本发明涉及生物技术领域，更具体地，涉及一种缩酚酸环醚类化合物的应用。
背景技术
目前在临床治疗中发现病原微生物的耐药性越来越强，尤其是耐甲氧基青霉素金黄色葡萄球菌(超级耐药菌)、铜绿假单胞菌(俗称绿脓杆菌)、副溶血弧菌和白色假丝酵母(俗称白色念珠菌)造成的感染越来越严重，很多传统抗生素已基本丧失疗效。
而且，农业中常用杀虫剂等农药，在农业生产因为过度使用各种化学合成农药，造成严重的食品、土壤及水污染，并经过食物链危及人体健康和生态平衡，农药残留也严重阻碍了我国的农产品出口；而生物农药具有不易产生抗药性、对非靶生物安全、环境友好且易于自然降解等优点，对于人类健康、环境保护及农业可持续发展具有重要的意义。
与此同时，用于临床的乙酰胆碱酯酶抑制剂主要为毒扁豆碱、加兰他敏、石杉碱甲、利斯的明、他克林和多奈哌齐，但这些药物价格昂贵，并且除了石杉碱甲外具有一定的毒副作用。
因此，需要寻找新型的抗细菌药物、抗真菌药物、杀虫剂或乙酰胆碱酯酶抑制剂。
技术实现要素：
本发明为克服上述现有技术所述的现有抗细菌药物、抗真菌药物、杀虫剂及乙酰胆碱酯酶抑制剂的缺陷，提供一种缩酚酸环醚类化合物的应用，具体为缩酚酸环醚类化合物在制备抗真菌剂、抗细菌剂、杀虫剂或乙酰胆碱酯酶抑制剂中的应用。
为解决上述技术问题，本发明采用的技术方案是：
一种缩酚酸环醚类化合物在制备抗真菌剂、抗细菌剂或杀虫剂中的应用，所述缩酚酸环醚类化合物如式1所示：
其中，r1为cl，r2为h；或r1为h，r2为-cooh。
r1为cl，r2为h时，该缩酚酸环醚类化合物为化合物a；
r1为h，r2为-cooh时，该缩酚酸环醚类化合物为化合物b。
本发明通过实验证明，化合物a和化合物b具有抗细菌、抗真菌、杀虫的效果，另外化合物b还具有乙酰胆碱酯酶抑制活性。因此，上述缩酚酸环醚类化合物能够用于制备抗真菌剂、抗细菌剂或杀虫剂。
优选地，所述真菌为白色假丝酵母。
优选地，所述细菌为耐甲氧基青霉素金黄色葡萄球菌或铜绿假单胞菌。
优选地，所述虫为卤虫幼虫。
由于通过实验证明，化合物b还具有乙酰胆碱酶抑制活性，因此，本发明还保护一种缩酚酸环醚类化合物在制备乙酰胆碱酯酶抑制剂中的应用，所述缩酚酸环醚类化合物如式1所示：
其中，r1为h，r2为-cooh。
本发明的化合物a和化合物b可由海洋真菌爪曲霉诱变株aspergillusunguis6-20-6通过发酵、提取、分离制备得到。
该海洋真菌爪曲霉诱变株aspergillusunguis6-20-6于2018年03月20日保藏在广东省微生物菌种保藏中心，保藏编号：gdmcc60337；保藏地址：广州市先烈中路100号大院59号楼5楼，广东省微生物研究所。
大连海域中的海藻分离得到aspergillusunguisdlep2008001，后对其孢子运用大气压低温等离子体诱变得到aspergillusunguis6-20-6。海洋真菌爪曲霉aspergillusunguisdlep2008001，于2009年10月29日保存于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(cgmcc)，北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏编号为cgmccno.3372，株号为dlep2008001。
另外，所述海洋真菌爪曲霉诱变株aspergillusunguis6-20-6的its1-5.8s-its2rdna序列如seqidno：1所示。
海洋真菌爪曲霉诱变株aspergillusunguis6-20-6的its1-5.8s-its2rdna序列(569bp)已向美国国家生物技术信息中心(ncbi)的genbank基因序列数据库提交，登录号为mh071299。
所述海洋真菌爪曲霉诱变株aspergillusunguis6-20-6具有下述性质：接种到海水马铃薯葡萄糖培养基(海水pda)平板上，28℃培养，菌落初期为绿色，后期为黄绿色，圆形，向四周扩展，中央凸起，背面产黄褐色色素；该菌株在海水马铃薯蔗糖液体培养基中静置发酵可产生抗乙酰胆碱酯酶、抗菌、杀虫活性物质。
经抗菌实验得出，化合物a和化合物b对耐甲氧基青霉素金黄色葡萄球菌的抑菌圈分别为17.0±0.0和17.7±0.3mm，mic值分别为25.6和12.8μm，具有抑制耐甲氧基青霉素金黄色葡萄球菌的活性；化合物a和化合物b对铜绿假单胞菌的抑菌圈分别为11.1±0.2和16.0±0.0mm，mic分别为51.2和102.4μm，表明上述化合物具有抑制铜绿假单胞菌生长的活性；化合物a和化合物b对副溶血弧菌的抑菌圈均为8.3±0.6mm，mic均>102.4μm，表明上述化合物不能有效抑制副溶血弧菌或活性很弱；化合物a和化合物b对白色假丝酵母的抑菌圈分别为10.0±0.0和15.5±2.2mm，mic值分别为>102.4和6.4μm，具有抑制白色假丝酵母的活性；化合物a和化合物b对卤虫幼虫的半致死剂量lc50分别为75.87和51.2μm，表明其具有杀虫活性。另外化合物b对乙酰胆碱酯酶的ic50为56.75μm，表明其具有乙酰胆碱酯酶抑制活性。
与现有技术相比，本发明的有益效果是：
本发明提供的一种缩酚酸环醚类化合物在制备抗真菌剂、抗细菌剂或杀虫剂中的应用，所述缩酚酸环醚类化合物如式1所示：
其中，r1为cl，r2为h；或r1为h，r2为-cooh，通过实验证明，上述缩酚酸环醚类化合物具有抗细菌、抗真菌、杀虫的效果；另外，r1为h，r2为-cooh时，缩酚酸环醚类化合物还具有乙酰胆碱酯酶抑制活性。因此，上述缩酚酸环醚类化合物在制备抗真菌剂、抗细菌剂、农用杀虫剂或乙酰胆碱酯酶抑制剂中具有广泛的应用前景。
附图说明
图1为实施例1制得的化合物a的核磁共振氢谱。
图2为实施例1制得的化合物a的核磁共振碳谱。
图3为实施例1制得的化合物b的核磁共振氢谱。
图4为实施例1制得的化合物b的核磁共振碳谱。
具体实施方式
下面结合具体实施方式对本发明作进一步的说明。
实施例中的原料均可可通过市售得到；
除非特别说明，本发明采用的试剂、方法和设备为本技术领域常规试剂、方法和设备。
海洋真菌爪曲霉诱变株aspergillusunguis6-20-6于2018年03月20日保藏在广东省微生物菌种保藏中心，保藏编号：gdmcc60337，株号：6-20-6；保藏地址：广州市先烈中路100号大院59号楼5楼，广东省微生物研究所。
实施例1
本实施例为海洋真菌溴代缩酚酸环醚类化合物的制备方法。
步骤1.发酵
将爪曲霉诱变株aspergillusunguis6-20-6接种于真菌液体培养基中于28℃静置发酵，发酵20天，加入适量硅藻土，过滤，分别收集菌丝体和发酵液。
其中，所述真菌液体培养基的配方为：每升中含有如下组分：土豆汁500ml，海盐20g，蔗糖20g，超纯水500ml。
其中，土豆汁的制备方法为土豆去皮，洗净，加入去离子水，加热至煮沸30min，过滤，每200g土豆可煮500ml土豆汁，冷冻保藏。
步骤2.粗提
将步骤1获得的发酵液经300mlnka树脂吸附，摇匀1h，后转移至层析柱，放尽发酵液并水洗后，先后用甲醇和丙酮分别将树脂洗脱3个柱体积，减压浓缩，得浓缩液。同时将步骤1获得的菌丝体用甲醇：丙酮＝2:1浸泡过夜，超声30min，过滤，减压浓缩，重复三次，得浓缩液。将所得浓缩物合并，即为粗提物；
步骤3.分离纯化
a.将步骤2获得的粗提物经凝胶柱层析，用甲醇洗脱，自动收集器收集洗脱液，约2～3ml/管，流速控制在8～10s一滴；组分特征为薄层层析硅胶板上展开剂为体积比10:1的氯仿-甲醇溶液下展开，比移值为0.29～0.74的混合物组分，薄层层析硅胶板为merck公司生产的silicagel60f254；
b.将步骤a收集的洗脱组分再进行凝胶柱层析，洗脱液为纯甲醇，流速0.5ml/min，收集比移值为0.5～0.76的第二混合物组分，薄层层析条件与步骤a.相同；
c.将步骤b收集的洗脱组分进行薄层层析制备，展开剂为石油醚：丙酮＝4:1；比移值为0.6～0.75的混合物组分，薄层层析板为merck公司生产的silicagel60f254；
d.将步骤c收集的洗脱组分进行薄层层析制备，展开剂为石油醚：二氯甲烷＝1:3；收集比移值为0.65～0.7的组分，薄层层析板为merck公司生产的silicagel60f254，得到化合物a；
e.将步骤a收集的洗脱组分进行制备液相分离，制备液相色谱仪为lisurehpplus50d，所用层析柱为大连依利特公司生产的sinochromods-ap，15μm，20.0mm×250mm，洗脱液为40％甲醇-60％水；流速为5ml/min；温为室温；收集保留时间为10～20min的组分，得到化合物b；
所收集目标物质还符合下述特征：
(1)tlc检测收集在254nm紫外线照射下呈单个、均匀的黑色斑点，茴香醛显色分别为棕色和紫红色；
(2)化合物a和化合物b在检测用的高效液相分析条件下保留时间分别为5.2和1.7min的单一色谱峰。所述的高效液相色谱仪为agilentinfinityⅱ1260，柱子尺寸为4.6mm×250mm，填料为ec.c184μm，流动相均为60％meoh-40％h2o，流速1ml/min，柱温箱30℃，检测器为dad，检测波长210nm、254nm、280nm、320nm和365nm。
步骤4.经上述分离过程得到的化合物，确定为纯化合物。
经波谱分析，结构鉴定结果显示，其为两种抗菌和杀虫缩酚酸环醚类天然产物，化合物a和化合物b的结构式分别如式1和式2所示：
上述化合物具有以下理化和波谱特性：
化合物a核磁共振氢谱(1hnmr(500mhz,meod)δ6.47(1h,s,h-4),6.40(1h,s,h-7),5.55(1h,m,h-2'),2.44(3h,s,h1-me),2.13(3h,s,h9-me),2.04(3h,s,h-4'),1.82(3h,dd,j＝6.7,0.5hz,h-3').)，如图1所示。
化合物a核磁共振碳谱(13cnmr(126mhz,meod)δ165.3(c＝o,c-11),163.3(c-3),161.0(c-4a),153.9(c-8),144.8(c-9a),142.5(c-1),142.4(c-5a),137.1(c-1'),134.2(c-6),126.5(c-2'),121.5(c-2),116.2(c-11a),113.6(c-9),112.2(c-7),106.7(c-4),18.5(c1-me),17.8(c-4'),14.0(c-3'),9.3(c9-me).)，如图2所示。
化合物b核磁共振氢谱(1hnmr(500mhz,meod)δ6.51(1h,d,j＝1.8hz,h-2),6.33(1h,d,j＝2.3hz,h-4),5.10(1h,dd,j＝6.7,1.2hz,h-2’),2.39(3h,s,h1-me),2.16(3h,s,h9-me),2.00(3h,s,h-4’),1.82(3h,dd,j＝6.7,0.8hz,h-3’).)，如图3所示。
化合物b核磁共振碳谱(13cnmr(126mhz,meod)δ174.41(c7-cooh),165.54(c-4a),164.03(c-3),163.97(c-11),158.27(c-9a),146.19(c-8),145.96(c-1),141.37(c-5a),138.97(c-6),134.08(c-1’),122.42(c-2’),116.71(c-2),115.79(c-9),112.92(c-11a),111.39(c-7),106.57(c-4),21.29(c1-me),18.83(c-4’),13.86(c-3’),9.22(c9-me).)，如图4所示。
实施例2
本实施例为缩酚酸环醚类化合物的抑革兰氏阳性耐药菌活性实验。
1、金黄色葡萄球菌是非常常见的病菌，有时候它会进入人体内而引起感染。这种感染轻微的会在皮肤上长疮和丘疹，严重的则会引起肺炎或血液感染。因此金黄色葡萄球菌是新抗生素研发的重要靶标病原微生物。
2、实验方法：
使用国际标准的滤纸片法进行抗菌活性初筛，以抑菌圈直径衡量抗菌活性强弱(clinicalandlaboratorystandardsinstitute.2012.performancestandardsforantimicrobialdisksusceptibilitytests；approvedstandard.eleventheditionm2-a11.)；复筛使用96孔板，采用国际标准的微量肉汤稀释法(nationalcommitteeforclinicallaboratorystandards.2003.methodsfordilutionantimicrobialsusceptibilitytestsforbacteriathatgrowaerobically,5thed.approvedstandardm7–a6.)，培养16～20h后，625nm读取od值，测定化合物对耐甲氧基青霉素金黄色葡萄球菌的最小抑菌浓度(mic值)及不同浓度下的抑菌率，培养基为标准的muller-hinton肉汤培养基。
抑菌率＝(od不加药-od加药)/(od不加药-od培养基)×100％
3、实验结果：
上述实施例1获得的缩酚酸环醚类化合物对耐甲氧基青霉素的金黄色葡萄球菌的抑菌圈分别为17.0±0.0和17.7±0.6mm,mic值分别为25.6和12.8μm，具有很好抑制耐甲氧基青霉素金黄色葡萄球菌的活性。
实施例3
本实施例为缩酚酸环醚类化合物的抑革兰氏阴菌活性实验。
1、铜绿假单胞菌在自然界广泛分布，各种水、空气、正常人的皮肤、呼吸道和肠道都有这种菌的存在，该菌经常引起术后伤口感染，也可引起褥疮、脓肿、化脓性中耳炎等。
副溶血弧菌广泛存在于海上和海产品中，感染该菌会急性起病，腹痛、呕吐、腹泻及水样便。
2、实验方法：
使用国际标准的滤纸片法进行抗菌活性初筛，以抑菌圈直径衡量抗菌活性强弱(clinicalandlaboratorystandardsinstitute.2012.performancestandardsforantimicrobialdisksusceptibilitytests；approvedstandard.eleventheditionm2-a11.)；复筛使用96孔板，采用国际标准的微量肉汤稀释法(nationalcommitteeforclinicallaboratorystandards.2003.methodsfordilutionantimicrobialsusceptibilitytestsforbacteriathatgrowaerobically,5thed.approvedstandardm7–a6.)，培养16-20h后，625nm读取od值，测定化合物对铜绿假单孢菌和副溶血弧菌的最小抑菌浓度(mic值)及不同浓度下的抑菌率，培养基为标准的muller-hinton肉汤培养基(副溶血弧菌的培养基含1％的氯化钠)。
抑菌率＝(od不加药-od加药)/(od不加药-od培养基)×100％
3、实验结果：
上述实施例1获得的该缩酚酸环醚类化合物对铜绿假单胞菌的抑菌圈分别为11.1±0.2和16.0±0.0mm，mic分别为51.2和102.4μm，表明上述化合物具有抑制铜绿假单胞菌生长的活性；对副溶血弧菌的抑菌圈均为8.3±0.6mm，mic均>102.4μm，表明上述化合物不能有效抑制副溶血弧菌或活性很弱。
实施例4
本实施例为缩酚酸环醚类化合物的抑真菌活性实验。
1、白色假丝酵母(白色念珠菌)是一种致病性真菌，通常存在于正常人的口腔、上呼吸道、肠道和阴道，一般在正常机体中数量少，不引起疾病。为条件致病性真菌，一般会在皮肤、粘膜、内脏及中枢神经发现，该菌会引起鹅口疮、口角炎、阴道炎、肺炎、脑膜炎、肠胃炎、心内膜炎，偶尔会引起败血病。因此，白色假丝酵母是抗真菌药物研发的重要靶标病原微生物。
2、实验方法：
使用国际标准的滤纸片法进行抗真菌活性初筛，以抑菌圈直径衡量抗菌活性强弱(clinicalandlaboratorystandardsinstitute.2012.performancestandardsforantimicrobialdisksusceptibilitytests；approvedstandard.eleventheditionm2-a11.)，复筛使用96孔板，采用国际标准的微量沙氏培养基稀释法(nationalcommitteeforclinicallaboratorystandards.1997.referencemethedforbrothdilutionantifungalsusceptibilitytestingofyeasts:approvedstandardm27-a,7thed.nccls,wayne,pa.)，培养16-20h后，625nm读取od值，测定化合物对白色念珠菌的最小抑菌浓度(mic值)及不同浓度下的抑菌率，培养基为标准的沙氏培养基。
抑菌率＝(od不加药-od加药)/(od不加药-od培养基)×100％
3、实验结果：
对白色假丝酵母的抑菌圈分别为10.0±0.0和15.5±2.2mm，mic值分别为>102.4和6.4μm，具有抑制白色假丝酵母的活性。
实施例5
本实施例为缩酚酸环醚类化合物的杀虫活性实验。
1、卤虫(artemiasalina)又称盐水丰年虫，属节肢动物门、甲壳纲、无甲目、盐水丰年虫科、卤虫属，是一种具有较高经济价值的鱼类饵料生物，也是一种对于毒素较为敏感的重要实验动物，其实验室培养的2～3龄幼虫可用于评价杀虫剂的活性强弱。
2、杀虫活性实验方法：
卤虫孵化与收集：在28℃下，将冻存的卤虫卵加入一个经白炽灯1000lux照射的梨形玻璃漏斗中(其中盛有天然粗海盐配置的海水30g/l，卵投放量为0.15g/l)，每分钟通入420ml的空气，孵育24h，之后利用卤虫趋光性的特性，停止通气，对漏斗下半部分遮光，使死亡的卤虫沉到底部，除去死亡的卤虫，后对漏斗上半部分遮光，使卤虫聚集到底部，开启阀门，用干净的烧杯收集卤虫，用开口光滑的移液枪头吸取烧杯中的卤虫幼虫进行后续实验。
卤虫生物致死法：将样品在96孔板用无水甲醇连续倍半稀释成系列浓度，真空干燥除去有机溶剂，每孔加入200μl卤虫幼虫悬液(含20～30只虫体)，并设置空白对照组，28℃培养24h后，在双目体视显微镜下计数每孔中幼虫总数及死亡数，计算每孔的校正死亡率。
校正死亡率＝(处理孔死亡率-对照死亡率)/对照组存活率×100％
以校正死亡率-浓度作图，取对数趋势线，计算半致死量lc50。
3、实验结果：
上述获得的缩酚酸环醚类化合物的半致死剂量lc50分别为75.87和51.2μm，表明其具有杀虫活性。
实施例6
本实施例为缩酚酸环醚类化合物的抑制乙酰胆碱酯酶活性实验。
1、采用抗乙酰胆碱酯酶药物筛选常用的电鳗乙酰胆碱酯酶进行体外抗乙酰胆碱酯酶活性实验。
2、乙酰胆碱酯酶抑制率测定的实验方法：
化合物浓度设置为：102.4、51.2、25.6、12.8、6.4、3.2、1.6、0.8、0.4、0.2、0.1、0.05，每个浓度两个复孔；设置4组，分别为样品组(样品+49μlpbs+1μldmso+10μlache+20μldtnb，37℃孵育10min，加入20μlatch，37℃孵育20min)、样品空白组(样品+49μlpbs+1μldmso+10μlbsa+20μldtnb，37℃孵育10min，加入20μlatch，37℃孵育20min)、对照组(49μlpbs+1μldmso+10μlache+20μldtnb，37℃孵育10min，加入20μlatch，37℃孵育20min)、空白组(49μlpbs+1μldmso+10μlbsa+20μldtnb，37℃孵育10min，加入20μlatch，37℃孵育20min)，酶标仪405nm处测定od值，根据od值计算各孔对乙酰胆碱酯酶的抑制率。
抑制率＝[(od对照组-od空白组)-(od样品组-od样品空白组)]/(od对照组-od空白组)×100％
以抑制率-浓度作图，取对数趋势线，计算半抑制浓度ic50。
3、实验结果：
上述获得的b化合物对乙酰胆碱酯酶的ic50为56.75μm，表明其具有一定强度的抗乙酰胆碱酯酶活性。
显然，本发明的上述实施例仅仅是为清楚地说明本发明所作的举例，而并非是对本发明的实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动。这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明权利要求的保护范围之内。
序列表
<110>广东海洋大学深圳研究院
广东海洋大学
<120>一种缩酚酸环醚类化合物的应用
<160>1
<170>siposequencelisting1.0
<210>2
<211>569
<212>dna
<213>海洋真菌爪曲霉诱变株(aspergillusunguis)
<400>2
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