一种金红茵芋的快速繁殖方法与流程

本发明属于生物学领域，涉及一种植物的繁殖方法，具体来说是一种金红茵芋的快速繁殖方法。

背景技术：

茵芋属(skimmiathunb)植物为芸香科常绿花灌木，世界已知7或8种，分布于喜马拉雅山至日本，我国有3或4种，产西南部至南部，野生于山林、溪谷、路旁等处。喜温暖气候和光照充足的地方，也稍耐阴，喜湿润、肥沃壤土，不耐寒，园林中常作林缘种植，也可作盆景。除此之外，茵芋还是一种传统中药，有镇痛、抗炎活性等药效，相关学者在茵芋属的成分、药理、临床应用等方面做了诸多研究。目前茵芋主要依靠籽播、扦插进行繁育。

园艺栽培品种金红茵芋(skimmiajaponica‘rnbella’)，也称鲁贝拉茵芋、金丝香茵，圆锥花序顶生，小花乳白色极芳香，可提取芳香油。浆果，红色，秋冬季节红果，经久不落，深受人们喜爱(图1)，切枝也是插花高级花材，并且种子可榨油。扦插成活率不到20％，后代容易积累病毒，严重影响观赏品质；用种子进行繁殖，后代会出现分离，不能保持母株的优良特性，从播种至开花周期较长；国外进口种苗价格昂贵。

技术实现要素：

本发明的目的在于提供一种金红茵芋的快速繁殖方法，所述的这种金红茵芋的快速繁殖方法要解决现有技术中，金红茵芋繁殖慢、籽播、扦插后代不能保持母本优良特性的技术问题。

本发明提供了一种金红茵芋的快速繁殖方法，包括如下步骤：

1)一个将金红茵芋带腋芽茎段做为外植体，进行表面灭菌的步骤，先用自来水流水冲洗1h～3h，后放置于超净工作台上，用质量百分比浓度为60％～80％的乙醇浸泡20s～40s，再用质量百分比浓度为0.1％～0.2％的升汞灭菌8min～12min，最后用无菌水冲洗3～6次；

2)一个将金红茵芋无菌外植体进行初代诱导培养的步骤，将步骤a)中经灭菌的外植体转入初代诱导培养基中培养30d获得试管苗，所述的初代诱导培养基为ms+zt0.05～0.5mg/l+iba0.02～0.05mg/l+ga32～10mg/l；

3)一个将金红茵芋试管苗进行增殖培养的步骤，将步骤2)诱导出的试管苗，待其逐渐长大，挑选0.5cm高度、颜色嫩绿的试管苗，转入增殖培养基，所述的增殖培养基是ms+zt0.5～2mg/l+kt0.05～1mg/l+iba0.02～0.2mg/l，培养30d；

4)一个将金红茵芋外植体进行生根培养的步骤，将增殖培养的试管苗转入生根培养基，生根培养基为1/2ms+iba1.0～2.0mg/l，培养30d；

5)待试管苗的根系长至0.4～0.6cm时，选择根系发达、生长健壮的无菌苗，室内开瓶炼苗3d，移栽入混合基质中，温室中驯化45d后，移栽室外，给予肥水管理即可。

进一步的，升汞浓度可以为0.1％～0.2％区间的任一浓度；灭菌时间可以为8min～12min区间的任一时间。其中0.15％升汞浸泡10min为最佳消毒液处理方式。

进一步的，初代培养基中，zt可以为0.05～0.5mg/l区间的任一浓度；iba可以为0.02～0.05mg/l区间的任一浓度；ga3可以为2～10mg/l区间的任一浓度。其中最佳初代培养基为ms+zt0.2mg/l+iba0.04mg/l+ga30.5mg/l，诱导率最高达85％。

进一步的，增殖培养基中，zt可以为0.5～2mg/l区间的任一浓度；kt可以为0.05～1mg/l区间的任一浓度；iba可以为0.02～0.2mg/l区间的任一浓度。其中最佳增殖培养基是ms+zt1.0mg/l+kt0.5mg/l+iba0.1mg/l，培养30d，增殖率最高为3.6，试管苗高度达2.0cm。

进一步的，生根培养基中，iba可以为1.0～2.0mg/l区间的任一浓度。其中最佳生根培养基为1/2ms+iba1.0mg/l，生根率最高达90％。

进一步的，混合基质由泥炭:蛭石:珍珠岩:有机肥组成。其中最佳配比为6:2:1:1(v/v)，移栽成活率可达80％以上。

本发明探索了组织培养方式繁殖金红茵芋，历时两年探索，建立了完善的生产技术体系。本发明和已有技术相比，其技术效果是积极和明显的。本发明实现了以下技术指标：(1)繁殖系数2.5～3.6；(2)生根率85％以上；(3)移栽成活率75％以上。(4)无变异植株。目前已经试验生产了金红茵芋5000株，株性一致。本发明建立的繁殖体系，繁育系数高，不受季节气候限制，可周年生产，随时满足生产用苗。

附图说明

图1是金红茵芋冬季植株的照片。

图2是金红茵芋初代培养的照片。

图3是金红茵芋增殖培养的照片。

图4是金红茵芋增殖培养的照片。

图5是金红茵芋生根种苗的照片。

图6是金红茵芋穴盘移栽的照片。

具体实施方式

试验材料：

金红茵芋，健壮无病虫害植株，取带腋芽茎段做外植体，进行组织培养。

培养条件：

除特别说明外，无菌苗于光照条件下培养，光照强度为1500lx～2500lx，光周期10h/d～14h/d，温度23℃～26℃。

各种培养基的ph调为5.6～5.9，蔗糖3％～5％，琼脂0.6～0.8％，分装后在高压灭菌锅中121℃条件下保持16min～20min。

数据统计：

统计数据时，每种处理调查20个，重复3次，统计诱导率、芽增殖率、生根率和移栽成活率。采用excel2007和spss18.0软件对数据进行统计分析。采用单因素方差分析(one-wayanova)和duncan法进行多重比较(α＝0.05)。

诱导率＝(出芽外植体数/接种数)×100％；增殖系数＝增殖株数/接种数；

生根率＝(生根株数/接种数)×100％；移栽成活率＝(成活数/移栽数)×100％。

实施例1表面灭菌

1.1取样

3～5月份，晴朗午后取样，去枝叶，将茎段剪成2cm长，每节带一个腋芽或顶芽。用自来水流水冲洗1h～2h，于超净工作台上，先用60％～80％的乙醇浸泡30s～60s，再用不同灭菌剂浸泡不同时间，最后用无菌水冲洗5～6次。筛选最佳灭菌剂和灭菌时间。

1.2不同灭菌时间对外植体存活率的影响

设定0.15％(质量体积比，下同)升汞5个不同灭菌时间6min、8min、10min、12min、15min，比较对外植体成活率的影响，重复3次。存活率＝存活数/接种数×100％。

结果显示，使用浓度为0.15％的升汞灭菌，灭菌时间为6min时，外植体全部污染或死亡；12min时虽然有存活的无菌外植体，但由于灭菌时间过长，存活率极低仅为5％。存活率最高的灭菌时间是10min，与其它处理相比，显著提高到15％(表1)，筛选最佳灭菌时间为10min。

表1升汞的不同灭菌时间对外植体存活率的影响

*表中数据为平均值±标准误差(n＝3)，同列数字后不同的字母表示0.05水平差异显著性(p﹤0.05)，以下同。

1.3不同灭菌剂对外植体存活率的影响

用升汞和次氯酸钠配制6种灭菌剂，分别为0.10％升汞、0.15％升汞、0.20％升汞、5％次氯酸钠溶液、10％次氯酸钠溶液和15％次氯酸钠溶液。灭菌时间均为10min，重复3次，存活率计算同上。

表2不同灭菌剂对外植体存活率的影响

结果显示，当升汞浓度为0.10％时，外植体污染严重没有得到无菌苗；而当升汞浓度为0.20％时，外植体又受消毒液毒害全部死亡。与升汞处理效果比较，次氯酸钠溶液的灭菌效果显著降低(表2)，最高仅为5％。筛选0.15％升汞为最佳灭菌剂，外植体存活率最高为15％，后期能够萌发出无菌苗。

实施例2初代诱导

初代培养、增殖培养和生根培养阶段采用ms为基础培养基，添加不同激素种类及其不同浓度，具体详见表4、表5。

初代诱导培养基中，zt设0.01、0.05、0.1、0.2、0.5、1.0mg/l计6种浓度；iba设0.01、0.02、0.04、0.05、0.1mg/l计5种浓度梯度；ga3设0.5、1、2、4、5、6、8、10、12mg/l计8种浓度。

无菌外植体初代培养30d后，结果显示，当zt浓度为0.05mg/l～0.5mg/l时，外植体都可以萌发生长，其中浓度为0.2mg/l时，外植体萌发诱导率达到60％，并且没有出现分化现象，有利于后期增殖培养的统计分析；当浓度为0.5mg/l及以上时，诱导率虽然达65％，但培养后期出现分化现象，不利于增殖培养的统计分析。筛选zt0.2mg/l为最佳浓度，与低于此浓度的其它处理比较，差异显著(表3)。

表3不同zt水平对初代诱导的影响

在培养基ms+zt0.2mg/l的基础上，添加不同浓度的iba，发现添加iba对于外植体诱导率没有明显影响，但对于外植体的伸长培养影响显著。培养一个月后，在0.02mg/l～0.05mg/l范围内，伸长明显，在iba0.04mg/l的培养基中，外植体生长至1cm，基部没有生根现象；当iba浓度到达0.05mg/l及以上时候，外植体虽然也有伸长，但基部出现生根现象，不利于后期的增殖培养。筛选0.04mg/l为iba的最佳浓度，与低于此浓度的其它处理组比较，伸长情况差异显著(表4)。

表4不同iba水平对初代诱导的影响

在培养基ms+zt0.2mg/l+iba0.04mg/l的基础上，添加不同浓度的ga3，发现其可以促进外植体的萌发，利于试管苗的生长。当ga3浓度在2mg/l～10mg/l范围时，诱导率在65％～85％；其中浓度为5mg/l时，诱导率达到最高为85％(图2)，与低于此浓度的其它处理比较，差异显著(表5)，筛选5mg/l为ga3最佳浓度。由此确定ms+zt0.2mg/l+iba0.04mg/l+ga35mg/l为金红茵芋最佳初代培养基。

表5不同ga3浓度水平对初代诱导的影响

实施例3增殖培养

增殖阶段，zt设为0.1、0.5、1.0、2.0、3.0mg/l计5种浓度；kt设为0.01、0.05、0.1、0.5、1、2mg/l计6种浓度；iba设0.01、0.02、0.05、0.1、0.2、0.3mg/l计6种浓度；同时添加ga35mg/l。

初代诱导培养基上诱导出的试管苗，待其逐渐长大，获得一定量试管苗时，挑选0.5cm高度、颜色嫩绿的试管苗，同批次转入增殖培养基中，筛选适宜增殖培养基。结果显示，当zt浓度为0.5～2mg/l时，增殖系数都达到了2以上，其中浓度为1mg/l时，增殖系数达到最高为2.4，与其它处理比较，差异显著(表6)。

表6不同zt浓度对芽增殖的影响

在ms+zt1.0mg/l+iba0.01mg/l培养基的基础上，添加不同浓度的kt，观察不同浓度的kt对试管苗增殖的影响，培养30d后统计。结果显示，在0.05mg/l～1mg/l的范围内，增殖系数都可以达到3以上；其中当kt浓度为0.5mg/l时，增殖系数最高达到3.4，与其它处理比较，差异显著(表7)；当kt浓度达到1mg/l时，试管苗基部出现愈伤组织，不利于后期生根。

表7不同kt浓度对芽增殖的影响

在ms+zt1.0mg/l+kt0.5mg/l培养基的基础上，添加不同浓度的iba，观察iba浓度对试管苗增殖的影响，培养一个月后统计。结果显示，iba对增殖培养没有明显影响，但对试管苗的伸长生长影响显著。在0.02mg/l～0.2mg/l浓度范围内，试管苗高度可以达到1.1～2.0cm，其中当iba浓度为0.1mg/l时，试管苗高度可以达到2cm，健壮整齐(图3、4)，与其它处理组比较，伸长生长情况，差异显著(表8)；当浓度达到0.3mg/l时，试管苗出现生根现象，不利于后期统一生根培养。筛选ms+zt1.0mg/l+kt0.5mg/l+iba0.1mg/l为金红茵芋试管苗增殖的最佳培养基。

表8不同iba浓度对芽增殖的影响

实施例4生根培养

生根阶段，采用1/2ms为基础培养基，iba分别设0.1、0.25、0.5、1.0、2.0、3.0mg/l计6种浓度。附加的生长素iba浓度低于2.0mg/l时，生根率随浓度的增加而增加，产生不定根的时间随浓度的增加而缩短，当超过这一域值时，生根率开始下降，同时产生少量愈伤组织。在1.0mg/l～2.0mg/l浓度范围内，培养15d左右幼苗基部分化出根原基，30d后可以长至2cm～4cm，生根率达85％以上，叶色浓绿舒展，形成了完整的试管苗；当iba浓度为1.0mg/l时，生根率达到最高90％(图5)，与其它处理相比较，差异显著(表9)。切割不定芽进行诱根培养时，基部要切除干净，切口平整，保留2对叶片。

表9不同iba水平对生根的影响

实施例5试管苗移栽

根系长至0.5cm左右时，选择根系发达生长健壮的无菌苗，室内开瓶炼苗3d，取出后洗净根部琼脂，移栽入混合基质中。混合基质配方为泥炭:蛭石:珍珠岩:有机肥＝6:2:1:1(v/v)，该混合基质质地轻，透水性和透气性良好，持水率强，全氮量也较高，营养充足。试管苗在温室中驯化45d后，即可移栽室外，给予肥水管理。在4月份或者10月份移栽，成活率最高可达80％(图6)。

结论：

本发明筛选表现优良的金红茵芋品种，进行了开发研究，克服常绿芳香木本离体培养时，启动困难，分化率低，周期长等诸多问题，建立了完善的快速繁殖技术，并开始进行试验生产。