叶枯病基因和其他优良基因的转基因育种，本来可以精确实现籼 粳交的改良，但由于目前转基因育种被抵制，而分子标记辅助选择育种首先需要基因定位， 同样需要大田多世代的杂交回交，不能解决籼粳交的问题，另外，分子技术育种，都存在费 用高、技术门槛高的问题，难以被一般育种者所掌握。
【发明内容】
[0013] 本发明的目的是针对现有籼粳交常规育种所面临的杂种F1株高偏高、生育期超 亲晚熟、花粉部分败育结实率偏低的障碍，提供一种将籼稻白叶枯病抗性基因特定而高效 地渗入粳稻从而改良粳稻品种的白叶枯病抗性粳稻育种新方法。
[0014] 本发明的目的是通过以下技术方案解决的： 一种白叶枯病抗性粳稻育种新方法，其特征在于：该育种新方法的步骤如下： (1) 选取待改良粳稻品种/系和抗白叶枯病籼稻抗源：选取农艺性状良好的粳稻品种/ 系并对选取的粳稻品种/系进行排籼培养基的诱导培养，最终选定花药愈伤组织诱导率高 于25%的粳稻品种/系作为待改良粳稻品种/系，选取农艺性状良好且含有白叶枯病高抗 基因的籼稻品种/系作为抗白叶枯病籼稻抗源； (2) 对选取的待改良粳稻品种/系进行粗毒素耐性浓度的鉴定：分别在分化培养基中 加入一定梯度浓度的粗毒素提取液，对步骤（1)中选定的待改良粳稻品种/系的花药愈伤 组织进行分化培养，并选择合适筛选压力水平浓度的粗毒素提取液作为粳稻花药培养粗毒 素选择压； (3) 杂交育种获得三交F1杂交种：将大田种植筛选的抗白叶枯病籼稻抗源与广亲和材 料籼粳架桥获得杂交种F1，选取杂交种F1的花药再与待改良粳稻品种/系杂交获取杂交种 三交F1 ; (4) 对三交F1杂交种进行排籼培养基花药培养：三交F1杂交种正季播种，选取健壮主 穗花药进行排籼培养基花药诱导培养，获得花药愈伤组织，并挑选直径0. 4?0. 8cm的花药 愈伤组织接种于添加了选择压浓度粗毒素的分化培养基，在温度27?29°C、光14h/暗10h 的条件下培养，获得花培幼苗，待花培苗长至2cm之后转接于生根培养基进行继代培养，待 花培苗长至8cm后移栽至周转箱壮苗，10?15天后移栽入大田； (5) 花培苗单株收种获得花培家系，进一步农艺性状、白叶枯病抗性筛选获得改良的粳 稻新品系：大田种植花培苗，单株收种获得白叶枯病抗性改良的粳稻花培家系若干，不同花 培家系进一步大田播种，以待改良粳稻品种/系亲本为对照，筛选获得农艺形状良好且白 叶枯病抗性得到改良的粳稻新品系。
[0015] 所述步骤（1)中的农艺性状良好的粳稻品种/系是指产量高、米质优良、白叶枯病 抗性有待改良以及株尚不宜过尚、生育期早熟或中熟的梗稻品种/系；抗白叶枯病軸稻抗 源是指广量尚、米质优良、尚抗白叶枯病的軸稻品种/系。
[0016] 所述步骤（1)中选取的农艺性状良好的粳稻品种/系进行排籼培养基的诱导培养 的过程如下： (1. 1)取材与预处理：将选取的农艺性状良好的粳稻品种/系大田常规栽培，取叶枕距 为5?7cm、穗色呈淡黄绿色、花药淡黄色且长度约为颖壳的1/3?1/2、孕穗不裂开的健壮 主穗为供试材料，保留2?3张叶片，75%酒精擦拭表面后，用湿毛巾包裹且外套塑料袋，置 4°C下低温预处理3天； (1. 2)接种：预处理后，将含主穗的稻苞剪下，然后将该稻苞浸泡于75%的酒精中处理 3?4min，接着将该稻苞转移于超净工作台中剥离主穗，进一步剥取小穗为大小均匀的小 支梗，接下来用消毒过的纱布包裹小支梗后用浓度为〇. 1%的升汞灭菌l〇min，无菌水漂洗 3?4次，打开纱布晾干，最后用消毒过的剪刀剪开花药上部，抖药法接种花药于排籼培养 基； (1. 3)诱导培养：将排籼培养基置于24?26°C的黑暗环境中诱导愈伤组织，30?40天 后在花药的边缘出现白-淡黄色的无定型细胞团，并在花药接种培养50天后统计花药愈伤 组织诱导率，选定花药愈伤组织诱导率高于25%的农艺性状良好的粳稻品种/系作为待改 良梗稻品种/系。
[0017] 所述步骤（1. 2)中的稻苞是指稻苞顶枕距为7cm至穗下节间上部0. 5cm的区域内 剪材获得的部分，且剥取的小支梗上花药数量为15?25粒。
[0018] 所述步骤（1. 2)中的排籼培养基配方为：N6大量元素+N6微量元素+N6有机质 +2mg/L2, 4-D+O. 5mg/LNAA+0. 5mg/L水解蛋白+5%蔗糖+0? 8%植物凝胶，排籼培养基的pH值 为 5. 8〇
[0019] 所述步骤（2)中的粗毒素耐性浓度鉴定过程如下： (2. 1)粗毒素的制备：将混合白叶枯病菌株接种于装有100mL牛肉膏蛋白胨液体培养 基的三角瓶中，28°C、130rpm恒温振荡培养50h，然后将培养的种子液按2. 5%的接种量转 接到1500mL牛肉膏蛋白胨液体培养基中，继续扩繁72h，再用8500rpm离心20min收集上清 液，50°C旋转蒸发浓缩至原体积的1/10,然后再采用乙酸乙酯法提取粗毒素； (2. 2)对选取的待改良粳稻品种/系进行粗毒素耐力浓度鉴定：分别在分化培养基中 加入一定梯度浓度的粗毒素提取液，然后将步骤（1)中选定的待改良粳稻品种/系诱导培 养的花药愈伤组织转移进分化培养基，诱导培养30?40天后统计愈伤组织分化率，并选择 合适筛选压力水平浓度的粗毒素提取液作为三交F1杂交种花药培养粗毒素选择压浓度。
[0020] 所述步骤（2. 2)中的合适筛选压力水平浓度是指选定的待改良粳稻品种/系诱导 培养的花药愈伤组织在含有粗毒素的分化培养基中的分化率为〇. 8%?1. 2%时的粗毒素浓 度。
[0021] 所述步骤（2. 1)中的牛肉膏蛋白胨液体培养基配方为：牛肉膏0.5%+蛋白胨 1%+NaClO. 5%，pH值7. 5 ;所述步骤（2. 2)中的分化培养基配方为：MS基本培养基+2mg/ L6-BA+0. 2mg/LNAA+梯度浓度粗毒素提取液，分化培养基的pH值为6. 0。
[0022] 所述步骤（4)中的三交F1杂交种的花药愈伤组织诱导率低于3%时，需将三交F1 杂交种与粳稻亲本回交获得BC1F1杂交种，BC1F1杂交种正季播种，选取健壮主穗重新进 行排籼培养基花药诱导培养，直至获得诱导率不低于3%的花药愈伤组织，挑选直径0. 4? 0. 8cm的花药愈伤组织接种于添加粗毒素选择压的分化培养基，在温度27?29°C、光14h/ 暗l〇h的条件下培养，获得花培幼苗，待花培苗长至2cm之后转接于生根培养基进行继代培 养，待花培苗长至8cm后移栽至周转箱壮苗，10?15天后移栽入大田。
[0023] 所述步骤（4)中的排籼培养基配方为：N6大量元素+N6微量元素+N6有机质+2mg/ L2, 4-D+O. 5mg/LNAA+0. 5mg/L水解蛋白+5%蔗糖+0? 8%植物凝胶，排籼培养基的pH值为 5. 8 ;分化培养基配方为：MS无机盐+MS有机物+蔗糖3%+琼脂0. 7%+KT2. 0mg/L+NAA0. 5mg/ L+水解蛋白lg/L+合适筛选压力水平浓度的粗毒素提取液，分化培养基的pH值为5. 8 ;生 根培养基配方为：l/2Ms大量+Ms微量+Ms有机物+蔗糖3%+琼脂0. 8%，生根培养基的pH 值为5. 8。
[0024] 本发明相比现有技术有如下优点： 本发明的育种新方法与常规育种方法相比，能够将籼稻抗白叶枯病基因特定而高效地 渗入粳稻，大大减少了筛选工作量，3年左右即可完成育种，显著缩短常规抗白叶枯病育种 周期；与分子技术育种相比，又具有操作门槛相对较低、花费较少且育种周期缩短的优点， 具有较大的育种应用价值。
【附图说明】
[0025] 附图1为本发明的育种新方法技术