本发明涉及倒地铃的繁育
技术领域：
，具体地说是一种倒地铃的组织培养快速繁殖方法。
背景技术：
：倒地铃亦称心豆藤或白心籽，还有假苦瓜、风船葛、带藤苦楝、灯笼草的别名，无患子科多年生木质藤本植物，是一种中药材，具有清热、利尿、凉血、去瘀、解毒之效，能治肺炎、黄疸、糖尿病、淋病、疔疮、风湿、跌打损伤、蛇咬伤等，同时也是一种常见的观赏植物。倒地铃花为白色，果膨大近球形，种子黑色，有心形的白斑。倒地铃通常是作为一年生植物，由种子播种繁育而成，但是传统的播种繁殖法的出芽率和成苗率都不高，阻碍了倒地铃的快速规模化繁殖，因此迫切需要一种能够实现倒地铃种子快速繁育的方法。技术实现要素：本发明的一个目的是解决至少上述问题和/或缺陷，并提供至少后面将说明的优点。本发明还有一个目的是提供一种倒地铃的组织培养快速繁殖方法。其通过外植体处理、外植体培养、繁殖培养、壮苗培养、生根培养以及炼苗与移栽，提高倒地铃的成苗率，能实现倒地铃的快速繁殖，实现倒地铃的规模化繁育。为了实现根据本发明的这些目的和其它优点，提供了一种倒地铃的组织培养快速繁殖方法，包括以下步骤：s1、外植体处理：取倒地铃种子作为外植体，先用羽衣草浸提液浸泡10～15min，然后用蒸馏水冲洗5～10min，再用质量分数为2％～5％次氯酸钠溶液浸泡10～15min，再用无菌水冲洗15～20min，最后用消毒滤纸除去表面水分，得到处理后的外植体；其中，所述羽衣草浸提液由以下重量份数组分制成：新鲜羽衣草50～60份、新鲜接骨木叶片10～15份、新鲜红兰花8～10份、乙醇10～15份以及无菌水300～500份；将上述重量份数的新鲜羽衣草、新鲜接骨木叶片、新鲜红兰花捣烂，然后加入上述重量份数的乙醇和无菌水，于30～50khz频率下超声20～25min，超声温度控制在30～35℃，然后过滤除去滤渣，取滤液离心处理，再取上层清液，即制得所述羽衣草浸提液；s2、外植体培养：将s1中处理后的外植体接种到ms外植体培养基中，在温度为25～28℃、光照强度为800～1000lux、光照时间为8～10h/天的条件下培养20～25天，外植体发芽后得到无菌试管苗；其中，所述ms外植体培养基含有ms、0.3～0.6mg/l的细胞分裂素、0.3～0.5mg/l的l-硒甲基硒代半胱氨酸、0.1～0.2mg/l维生素c、0.2～0.3mg/l牛磺酸、38g/l蔗糖以及5.6g/l的琼脂，ph值控制在5.6～6.0；s3、繁殖培养：将s2中得到的无菌试管苗剪切后置于ms繁殖培养基中，在温度为22～28℃、光照强度为1000～1200lux、光照时间为9～11h/天的条件下培养25～30天得到试管苗丛生芽；其中，所述ms繁殖培养基中含有ms、0.4～0.8mg/l的细胞分裂素、0.4～0.6mg/l的l-硒甲基硒代半胱氨酸、0.2～0.3mg/l维生素c、0.3～0.4mg/l牛磺酸、35g/l蔗糖和5.8g/l的琼脂，ph值控制在5.6～6.0；s4、壮苗培养：将s3中得到的试管苗丛生芽置于ms壮苗培养基中，在温度为25～30℃、光照强度为1200～1500lux，光照时间为10～12h/天的条件下培养20～25天，得到壮苗后的丛生芽；其中，所述ms壮苗培养基含有ms、0.01～0.02mg/l的细胞生长素、0.5～0.8mg/l的l-硒甲基硒代半胱氨酸、1.5～2mg/l活性炭、3.5～4.5mg/l卡那霉素、30g/l蔗糖和6.2g/l的琼脂，ph值控制在5.6～6.0；s5、生根培养：将s4中得到的壮苗后的丛生芽置于ms生根培养基中，在温度为20～30℃、光照强度为1300～1600lux、光照时间为12～14h/天的条件下培养25～35天，得到带根的完整植株；其中，所述ms生根培养基含有ms、0.02～0.03mg/l的细胞生长素、0.6～1.0mg/l的l-硒甲基硒代半胱氨酸、2～2.5mg/l活性炭、4.5～5.5mg/l卡那霉素、28g/l蔗糖和6.4g/l的琼脂，ph值控制在5.6～6.0；s6、炼苗与移栽：将s5中得到的带根的完整植株，在温度为18～25℃、自然通风的室内炼苗5～7天至植株表面角质形成后将苗取出，立即移栽到育苗基质中，在育苗基质继续生长25～35天后移栽到田地中；其中，所述育苗基质包括以下重量份数的组分：腐熟锯末10～15份、腐熟蔗渣8～10份、腐熟菇渣5～8份、腐熟鸡粪4～6份、蚯蚓粪1～3份、黑土20～30份、珍珠岩5～8份、草炭5～8份、硝酸钙1～2份、硝酸镁0.5～0.8份、磷酸二氢钾1～2份以及菌肥0.2～0.5份。优选的是，s2、s3中的细胞分裂素均为玉米素、n6-异戊烯基腺嘌呤、四氢吡喃苄基腺嘌呤中的任意一种。优选的是，s4、s5中的细胞生长素均为萘乙酸、2,4-二氯苯氧乙酸、2-萘氧乙酸中的任意一种。优选的是，s4中ms壮苗培养基中还添加有托玛琳石粉和远红外陶瓷粉，每升ms壮苗培养基中托玛琳石粉添加量为3.8～4.2g、远红外陶瓷粉添加量为2.8～3.4g；所述托玛琳石粉和远红外陶瓷粉在添加前需100～120℃温度下烘烤30～40min，然后冷却至室温，再用质量分数为0.5％的高锰酸钾溶液浸泡1～1.5h，然后用无菌水冲洗5～10min后进行烘干处理，得到上述添加量的托玛琳石粉和远红外陶瓷粉。优选的是，s6中珍珠岩粒径大小为2～4mm。优选的是，s6中菌肥中包括有质量比为1.6:0.8:0.9:1.2的枯草芽孢杆菌、固氮菌、硅酸盐菌、木霉菌。本发明的至少包括以下有益效果：第一、将新鲜羽衣草、新鲜接骨木叶片、新鲜红兰花通过乙醇和无菌水进行浸提，得到羽衣草浸提液，用其浸泡外植体，能抑制外植体内酪氨酸酶的活性，又能抑制多巴色素互变，还有与过氧化物歧化酶相似的清除氧自由基的功效，同时具有抗菌消炎的作用，然后再用次氯酸钠消毒，能有效降低外植体培育出的组培苗出现褐化的概率；第二、在外植体培养、繁殖培养、壮苗培养以及生根培养的过程中，根据培养阶段的不同，逐渐加强光照强度和光照时间，能使组培苗得到更适宜的光照生长条件，增强组培苗的抗病性和抗逆性，为移栽后的健康生长奠定基础；第三、在ms外植体培养基和ms繁殖培养基中加入有l-硒甲基硒代半胱氨酸、维生素c和牛磺酸，它们之间具有相互协同的作用，能促进苗株体内抗氧化系统清除有害自由基；同时控制ms外植体培养基和ms繁殖培养基中细胞分裂素、蔗糖和琼脂的含量，能有效防止组培苗出现玻璃化的情况；第四、在ms壮苗培养基和ms生根培养基中加入l-硒甲基硒代半胱氨酸、活性炭、和卡那霉素能有效降低组培苗出现褐化的概率，同时防止其它病变发生；同时控制ms壮苗培养基和ms生根培养基中细胞生长素、蔗糖和琼脂的含量，能有效防止组培苗出现玻璃化的情况；第五、托玛琳石粉和远红外陶瓷粉在添加前需100～120℃温度下烘烤30～40min，烘烤能将其有效活化，然后经消毒后加入ms壮苗培养基中；托玛琳石粉能发射对苗株有益的远红外线，促进苗株的新陈代谢和生长；远红外陶瓷粉能够辐射出比正常物体更多的远红外线，在光照射下，能激活了苗株内生物大分子的活性，使生物体的分子能够被激发而处于较高振动状态，这样激活了核酸蛋白质等生物大水分子的活性，从而发挥了生物大分子调节机体代谢、免疫等活动的功能；托玛琳石粉和远红外陶瓷粉具有相互协同的作用，增强了组织营养、活跃了组织代谢、提高了细胞供氧量，达到防病治病的目的，也能改善苗株体内的微循环，使组培苗茁壮成长。本发明的其它优点、目标和特征将部分通过下面的说明体现，部分还将通过对本发明的研究和实践而为本领域的技术人员所理解。具体实施方式下面结合实施例对本发明做详细说明，以令本领域普通技术人员参阅本说明书后能够据以实施。<实施例1>一种倒地铃的组织培养快速繁殖方法，包括以下步骤：s1、外植体处理：取倒地铃种子作为外植体，先用羽衣草浸提液浸泡10min，然后用蒸馏水冲洗5min，再用质量分数为2％次氯酸钠溶液浸泡10min，再用无菌水冲洗15min，最后用消毒滤纸除去表面水分，得到处理后的外植体；其中，所述羽衣草浸提液由以下重量份数组分制成：新鲜羽衣草50份、新鲜接骨木叶片10份、新鲜红兰花8份、乙醇10份以及无菌水300份；将上述重量份数的新鲜羽衣草、新鲜接骨木叶片、新鲜红兰花捣烂，然后加入上述重量份数的乙醇和无菌水，于30khz频率下超声20min，超声温度控制在30℃，然后过滤除去滤渣，取滤液离心处理，再取上层清液，即制得所述羽衣草浸提液；s2、外植体培养：将s1中处理后的外植体接种到ms外植体培养基中，在温度为25℃、光照强度为800lux、光照时间为8h/天的条件下培养20天，外植体发芽后得到无菌试管苗；其中，所述ms外植体培养基含有ms、0.3mg/l的玉米素、0.3mg/l的l-硒甲基硒代半胱氨酸、0.1mg/l维生素c、0.2mg/l牛磺酸、38g/l蔗糖以及5.6g/l的琼脂，ph值控制在5.6；s3、繁殖培养：将s2中得到的无菌试管苗剪切后置于ms繁殖培养基中，在温度为22℃、光照强度为1000lux、光照时间为9h/天的条件下培养25天得到试管苗丛生芽；其中，所述ms繁殖培养基中含有ms、0.4mg/l的玉米素、0.4mg/l的l-硒甲基硒代半胱氨酸、0.2mg/l维生素c、0.3mg/l牛磺酸、35g/l蔗糖和5.8g/l的琼脂，ph值控制在5.6；s4、壮苗培养：将s3中得到的试管苗丛生芽置于ms壮苗培养基中，在温度为25℃、光照强度为1200lux，光照时间为10h/天的条件下培养20天，得到壮苗后的丛生芽；其中，所述ms壮苗培养基含有ms、0.01mg/l的萘乙酸、0.5mg/l的l-硒甲基硒代半胱氨酸、1.5mg/l活性炭、3.5mg/l卡那霉素、30g/l蔗糖和6.2g/l的琼脂，ph值控制在5.6；所述ms壮苗培养基中还添加有托玛琳石粉和远红外陶瓷粉，每升ms壮苗培养基中托玛琳石粉添加量为3.8g、远红外陶瓷粉添加量为2.8g；所述托玛琳石粉和远红外陶瓷粉在添加前需100℃温度下烘烤30min，然后冷却至室温，再用质量分数为0.5％的高锰酸钾溶液浸泡1h，然后用无菌水冲洗5min后进行烘干处理，得到上述添加量的托玛琳石粉和远红外陶瓷粉；s5、生根培养：将s4中得到的壮苗后的丛生芽置于ms生根培养基中，在温度为20℃、光照强度为1300lux、光照时间为12h/天的条件下培养25天，得到带根的完整植株；其中，所述ms生根培养基含有ms、0.02mg/l的萘乙酸、0.6mg/l的l-硒甲基硒代半胱氨酸、2mg/l活性炭、4.5mg/l卡那霉素、28g/l蔗糖和6.4g/l的琼脂，ph值控制在5.6；s6、炼苗与移栽：将s5中得到的带根的完整植株，在温度为18℃、自然通风的室内炼苗5天至植株表面角质形成后将苗取出，立即移栽到育苗基质中，在育苗基质继续生长25天后移栽到田地中；其中，所述育苗基质包括以下重量份数的组分：腐熟锯末10份、腐熟蔗渣8份、腐熟菇渣5份、腐熟鸡粪4份、蚯蚓粪1份、黑土20份、珍珠岩5份、草炭5份、硝酸钙1份、硝酸镁0.5份、磷酸二氢钾1份以及菌肥0.2份；所述珍珠岩粒径大小为2mm；所述菌肥中包括有质量比为1.6:0.8:0.9:1.2的枯草芽孢杆菌、固氮菌、硅酸盐菌、木霉菌。<实施例2>一种倒地铃的组织培养快速繁殖方法，包括以下步骤：s1、外植体处理：取倒地铃种子作为外植体，先用羽衣草浸提液浸泡15min，然后用蒸馏水冲洗10min，再用质量分数为5％次氯酸钠溶液浸泡15min，再用无菌水冲洗20min，最后用消毒滤纸除去表面水分，得到处理后的外植体；其中，所述羽衣草浸提液由以下重量份数组分制成：新鲜羽衣草60份、新鲜接骨木叶片15份、新鲜红兰花10份、乙醇15份以及无菌水500份；将上述重量份数的新鲜羽衣草、新鲜接骨木叶片、新鲜红兰花捣烂，然后加入上述重量份数的乙醇和无菌水，于50khz频率下超声25min，超声温度控制在35℃，然后过滤除去滤渣，取滤液离心处理，再取上层清液，即制得所述羽衣草浸提液；s2、外植体培养：将s1中处理后的外植体接种到ms外植体培养基中，在温度为28℃、光照强度为1000lux、光照时间为10h/天的条件下培养25天，外植体发芽后得到无菌试管苗；其中，所述ms外植体培养基含有ms、0.6mg/l的n6-异戊烯基腺嘌呤、0.5mg/l的l-硒甲基硒代半胱氨酸、0.2mg/l维生素c、0.3mg/l牛磺酸、38g/l蔗糖以及5.6g/l的琼脂，ph值控制在6.0；s3、繁殖培养：将s2中得到的无菌试管苗剪切后置于ms繁殖培养基中，在温度为28℃、光照强度为1200lux、光照时间为11h/天的条件下培养30天得到试管苗丛生芽；其中，所述ms繁殖培养基中含有ms、0.8mg/l的n6-异戊烯基腺嘌呤、0.6mg/l的l-硒甲基硒代半胱氨酸、0.3mg/l维生素c、0.4mg/l牛磺酸、35g/l蔗糖和5.8g/l的琼脂，ph值控制在6.0；s4、壮苗培养：将s3中得到的试管苗丛生芽置于ms壮苗培养基中，在温度为30℃、光照强度为1500lux，光照时间为12h/天的条件下培养25天，得到壮苗后的丛生芽；其中，所述ms壮苗培养基含有ms、0.02mg/l的2,4-二氯苯氧乙酸、0.8mg/l的l-硒甲基硒代半胱氨酸、2mg/l活性炭、4.5mg/l卡那霉素、30g/l蔗糖和6.2g/l的琼脂，ph值控制在6.0；所述ms壮苗培养基中还添加有托玛琳石粉和远红外陶瓷粉，每升ms壮苗培养基中托玛琳石粉添加量为4.2g、远红外陶瓷粉添加量为3.4g；所述托玛琳石粉和远红外陶瓷粉在添加前需120℃温度下烘烤40min，然后冷却至室温，再用质量分数为0.5％的高锰酸钾溶液浸泡1.5h，然后用无菌水冲洗10min后进行烘干处理，得到上述添加量的托玛琳石粉和远红外陶瓷粉；s5、生根培养：将s4中得到的壮苗后的丛生芽置于ms生根培养基中，在温度为30℃、光照强度为1600lux、光照时间为14h/天的条件下培养35天，得到带根的完整植株；其中，所述ms生根培养基含有ms、0.03mg/l的2,4-二氯苯氧乙酸、1.0mg/l的l-硒甲基硒代半胱氨酸、2.5mg/l活性炭、5.5mg/l卡那霉素、28g/l蔗糖和6.4g/l的琼脂，ph值控制在6.0；s6、炼苗与移栽：将s5中得到的带根的完整植株，在温度为25℃、自然通风的室内炼苗7天至植株表面角质形成后将苗取出，立即移栽到育苗基质中，在育苗基质继续生长35天后移栽到田地中；其中，所述育苗基质包括以下重量份数的组分：腐熟锯末15份、腐熟蔗渣10份、腐熟菇渣8份、腐熟鸡粪6份、蚯蚓粪3份、黑土30份、珍珠岩8份、草炭8份、硝酸钙2份、硝酸镁0.8份、磷酸二氢钾2份以及菌肥0.5份；所述珍珠岩粒径大小为4mm；所述菌肥中包括有质量比为1.6:0.8:0.9:1.2的枯草芽孢杆菌、固氮菌、硅酸盐菌、木霉菌。<实施例3>一种倒地铃的组织培养快速繁殖方法，包括以下步骤：s1、外植体处理：取倒地铃种子作为外植体，先用羽衣草浸提液浸泡12min，然后用蒸馏水冲洗8min，再用质量分数为3.5％次氯酸钠溶液浸泡12min，再用无菌水冲洗17min，最后用消毒滤纸除去表面水分，得到处理后的外植体；其中，所述羽衣草浸提液由以下重量份数组分制成：新鲜羽衣草55份、新鲜接骨木叶片12份、新鲜红兰花9份、乙醇12份以及无菌水400份；将上述重量份数的新鲜羽衣草、新鲜接骨木叶片、新鲜红兰花捣烂，然后加入上述重量份数的乙醇和无菌水，于40khz频率下超声22min，超声温度控制在32℃，然后过滤除去滤渣，取滤液离心处理，再取上层清液，即制得所述羽衣草浸提液；s2、外植体培养：将s1中处理后的外植体接种到ms外植体培养基中，在温度为26℃、光照强度为900lux、光照时间为9h/天的条件下培养22天，外植体发芽后得到无菌试管苗；其中，所述ms外植体培养基含有ms、0.4mg/l的四氢吡喃苄基腺嘌呤、0.4mg/l的l-硒甲基硒代半胱氨酸、0.15mg/l维生素c、0.25mg/l牛磺酸、38g/l蔗糖以及5.6g/l的琼脂，ph值控制在5.8；s3、繁殖培养：将s2中得到的无菌试管苗剪切后置于ms繁殖培养基中，在温度为25℃、光照强度为1100lux、光照时间为10h/天的条件下培养28天得到试管苗丛生芽；其中，所述ms繁殖培养基中含有ms、0.6mg/l的四氢吡喃苄基腺嘌呤、0.5mg/l的l-硒甲基硒代半胱氨酸、0.25mg/l维生素c、0.35mg/l牛磺酸、35g/l蔗糖和5.8g/l的琼脂，ph值控制在5.8；s4、壮苗培养：将s3中得到的试管苗丛生芽置于ms壮苗培养基中，在温度为27℃、光照强度为1400lux，光照时间为11h/天的条件下培养22天，得到壮苗后的丛生芽；其中，所述ms壮苗培养基含有ms、0.01mg/l的2-萘氧乙酸、0.6mg/l的l-硒甲基硒代半胱氨酸、1.8mg/l活性炭、4mg/l卡那霉素、30g/l蔗糖和6.2g/l的琼脂，ph值控制在5.8；所述ms壮苗培养基中还添加有托玛琳石粉和远红外陶瓷粉，每升ms壮苗培养基中托玛琳石粉添加量为4g、远红外陶瓷粉添加量为3.1g；所述托玛琳石粉和远红外陶瓷粉在添加前需110℃温度下烘烤35min，然后冷却至室温，再用质量分数为0.5％的高锰酸钾溶液浸泡1.2h，然后用无菌水冲洗8min后进行烘干处理，得到上述添加量的托玛琳石粉和远红外陶瓷粉；s5、生根培养：将s4中得到的壮苗后的丛生芽置于ms生根培养基中，在温度为25℃、光照强度为1450lux、光照时间为13h/天的条件下培养30天，得到带根的完整植株；其中，所述ms生根培养基含有ms、0.02mg/l的2-萘氧乙酸、0.8mg/l的l-硒甲基硒代半胱氨酸、2.2mg/l活性炭、5mg/l卡那霉素、28g/l蔗糖和6.4g/l的琼脂，ph值控制在5.8；s6、炼苗与移栽：将s5中得到的带根的完整植株，在温度为22℃、自然通风的室内炼苗6天至植株表面角质形成后将苗取出，立即移栽到育苗基质中，在育苗基质继续生长30天后移栽到田地中；其中，所述育苗基质包括以下重量份数的组分：腐熟锯末12份、腐熟蔗渣9份、腐熟菇渣6份、腐熟鸡粪5份、蚯蚓粪2份、黑土25份、珍珠岩6份、草炭7份、硝酸钙1.5份、硝酸镁0.6份、磷酸二氢钾1.5份以及菌肥0.3份；所述珍珠岩粒径大小为3mm；所述菌肥中包括有质量比为1.6:0.8:0.9:1.2的枯草芽孢杆菌、固氮菌、硅酸盐菌、木霉菌。<对比试验>使用传统方法，采取种子播种的方式，将倒地铃种子直接播种于田地中进行繁殖，作为对比例1，对比例1中种子的出芽率为33.8％～45.6％，每100个种子最终得到26～37根成活苗株，相当于苗株的成活率为26.4％～37.2％，从种子播种到成苗所需时间为4～5个月；实施例1～3中平均每1个种子能得到10～15个组培苗，每1个种子都能得到9～14根倒地铃成活苗株，而且组培苗经过练苗移栽后的成活率在92.1％～96.6％，同样只需要时间4～5个月；由此可见，本发明的方法能实现倒地铃的快速繁殖。采用常规的组织培养的方法，将倒地铃种子作为外植体，进行组织培养快速繁殖，作为对比例2，将对比例2与实施例1～3进行对比，通过对组培苗的褐化率、玻璃化率以及移栽田地后的成活率进行对比，得到表2数据：表2对比例2与实施例1～3对组培苗的褐化率、玻璃化率以及移栽后的成活率的影响对比例2实施例1实施例2实施例3褐化率(％)6.61.31.21.1玻璃化率(％)9.32.92.31.9成活率(％)82.692.593.293.8从表2可看出，按本发明方法繁殖的倒地铃，实施例1～3中组培苗期间褐化率为1.1％～1.3％，小于常规方法对比例2的6.6％；实施例1～3中组培苗玻璃化率为1.9％～2.9％，也低于常规方法对比例2的9.3％；实施例1～3中移栽田地后成活率为92.5％～93.8％，高于常规方法对比例2的82.6％。因此，本发明的方法能降低组培苗的褐化率、玻璃化率，提高移栽成活率，同时提高倒地铃的成苗率，能实现倒地铃的快速繁殖，实现倒地铃的规模化繁育。尽管本发明的实施方案已公开如上，但其并不仅仅限于说明书和实施方式中所列运用，它完全可以被适用于各种适合本发明的领域，对于熟悉本领域的人员而言，可容易地实现另外的修改，因此在不背离权利要求及等同范围所限定的一般概念下，本发明并不限于特定的细节和这里示出与描述的实施例。当前第1页12