油茶胚根不定芽诱导获得再生植株的方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于油茶细胞工程领域，具体涉及一种以油茶胚根为外植体诱导不定芽， 继而获得完整试管苗植株的方法。
【背景技术】
[0002] 油茶（CamelliaOleifera)是山茶科（Theaceae)山茶属（Camellia)常绿灌木或 小乔木，是我国特有的木本食用油料树种，与油橄榄、油棕、椰子并称为世界四大木本油料 植物。茶油不饱和脂肪酸含量达90%以上，色佳味香，风味独特，营养丰富，耐贮藏，有降血 压、血脂及软化血管的作用，对心血管疾病的预防有重要作用，是优质的食用油之一，被誉 为"东方橄榄油"。同时，油茶副产物还是生产肥料、农药、栲胶的优质原料。油茶主要分布 于我国长江流域以南地区，湖南和江西是油茶主要种植区。目前，中国共有油茶林4531. 2 万亩，年产茶油20多万吨，平均亩产茶油5. 8kg，油茶产业普遍存在着单位面积产量低和 经济效益差两大问题。油茶低产低效的重要原因之一就是良种化程度低，品种混乱，大部 分油茶林处于野生状态，产量较低，良种苗木短缺不能大面积推广种植。同时，油茶炭疽病 Glomerellacingulata(Stonem.)SpauldetSchrenk是油茶的主要病害。在长江流域以 南各省的大面积油茶栽培区，以及河南、陕西南部地区发生普遍。病害发生后，引起严重落 果、落蕾、枝梢枯死，甚至整株衰亡，严重影响了油茶产业的健康发展。通过组织培养可以快 速繁殖油茶脱毒苗，在此基础上通过遗传体系转化而获得抗病植株，在木本油料植物遗传 改良方面有广阔的前景。
[0003] 组织培养是快速繁殖优良植物品种的一条重要途径，具有广阔的商业化前景。关 于油茶组织培养的研宄较多，张智俊等人利用油茶无性系子叶通过体细胞胚胎发生途径获 得了再生植株，李泽等人利用油茶带芽茎段获得再生植株，但以上研宄只能在油茶组织培 养快繁方面有重要意义，不能应用到油茶遗传体系转化获得转基因植株。植物遗传体系转 化最常用的方法是农杆菌介导法侵染植物叶片、下胚轴、叶柄、胚根等器官，而油茶叶片诱 导不定芽的诱导率仅为17.86%，目前还不能应用在油茶遗传体系转发方面，油茶转基因至 今还未找到合适的外植体。本发明通过利用油茶胚根诱导不定芽，再通过不定芽的继代增 殖、生根和炼苗移栽等一系列过程，旨在建立一个高效稳定的油茶胚根离体快繁体系，为油 茶快速繁殖及工厂化育苗奠定基础。关键还在于能够通过农杆菌浸染实现油茶遗传转化 的可能性，为油茶快速繁殖及遗传转化提供更广的途径和技术支撑。
【发明内容】
[0004] 本发明的目的是针对目前采用油茶叶片诱导不定芽还未获得再生植株，油茶转基 因还处于初期探索阶段，主要原因是没有适合油茶遗传体系转化的组培体系，在此基础上， 本发明提供了一种油茶胚根诱导不定芽获得再生植株的方法，该方法利用油茶胚根诱导出 不定芽，其诱导率较高，不定芽出芽数较多，继代增殖系数高，壮苗效果好，生根率高，关键 还能够通过农杆菌浸染实现油茶遗传转化的可能性。
[0005] 本发明的目的是通过以下方式实现的。
[0006] 油茶胚根不定芽诱导获得再生植株的方法，包括以下步骤：
[0007] 1)诱导不定芽：在无菌条件下切取长为1. 0-1. 5cm的油茶无菌苗胚根根段，接种 到l/2MS+2.0mg/L6-BA+0.05-0.1mg/LIAA+0.05mg/LIBA+2.0mg/L6八3的培养基中诱导 不定芽；
[0008] 2)继代培养：将胚根诱导的不定芽切下接种到1/2MS+2. 0-3.Omg/L 6-BA+0. 05-0.lmg/LIBA+0-1.Omg/L6^的培养基中进行不定芽的继代培养；
[0009] 3)壮苗培养：将增殖培养得到的芽转接到WPM+0. 1-1.Omg/LNAA+3. 0-5.Omg/L GA3的培养基中进行壮苗培养；
[0010] 4)生根培养；
[0011] 5)炼苗、移栽。
[0012] 上述方法中诱导不定芽时暗培养3天后，再到光照条件下培养30-35天。
[0013] 上述方法中继代增殖培养时暗培养3天，再到光照条件下培养20-30天。
[0014] 上述方法中壮苗培养时暗培养2天，再转到光照条件下培养20-25天。
[0015] 上述方法中将壮苗培养获得3-4cm的苗接到1/2MS+1. 0-2.Omg/L IBA+1. 0-2. 0mg/LNAA+35g/L珍珠岩的培养基中进行生根培养。
[0016] 上述方法中生根培养时暗培养5天，再转到光照下培养20天即可生根。
[0017] 上述方法中培养温度为26 士I°C，光照培养时光照强度为2100-22001x，光照时间 12-14h/d;所述方法中用到的培养基均附加蔗糖30g/L，琼脂6g/L，pH调至5. 4-5. 6。
[0018] 上述方法中胚根诱导不定芽使用的培养基优选为：1/2MS+2. 0mg/L6-BA+O. 05mg/ LIAA+0. 05mg/LIBA+2.Omg/LGA3;
[0019] 增殖培养使用的培养基优选为：l/2MS+2.Omg/L6-BA+O. 05mg/LIBA+1.Omg/L GA3;
[0020] 壮苗培养使用的培养基优选为：WPM+0. 5mg/LNAA+3. 0-5.Omg/LGA3。
[0021] 上述方法中炼苗、移栽的具体过程如下：
[0022] 将生根后的油茶试管苗先在室内进行移栽前炼苗3-5天，然后从培养瓶中取出， 附带珍珠岩直接移栽到营养杯中，基质为泥炭土：珍珠岩：黄土 = 2:1:1，组培苗移栽后保 持湿度80%以上，覆盖薄膜并每天喷水1~2次，两周后即逐步进行正常管理。
[0023] 上述方法中所述的油茶无菌苗的获得过程如下：
[0024] 选取成熟的当年生油茶种子，取除种皮，将种仁用自来水冲洗3-5min，然后浸泡 10-1511，中间换水2-3次，然后在超净工作台中先用75%的酒精浸泡20-30 8，无菌水冲洗 3-5次，再用0. 1 %的HgCl2消毒3-6min，用无菌水冲洗5-6次，切掉胚乳的大部分，把附带 胚乳的种胚接种在WPM基本培养基中，暗培养2-3天后转到光照条件下培养20-25天即获 得无菌苗；培养温度为26 士 1°C，光照强度为2100-22001X，光照时间12-14h/d。
[0025] 本发明主要过程包括：油茶胚根不定芽诱导、继代增