本发明涉及植物育种技术领域，尤其涉及一种通过芦笋花培途径培育纯合二倍体超雄株和雌株。
背景技术：
芦笋学名石刁柏（asparagusofficinalisl.），嫩茎质地细腻，纤维柔软可口，风味鲜美，有独特的芳香味。含有丰富的多糖、黄酮类化合物、皂甙等活性成分，芦笋具有抗肿瘤、抗疲劳、降血压、降血脂、提高免疫功能等作用，是一种营养价值极高的保健蔬菜，已被列为世界“十大名菜”之一，在国际市场上享有“蔬菜之王”的美称。
目前芦笋常规品种选育的途径为：先选择性状优良的雄株和雌株进行杂交；选择强杂种优势组合，然后进行3-4年多点田间品比试验，通过田间综合性状调查，最终选育出新品种。由于芦笋雌雄异株的特殊性，与雌雄同花的作物相比，缺少了自交这一环节，从而造就目前芦笋品种存在一致性、稳定性差的特点，同一品种不同单株，甚至同一单株不同笋条之间都存在差异。
目前国内已报道的芦笋花药培养研究工作大多局限于影响花药愈伤组织诱导率的因素及植株再生，而后续的单倍体鉴定、单倍体染色体加倍、超雄株鉴定等的相关研究却较少，也没有成功培育出纯合二倍体的报道。现有技术进行芦笋花药愈伤组织诱导和植株再生研究中存在以下技术问题：
（1）芦笋花药培养的效率不高，愈伤组织诱导率低；
（2）体细胞干扰严重、花粉单倍体出现频率低。
技术实现要素：
针对现有技术的不足，本发明提供一种利用花药培养获得芦笋纯合二倍体的方法，以实现以下发明目的：
（1）提高芦笋花药愈伤组织的诱导率；
（2）克服体细胞的干扰、提高花粉单倍体出现的频率；
为解决上述技术问题，本发明采取的技术方案如下：
一种利用花药培养获得芦笋纯合二倍体的方法，其特征在于：包括以下步骤：芦笋花药的获取、芦笋花药的预处理、芦笋花药愈伤组织诱导、芦笋花药继代分化、试管苗生根、单倍体染色体加倍。
以下是对上述技术方案的进一步改进：
所述芦笋花药的获取，每年4-5月份采集芦笋不同单株的雄花花序，花序中花蕾长度为1-2mm，花粉为单核靠边期。
所述芦笋，品种为冠军、鲁芦笋一号、格兰德或京绿1号。
所述芦笋花药的预处理，将芦笋花蕾于3.5-4.5℃条件进行低温预处理2.5-3.5d。
所述芦笋花药愈伤组织诱导，诱导培养基为ms+1.0mg/l6-ba+1.25mg/lnaa，蔗糖浓度为5.0%，琼脂为0.7%，ph为5.8。
所述芦笋花药愈伤组织诱导，于（26±1）℃的黑暗条件下进行暗培养2周，然后在（26±1）℃、光照强度在1000lx、光照时间16h/d的条件下培养20d后，开始出现愈伤组织。
所述芦笋花药继代分化，分化成芽培养基为ms+0.5mg/l6-ba+0.2mg/lnaa，培养基中蔗糖的浓度为4.0%、琼脂为0.7%、ph5.8。
所述芦笋花药继代分化，在26±1℃，光照强度为2000lx，光照时间16h/d的条件下培养30d。
所述试管苗生根，生根培养基为：ms+2.0mg/lnaa+1.0mg/liba+0.01mg/lkt，培养基中含蔗糖3.5%、琼脂0.5%，ph5.8，培养条件为25-28℃，每天光照16h。
所述单倍体染色体加倍，利用秋水仙素处理芦笋单倍体试管苗，基本培养基为ms+6-ba0.3mg/l+naa0.1mg/l，蔗糖3.0%，琼脂0.7%，ph5.8，培养基中添加秋水仙素浓度为0.05mg/l，培养15d后，接转培养于不加秋水仙素的基本培养基上进行培养15d。
由于采用了上述技术方案，本发明达到的技术效果是：
（1）本发明所述利用花药培养获得芦笋纯合二倍体的方法，芦笋花药的质地坚硬紧密的愈伤组织的诱导率为7.2-17%；特别是品种‘冠军’的质地坚硬紧密的愈伤组织诱导率为15.8-17%以上。
（2）本发明所述利用花药培养获得芦笋纯合二倍体的方法，单倍体分化率为2.2-7.2%，由单倍体诱导得到纯合二倍体和多倍体的成功率为45.86-49.73%，其中纯合二倍体占比为1.6-2.9%。
（3）本发明所述利用花药培养获得芦笋纯合二倍体的方法，出芽率为113.2-125.4%，增殖系数为2.5-4.9。
（4）本发明所述利用花药培养获得芦笋纯合二倍体的方法，花药培养试管苗的有效生根率为65.2-72.3%。
（5）本发明所述方法，利用二倍体芦笋花药培养，筛选出单倍体植株，经染色体加倍后获得纯合二倍体种质，这种方法一代就可纯合，与常规育种相比缩短3-5年。
本发明结合目前芦笋育种存在的上述实际问题，主要采用对优良雄株进行花药培养，获取优良芦笋单倍体；然后利用秋水仙碱在室内组培条件下进行染色体加倍，获得优良纯合芦笋种质资源；最后通过分子标记和镜检技术对获得的种质资源进行性别及倍性的鉴定，从而最终获得优良纯合二倍体雌株（mm），二倍体雄株（mm，以下称为“超雄株”）等种质资源。
（6）本发明培育出的芦笋新品种出笋期、笋的直径、包头紧密度、植株高度等性状稳定、一致。
（7）本发明培育出的芦笋，产量达到1800公斤/亩以上，提高20%左右，对推进我国芦笋生产的稳步发展具有重要意义。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明进行详细说明。以下实施例将有助于本领域的技术人员进一步理解本发明，但不以任何形式限制本发明。应当指出的是，对本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干调整和改进。这些都属于本发明的保护范围。
实施例1一种利用花药培养获得芦笋纯合二倍体的方法
主要方案如下：
1、芦笋花药培养步骤
1.1芦笋花药的获取
每年4-5月份上午8:00-10:00从田间取得20株不同单株的雄花花序，分别进行标记，芦笋雄株花序取回后选择长度为1-2mm左右的花蕾，镜检表明，此时花粉为单核靠边期。
所述芦笋植株品种为‘冠军’。
1.2芦笋花药的预处理
将芦笋花蕾放在4℃冰箱进行低温预处理2.5-3.5d，在超净工作台上将花蕾先用75%酒精溶液浸泡10s，用无菌水冲洗3次，0.2%的升汞溶浸泡15min，用无菌水冲洗6-7次。
1.3芦笋花药愈伤组织诱导
在超净工作台上剥取花药接种于诱导培养基，花药愈伤组织诱导培养基为ms+1.0mg/l6-ba+1.25mg/lnaa，蔗糖浓度为5.0%，琼脂为0.7%，ph为5.8。每瓶接种外观未破损的花药30枚，接种后培养瓶置于（26±1）℃的黑暗条件下进行暗培养2周，然后在（26±1）℃、光照强度在1000lx、光照时间16h/d的条件下培养20d后，开始出现愈伤组织，愈伤组织有两种形态，一种为质地坚硬紧密的愈伤组织，另一种为黄色的、疏松的、棉絮状愈伤组织；后续操作采用的是质地坚硬紧密的愈伤组织，所述质地坚硬紧密的愈伤组织的诱导率为15.8%。
1.4芦笋花药继代分化
由愈伤组织分化的芽接种在分化成芽培养基上进行分化，在（26±1）℃，光照强度为2000lx，光照时间16h/d的条件下培养，30d后测定出芽率、增殖系数和生长状态。
所述分化成芽培养基为ms+0.5mg/l6-ba+0.2mg/lnaa，培养基中蔗糖的浓度为4.0%、琼脂为0.7%、ph5.8。
所述出芽率为125.4%，增殖系数为4.9，芽体粗壮，生长正常。
1.5花药培养试管苗生根
以继代增殖培养形成的正常嫩芽茎尖作为生根材料，生根培养基以ms为基本培养基，蔗糖3.5%、琼脂0.5%，ph5.8，添加不同浓度的naa、iba、kt，适宜生根的培养基为：ms+2.0mg/lnaa+1.0mg/liba+0.01mg/lkt，蔗糖3.5%、琼脂0.5%，ph5.8，培养条件为（26±1）℃，每天光照16h，有效生根率达72.3%。
1.6芦笋花药培养再生植株倍性鉴定
利用根尖压片法对芦笋花药培养再生植株进行倍性鉴定。结果表明，有单倍体、二倍体、四倍体和非整倍体等，其中单倍体分化率为4.5%，二倍体分化率为68.5%，非整倍体分化率为18.2%，四倍体分化率为8.8%。
2、单倍体染色体加倍步骤
利用秋水仙素处理芦笋单倍体试管苗可以获得纯合二倍体和多倍体，基本培养基为ms+6-ba0.3mg/l+naa0.1mg/l，蔗糖3.0%，琼脂0.7%，ph5.8，培养基中添加秋水仙素浓度为0.05mg/l，培养15d后，接转培养于不加秋水仙素的基本培养基上进行培养，15d后，其诱导成功率为49.73%。
3、芦笋新种质性别及倍性鉴定
利用分子标记和细胞生物学技术，对获得的芦笋植株进行性别及倍性的鉴定。选取所需要的纯合二倍体、四倍体、非整倍体等种质资源，其中纯合二倍体的占比为1.76%。
实施例2其余几个芦笋品种的试验结果
采用实施例1所述的利用花药培养获得芦笋纯合二倍体的方法，改变芦笋的品种，分别采用鲁芦笋一号、格兰德、京绿1号。
表
上述愈伤组织为质地坚硬紧密的愈伤组织。
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表
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表6不同品种单倍体染色体加倍结果表
实施例3不同花药采集时间对愈伤组织诱导率的影响
采用实施例1所述的方法，只改变步骤“1.1芦笋花药的获取”中的花药
采集时间和芦笋的品种，进行试验。
在潍坊地区芦笋花期持续到9-10月份，因此在2010-2015年的4-9月采集不同月份的花药，研究了不同采集时间的花药愈伤组织诱导率，结果表明4-5月花药的诱导率最高，6月份次之，7月份之后接种的都较低。试验所用四个品种均表现出这种规律（表7）。
表7不同时期的花药愈伤组织诱导率（%）
上述愈伤组织指的是质地坚硬紧密的愈伤组织
实施例4低温预处理的天数对愈伤组织类型及诱导率的影响
采用实施例1所述的方法，改变之处为花药的采集时间，花药的采集时间为6月8日，同时改变步骤“1.2芦笋花药的预处理”中低温预处理的时间，进行分析实验。
芦笋花药接种前在4℃条件下进行不同时间的低温预处理，结果表明，花药经过不同天数的处理后，不同处理时间的愈伤组织诱导率差异显著。处理3d的效果最佳，愈伤组织的诱导率达到了最高值；处理5d、7d，部分花蕾黄化，影响愈伤组织的诱导（表8）。
表8低温预处理对花药愈伤组织诱导率的影响
实施例5愈伤组织分化成芽条件的筛选
采用实施例1所述的方法，只改变步骤“1.4芦笋花药继代分化”中分化成芽培养基的组成，设3个处理，分别为ms+0.25mg/l6ba+0.1mg/lnaa、ms+0.5mg/l6ba+0.2mg/lnaa和ms+0.75mg/l6ba+0.3mg/lnaa，每个处理接种20个芽，重复3次，在（26±1）℃，光照强度为2000lx，光照时间16h/d的条件下培养。30d后调查各处理的增殖系数。
由愈伤组织分化的芽接种在不同培养基上均能萌生腋芽，也能通过基部切口处形成愈伤组织而分化生芽。不同处理的出芽率、增殖系数见表9。从表9可以看出，在ms+0.75mg/l6ba+0.3mg/lnaa培养基上出芽率及增殖系数最高，在此培养基上虽然芽体粗壮，但是产生大量的畸形芽；在ms+0.5mg/l6ba+0.2mg/lnaa培养基上次之，在此培养基上的芽体粗壮，生长正常；而在ms+0.25mg/l6ba+0.1mg/lnaa培养基上最低，此培养基上的芽体细长，长势弱。最终选择ms+0.5mg/l6ba+0.2mg/lnaa为适宜继代增殖的培养基。
表9不同处理对继代增殖的影响
实施例6生根培养基的选择
采用实施例1所述的方法，只改变生根培养基中iba的浓度，将naa2.0mg/l和kt0.01mg/l的最佳浓度分别与iba以0.1、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0mg/l等七个浓度对芦笋试管苗生根诱导进行交互试验，试管苗的生根情况见表10。由表10可知，试管苗生根率在一定的范围内随着iba浓度的增加而升高，以1.0mg/l时最高，有效生根率达72.3%，与其它浓度水平的有效生根率的差异达到显著水平。
表10不同激素配比对试管苗生根的影响
从表10发现，复合使用三种生长素时试管苗根的质量得到了提高，畸形根的数量减少，每株生根试管苗的有效根数明显增多，从而提高了有效生根率，最终获得适宜生根培养基：ms+2.0mg/lnaa+1.0mg/liba+0.01mg/lkt。
实施例7纯合二倍体诱导条件选择试验
采用实施例1的方法，改变染色体加倍过程中，秋水仙素的浓度和培养时间，采用培养基法，基本培养基为ms+6-ba0.3mg/l+naa0.1mg/l，蔗糖3.0%，琼脂0.7%，ph5.8。培养基中附加秋水仙素的浓度分别为0.01mg/l、0.05mg/l、0.1mg/l。接种培养5d、10d和15d后，接转培养于不加秋水仙素的基本培养基上进行培养，15d后进行成活率调查茎尖成活率随着处理时间和秋水仙素浓度的提高而降低，而加倍率随着处理时间和秋水仙素浓度的提高而提高，以秋水仙素浓度0.05mg/l、15d培养为最佳，其诱导成功率为49.73%。
除非特殊说明，本发明采用的比例，均为质量比例，采用的百分比，均为质量百分比。
最后应说明的是：以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的技术人员来说，其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。