mg/l+活性炭3g/l+蔗糖25mg/l+琼脂7mg/l；
实施例1组：与实施例1一样；
实施例2组：与实施例2一样；
实施例3组：与实施例3一样。
根据对照组1、对照组2、对照组3、实施例1组、实施例2组和实施例3组，考察愈伤组织诱导率、分化培养的分化率、生根培养的生根率和移栽后成活率。结果见表1：
表1各组别效果情况表
由表1可看出，实施例1组、实施例2组和实施例3组的愈伤组织诱导率、分化培养的分化率、生根培养的生根率及组培苗的成活率均较高，且三者无显著差别。而对照组1的各指标均显著低于实施例1～3；对照组2的愈伤组织诱导率为100％，但其其他指标均显著低于实施例1～3；对照组3的愈伤组织诱导率和分化率与实施例1～3相比无显著差异，但其生根率和成活率显著低于实施例1～3。