显示了在构建相对发育尺度中所用的穗发育期。大概尺寸用方括号表示。在 该图中，Vg是营养阶段（vegetativestage)的分生组织；TO是营养阶段向生殖阶段的转 换期；Tl是可见的生殖生长点（0.9mm) ;T2是可见的侧枝原基（lateralbranchprimordia visible) (I. 8mm) ;T3 是可见的小糖原基（spikeletprimordia) (4. 1mm) ;T4 是中心轴和侧 轴延伸（12. 9mm) ;T5是花药分化的开始（41.0mm) ;T6是花粉分化的开始（175mm)以及17 是花药伸出和花粉散落（285.Omm)。
[0099] 图4表示了处于两个生长期（V8和V10) 3个玉米基因型之间的穗大小的差异。
[0100] 图5显示了到达T5-期的⑶U需要值与到达P50 %的⑶U需要值之间的相关性，更 具体地显示了利用到达T5和到达P50%的GDU需要值之间的相关性获得的回归线。每个点 代表在平均各位置点的不同的近交株。
[0101] 图6显示了相对发育尺度如何揭示通过发生在相对发育尺度上0. 62和0. 75处的 花药挤出风险（antherextrusionrisk(AE风险（％)))测定的化学试剂产生玉米穗不育 的效率的最佳窗口的例子，其中达到了到达P50的总的⑶U需要值的62% -75%，其中AE 风险在近交系和成熟组中降到最低。每个数据点代表1个图或两行总共32株植物的平均 值。N= 620
[0102] 图7显示了T-期与GDU(A)和相对发育尺度⑶的函数。每条回归线代表不同的 近交株。
[0103] 图8表示MON87427和CMS区域（block)在不同吐丝（silking)期（X轴）测定 的花药挤出风险的百分比（y轴）。
[0104] 图9显示了以Roundup?杂交系统（RHS)通过MON87427和CMS系统在95%显 著性水平产生的杂种种子的种子遗传纯度和种子特征纯度。图表上黑线分别代表种子遗传 纯度和种子特征纯度的所需质量标准。
[0105] 序列简要说明
[0106]SEQIDNO:1是代表玉米基因组DNA与整合的转基因表达盒之间的5'连接区的 20个核苷酸的序列。
[0107]SEQIDNO:2是代表玉米基因组DNA与整合的转基因表达盒之间的3'连接区的 20个核苷酸的序列。
[0108]SEQIDNO:3是代表玉米基因组DNA与整合的转基因表达盒之间的5'连接区的 60个核苷酸的序列。
[0109]SEQIDNO:4是代表玉米基因组DNA与整合的转基因表达盒之间的3'连接区的 60个核苷酸的序列。
[0110] SEQIDNO:5是代表玉米基因组DNA与整合的转基因表达盒之间的5'连接区的 100个核苷酸的序列。
[0111] SEQIDNO:6是代表玉米基因组DNA与整合的转基因表达盒之间的3'连接区的 100个核苷酸的序列。
[0112] SEQIDNO:7是位于MON87427的插入DNA侧翼、直到并包括转基因DNA插入的 5'序列。
[0113]SEQIDNO:8是位于MON87427的插入DNA侧翼、直到并包括转基因DNA插入的 3'序列。
[0114]SEQIDNO:9是完全整合入玉米基因组DNA并包含表达盒DNA的序列。
[0115]SEQIDNO:10 是代表位于MON87427 的插入DNA侧翼的 5'序列（SEQIDNO:7)、 完全整合入玉米基因组DNA并包含表达盒的序列（SEQIDNO:9)和位于MON87427的插入 DNA侧翼的3'序列（SEQIDNO:8)的叠连群的核苷酸序列，包括SEQIDNO:1-6。
[0116]SEQIDNO:11是用于鉴定MON87427的转基因特异性测试事件引物-1SQ20052。 由 1AQMAN?(PEAppliedBiosystems，FosterCity，CA)测试（使用引物SEQIDNO: 11和SEQIDNO:12的组合）产生的PCR扩增子对于事件M0N87427的存在是阳性结果。
[0117]SEQIDNO:12是用于鉴定MON87427的转基因特异性测试事件引物-1SQ20053。
[0118]SEQIDNO:13是用于鉴定MON87427的转基因特异性测试事件6-FAM探针 PB10016。该探针是6-FAM?-标记的合成寡核苷酸。TAQMAN?测试中，在扩增反应 (使用引物SEQIDNO:11-12结合使用6FAM?-标记的探针）中释放出荧光信号用于诊断 事件M0N87427的存在。
[0119]SEQIDN0:14是转基因特异性测试内部对照引物-1SQ1241。
[0120] SEQIDNO:15是转基因特异性测试内部对照引物-1SQ1242。
[0121] SEQIDNO:16是转基因特异性测试内部对照VIC探针PB0084。
[0122] SEQIDNO: 17是用于鉴定MON87427的事件特异性测试事件引物-1SQ12763。由 TAQMAN?(PEAppliedBiosystems，FosterCity，CA)测试（使用引物SEQIDNO: 17和SEQIDNO:18的组合）产生的PCR扩增子对于事件M0N87427的存在是阳性结果。
[0123]SEQIDNO:18是用于鉴定MON87427的事件特异性测试事件引物-1SQ12886。
[0124]SEQIDNO:19是用于鉴定MON87427的转基因特异性测试事件6-FAM探针 PB4352〇
[0125] 发明详述
[0126] 提供下面的定义和方法以更好地定义本发明并指导本领域普通技术人员实施本 发明。除非另有说明，可以根据相关领域的普通技术人员的常规用法来理解术语。
[0127] 本文所用的术语"玉米"是指"玉米"或玉米（Zeamays)，且包括可与玉米育种的 所有植物品种，包括野生玉米种以及那些属于允许种之间育种的玉蜀黍属（Zea)的植物。
[0128] "草甘膦"是指N-(磷酰基甲基）甘氨酸，是一种5-烯醇式丙酮酰莽草酸-3-磷酸 合成酶（EPSPS)抑制剂除草剂。草甘膦通过抑制EPSPS而干扰芳香氨基酸的合成。草甘膦 作为RoundupkB草剂（MonsantoCompany，St.Louis，Missouri)可商业获得。
[0129] 本发明提供了玉米转基因事件MON87427(此处也被称为M0N87427)。此处所用的 术语"事件"是指通过将转基因核酸分子插入植物基因组的行为（即通过植物转化的动作 而产生转基因植物）而生成的产物。因此，"事件"通过以下人类行为而产生：（i)在实验室 中以包括感兴趣的转基因的核酸分子转化植物细胞，即将核酸构建体或分子插入植物细胞 基因组中，（ii)再生由核酸分子插入植物基因组而导致的转基因植物种群，和（iii)筛选 特征为核酸分子插入植物基因组特定位置的特定植物。因此，事件可被代表连续的DNA分 子的至少一部分的核酸序列独特并特异地描述，该DNA分子由核酸分子插入植物基因组中 特定位置而在事件中产生，并包括一部分连接于插入的DNA分子并在其侧翼的植物自身的 基因组DNA和插入的核酸分子。事件是重组的，由人类行为产生的，不存在于非转基因植物 中。
[0130] 因此术语"事件"是指包括插入植物基因组中特定位置的核酸分子的原始转化植 物（"转化株"）。术语"事件"也指由包括插入植物基因组中特定位置的核酸分子的转化 株传代的所有后代。因此这种后代是转基因的并包含事件。可通过包括自花授粉、与包含 相同或不同转基因的另一种植物杂交和/或非转基因植物、如来自不同种的植物杂交而产 生后代。甚至在许多代之后，在被称为MON87427后代植物的任何植物中，来自原始转化的 插入DNA和侧翼DNA仍将存在并可轻易地辨认。
[0131] 术语"事件"也指在原始转化株中生成的连续DNA分子（包括插入DNA和与插入 DNA的任一侧紧紧相邻的侧翼玉米基因组DNA)和包含该核酸序列的任何DNA分子。通过 将转基因核酸分子插入植物基因组的行为，即通过转化的行为生成连续DNA分子，其对于 特定事件是特异且独特的。因此，插入DNA在与周围玉米植物基因组DNA相关的玉米事件 MON87427中的排列对于MON87427是特异且独特的。该DNA分子也是事件MON87427的 玉米染色体的主要部分，这在植物中是稳定的，可被任何后代继承。
[0132] 转基因玉米事件MON87427植物表现了商业可接受的组织选择性草甘膦耐受性。 在MON87427中，玉米营养组织和玉米雌性生殖组织是草甘膦耐受的，但是对于玉米花粉 发育关键的关键雄性生殖组织对草甘膦不耐受。因此，草甘膦处理的MON87427植物在杂 种种子的生产中可作为雌性亲本。
[0133] 本文所用的术语"重组"是指通常不能在自然界中发现并且通过人为干预、即人类 手工产生的非天然的DNA和/或蛋白和/或生物体。这种人类干预可产生DNA分子和/或 植物或种子。此处所用的"重组DNA分子"是包括并不自然地共同存在而且是人类干预的 结果的DNA分子的组合的DNA分子，即由至少两种彼此异源的DNA分子组成的DNA分子， 和/或人工合成并具有衍生自自然中通常存在的核苷酸序列的核苷酸序列的DNA分子，和 /或包括人工加入宿主细胞的基因组DNA和侧翼的宿主基因组的相关DNA的DNA分子。重 组DNA分子的一个例子是包含至少一条选自SEQIDNO:1-10的序列的DNA分子。此处所 用的"重组植物"是在自然接种不存在，是人类干扰的结果并且包含并入其基因组中的转基 因和/或异源DNA分子的植物。作为这种基因组改变的结果，重组植物与相关的野生型植 物明显不同。重组植物的一个例子是转基因玉米事件MON87427植物。
[0134] 此处所用的术语"转基因"是指人为干预导致的人工并入生物体基因组的核酸分 子。这种转基因对于宿主可以是异源的。术语"转基因"是指包含转基因，例如"转基因植 物"是指包含转基因、即人为干预导致的人工并入生物体基因组的植物。此处所用的术语 "异源的"是指通常在自然界中不存在的第一分子结合自然界中的第二分子。例如，分子可 来自第一物种并插入第二物种的基因组中。因此该分子是异源分子，即对于生物体是异源 的，被人工并入生物体的基因组中。
[0135] 此处所用的术语"嵌合的"是指通过将第一DNA分子与第二DNA分子融合而产生的 单一DNA分子，其中无论第一DNA分子还是第二DNA分子通常都不会以这种结构（即彼此 融合）存在。因此，嵌合DNA分子是一种新的、在自然中通常不存在的DNA分子。嵌合DNA 分子的一个例子是包含至少一条选自SEQIDNO:1-10的序列的DNA分子。
[0136] 本发明提供了DNA分子及其对应的核苷酸序列。此处所用的术语"DNA"、"DNA分 子"、"核酸分子"是指基因组或合成来源的双链DNA分子，即脱氧核糖核苷酸碱基的聚合物 或核苷酸分子，从5'端（上游）至3'端（下游）阅读。此处所用的术语"DNA序列"、"核 苷酸序列"是指DNA分子的核苷酸序列。此处所用的命名法是美国联邦法规§ 1.822的第 37条所要求的，记述在WIPO标准ST. 25 (1998)附录2的表1和3。按照惯例和此处所用的 本发明的核苷酸序列、如SEQIDNO:1-10提供的那些及其片段，仅提供了两条互补核苷酸 序列链中的一条链，但暗示，互补链（即互补链的序列，在本领域中也称为反向互补序列） 也在本发明的范围之内且清楚地落在要求保护的客体范围之内。因此，此处所用的关于SEQ IDNO:1-10及其片段包括并指的是互补链的序列及其片段。
[0137] 此处所用的术语"片段"是指完整部分中的不完整的更小片段的部分。例如，SEQ IDNO:10的片段包括SEQIDNO:10的完整序列的至少约10个核苷酸、至少约20个核苷 酸或至少约50个核苷酸的序列。
[0138] 对应于插入的转基因DNA和插入的转基因DNA任一末端侧翼的玉米基因组DNA实 质片段的完整核苷酸序列的核苷酸序列此处作为SEQIDNO:10提供。其一个分段是作为 SEQIDNO:9提供的插入的转基因DNA(此处也被称为转基因插入序列或插入的DNA)。通 过磷酸二酯键与插入的转基因DNA的5'末端物理连接、因此在其侧翼并包含10个核苷酸 的转基因插入DNA的玉米基因组DNA的核苷酸序列如SEQIDNO:7所示。通过磷酸二酯键 与插入的转基因DNA的3'末端物理连接、因此在其侧翼并包含10个核苷酸的转基因插入 DNA的玉米基因组DNA的核苷酸序列如SEQIDNO:8所示。
[0139]MON87427进一步包含被称为接头的两个区段。"接头"是插入的转基因DNA的一 个末端插入并连接至基因组DNA的地方。接头横跨、即延伸通过插入的转基因DNA的一部 分和相邻侧翼基因组DNA，其包含这两个作为一个连续分子的连接点。一个接头在插入的 基因组DNA的5'末端，一个在插入的基因组DNA的3'末端，在此处分别被称为5'接头和 3'接头。"接头序列"或"接头区段"是指接头的DNA序列和/或相应的DNA分子。本领域 技术人员可以用SEQIDNO:10设计MON87427的接头序列。MON87427的接头序列的例 子作为SEQIDNO: 1-6提供。SEQIDNO: 1是横跨玉米基因组DNA和基因组插入DNA的5' 末端间接头的20个核苷酸的序列；SEQIDNO:3是横跨玉米基因组DNA和基因组插入DNA 的5'末端间接头的60个核苷酸的序列；SEQIDNO:5是横跨玉米基因组DNA和基因组插 入DNA的5'末端间接头的100个核苷酸的序列。SEQIDNO:2是横跨玉米基因组DNA和 插入的DNA的3'末端间接头的20个核苷酸的序列；SEQIDNO:4是横跨玉米基因组DNA 和插入的DNA的3'末端间接头的60个核苷酸的序列；SEQIDNO:6是横跨玉米基因组DNA 和插入的DNA的3'末端间接头的100个核苷酸的序列。图1说明了从5'至3'排列的SEQ IDNO:1-10的物理排列。包括SEQIDNO: 1-6的源自转基因MON87427的任何DNA片段 都在本发明的范围之内。本发明因此提供了包含SEQIDNO:1-6中所述的核苷酸序列的至 少一个的DNA分子。
[0140] 事件MON87427的接头序列作为转基因玉米事件MON87427植物、种子或细胞的 基因组的部分而存在。在来自玉米植物、种子或植物部分的样品中鉴定SEQIDNO:1-6中 的一个或多个可确定DNA从MON87427中获得，且用于诊断来自事件MON87427的DNA样 品的存在。
[0141] 本发明提供了可用作用于诊断样品中来自玉米植物事件MON87427的DNA的存在 的引物或探针的示例性DNA分子。这种引物或探针对于目标核酸序列是特异的，可用于通 过此处所述的本发明的方法鉴定MON87427核酸序列。
[0142] "引物"是被设计用于涉及热扩增的退火或杂交方法中的核酸分子。在热扩增、 如聚合酶链式反应（PCR)中可使用一对引物和模板DNA、如玉米基因组DNA样品以产生扩 增子，其中由这种反应产生的扩增子具有对应于位于引物和模板杂交的两个位点之间的模 板DNA的序列的DNA序列。此处所用的"扩增子"是用扩增技术合成的DNA。本发明的扩增 子具有包含SEQIDNO:1-10或其片段的一个或多个的序列。通常设计引物来与互补的目 标DNA链杂交以在引物和目标DNA链之间形成杂交链，以目标DNA链为模板，引物的存在是 聚合酶起始引物延伸（即将额外的核苷酸聚合加入延伸的核苷酸分子）的识别点。本发明 所用的引物对是指使用两条结合双链核苷酸片段的相反链的两条引物，其目的在于在针对 引物对的每一条结合的位点之间线性扩增核苷酸片段。引物序列的例子作为SEQIDNO: 11-12、SEQIDNO:14-15 和SEQIDNO:17-18 提供。引物对SEQIDNO:14-15 和引物对 SEQIDNO:17-18各自具有第一DNA分子以及第二DNA分子（不同于第一DNA分子），其中 二种分子各自都是长度足以作为DNA引物的连续核苷酸，当与来自MON87427的模板DNA 在DNA扩增反应中共同使用时，可以产生用于诊断样品中源自MON87427的DNA存在的扩 增子。
[0143] "探针"是用于退火或杂交方法中的与目标核酸的链互补的核酸分子。本发明的探 针不仅包括脱氧核糖核酸或核糖核酸，而且包括特异性地结合靶DNA序列的聚酰胺和其它 探针材料，并且这种结合可用于诊断、识别、确定或验证具体样品中靶DNA序列的存在。探 针可结合于常规可检测的标记或报告分子，例如放射性同位素、配体、化学发光试剂或酶。 可用作检测MON87427的探针的序列的例子是SEQIDN0:1-2、SEQIDN0:13、SEQIDNO: 16、SEQIDNO:19。
[0144] 设计和使用引物和探针的方法是本领域熟知的，例如在JosephSambrook， MolecularCloning：ALaboratoryManual，ThirdEdition，ColdSpringHarbor LaboratoryPress(2001)和CurrentProtocolsinMolecularBiology,Wiley-Blackwell 中描述。包含SEQIDNO:1-10的片段并可用作检测MON87427的引物和探针的DNA分子 可以被本领域技术人员容易地设计用作杂交检测方法、例如Southern印迹方法中的探针。
[0145] 因此，此处所示的DNA分子及对应的核苷酸序列可用于例如鉴定MON87427,筛选 包含MON87427的植物品种或杂种，检测样品中来自转基因MON87427的DNA的存在以及 监测样品存在和/或缺乏MON87427或来自MON87427的植物部分。
[0146] 本发明提供了玉米植物、后代、种子、植物细胞、植物部分以及商业产品。这些植 物、后代、种子、植物细胞、植物部分和商业产品包含可检测量的本发明的核苷酸，即，如具 有至少如SEQIDNO:1-10所示的一个序列的核酸分子。本发明的植物、后代、种子、植物细 胞和植物部分也包含一种或多种额外转基因。这种转基因可以是编码蛋白或RNA分子的任 何核苷酸序列，该蛋白或RNA分子赋予期望的特性，包括但不限于增强的昆虫抗性、增强的 水利用效率、增强的产量性能、增强的抗旱性、增强的种子质量、改进的营养质量和/或增 强的除草剂耐受性，其中该期望的特性是相对于缺乏该额外转基因的玉米植物而测定的。
[0147] 本发明提供了源自转基因玉米植物事件87427的玉米植物、后代、种子、植物细 胞、植物部分以及叶子。为了实现本发明，MON87427的种子的代表性样品已经根据布达佩 斯条约进行了保藏。选择接受该保藏的保藏中心是美国典型培养物保藏中心（ATCC)，其地 址为 10801UniversityBoulevard，Manassas，VirginiaUSA，邮编 20110。该ATCC保藏中 心将登录号No.PTA-7899分配给该事件MON87427的种子。
[0148] 本发明提供了含有具有其基因组中存在的SEQIDNO:1-10的DNA分子的微生物。 这种微生物的一个例子是转基因植物细胞。微生物，如本发明的植物细胞，可用于许多工业 应用，包括但不限于：（i)用作科学探宄或工业研宄的研宄工具；（ii)在培养中用于产生内 源的或重组的可用于随后的科学研宄或用作工业产品的碳水化合物、脂质、核酸或蛋白产 品或小分子；以及（iii)可与植物组织培养技术一起使用以产生随后可用于农业研宄或生 产的转基因植物或植物组织培养物。微生物如转基因植物细胞的生产和使用应用微生物技 术和人类干预以产生人造的独特的微生物。在该过程中，重组DNA被插入植物细胞基因组 以产生与天然存在的植物细胞分离且独特的转基因植物细胞。然后该转基因植物细胞可以 用现代微生物技术像细菌和酵母细胞一样培养，可以未分化的单细胞状态存在。新的植物 细胞的转基因组成和表型是由异源DNA整合进细胞基因组而产生的技术效果。本发明的另 一方面是使用本发明的微生物的方法。本发明的使用微生物如转基因植物细胞的方法包括 ⑴通过将重组DNA整合进细胞基因组，然后用该细胞衍生具有同样异源DNA的额外细胞的 方法；（ii)用现代微生物技术培养包含重组DNA的细胞的方法；（iii)产生并纯化内源或 重组的来自培养细胞的碳水化合物、脂质、核酸或蛋白产品的方法；以及（iv)使用现代植 物组织培养技术和转基因植物细胞以产生转基因植物或转基因植物组织培养物的方法。
[0149] 本发明的植物将事件DNA(包括转基因插入序列）传至后代。此处所用的"后代" 包括包含源自祖先植物的事件DNA和/或具有至少如SEQIDNO:1-10所示序列中一条序列 的核酸分子的任何植物、种子、植物细胞和/或再生植物部分。植物、后代和种子对于该基 因而言可以是纯合的或杂合的。后代可由MON87427植物产生的种子和/或与MON87427 植物的花粉受精的植物产生的种子生长而成。本发明的植物可通过自花授粉或异花授粉产 生和/或被用于自花授粉或异花授粉方法中。因此，在一种实施方式中，MON87427植物可 以被不同的玉米植物异花授粉而产生杂种后代。可用于MON87427玉米植物的育种方法是 本领域已知的。
[0150] 本发明提供了源自MON87427的植物部分。此处所用的"植物部分"是指由源自 MON87427植物的材料组成的植物的任何部分。植物部分包括但不限于：花粉、胚珠、荚、 花、根或茎组织、纤维和叶。植物部分可以是活的、非存活的、可再生的和/或不可再生的。
[0151] 本发明提供了由转基因玉米事件MON87427产生并包含具有选自SEQIDNO: 1-10的核苷酸序列的核酸分子的商业产品。