生物合成白藜芦醇的未去壳稻谷及其用图_2

文档序号:9287788阅读:来源:国知局
存在于在葡萄皮、葡萄籽、花生等之中。 已进行了许多关于白藜芦醇对人类的影响的研究,且已知的为对抗癌,抗病毒,神经保护作 用,抗衰老,抗炎,延长生命等等的作用。白藜芦醇存在顺式和反式的形式,预期只有反式白 藜芦醇有药用功效。
[0043] 本文所用的术语"白藜芦醇合酶基因"是指一个基因(核苷酸序列)编码一种对合 成白藜芦醇有作用的酶,且其可能包括所有无论基质最终对合成白藜芦醇有作用的酶。本 发明中,白藜芦醇合酶基因可以源自花生且由SEQ ID N0:1表示的核苷酸序列组成。
[0044] 本发明所述的用于生物合成白藜芦醇的白藜芦醇强化的转基因水稻可以是将白 藜芦醇合酶基因插入天然水稻的第12号染色体上的水稻。例如,可以连续的将两拷贝数的 白藜芦醇合酶基因可表达地插入第12号染色体上。特别的,所述两拷贝数的白藜芦醇合酶 基因可在彼此相反的方向上被插入。
[0045] 进一步的,本发明的用于生物合成白藜芦醇的水稻可以被插入至天然水稻第12 号染色体的以SEQ ID N0:7表示的核苷酸序列的区域,尤其是被插入至以SEQ ID N0:7表 示的核苷酸序列的第572号碱基之后。
[0046] 进一步的,本发明的用于生物合成白藜芦醇的水稻可以是天然东津稻,其中,白藜 芦醇合酶基因被插入至以SEQ ID NO:7表示的核苷酸序列中,尤其是插入至以SEQ ID NO:7 表示的核苷酸序列的第572号碱基之后,所述以SEQ ID N0:7表示的核苷酸序列存在于第 12号染色体中。本发明中白藜芦醇合酶基因被插入的SEQ ID NO: 7序列对应的区域在水稻 染色体中可被多种天然的或人工的突变改变。因此,本发明所述的白藜芦醇合酶基因被插 入的区域可与以SEQ ID NO: 7表示的核苷酸序列有80%或以上的同源性,优选的90%或以 上,最优选的95 %或以上,只要有利于白藜芦醇合酶基因的表达。
[0047] 本发明的用于生物合成白藜芦醇的水稻不仅可以包括多个变种,杂种等,用来使 用本发明的水稻针对特定繁殖条件和特定表型加入或去除一种特征,而且还可以包括随机 突变体,是被繁殖研究领域惯用的诱导突变的多种方法而改变的,只要其保持本发明的生 物合成白藜芦醇的作用。
[0048] 本发明所述的诱导突变的方法可以包括辐照如电磁波辐照、粒子辐照、X-射线辐 照、γ-射线辐照、α射线辐照、β射线或紫外射线辐照等;化学突变诱导如插层剂(吖啶 橙,原黄素,叮啶黄等),碱基类似物(5'-溴尿嘧啶,2-氨基嘌呤等),DNA修饰剂(亚硝酸, 羟胺(NH2OH),烷化剂(MMS,EMS,叠氮化钠)等);等等,但不限于此。
[0049] 本发明所述的水稻可以是存在登录号KCTC12529BP下的水稻。
[0050] 本发明的水稻成熟时,在糙米(brown rice)的情况下可以含有约2 μ g/g至 5. 3 μ g/g的白藜芦醇,在精米(milled rice)的情况下可以含有约1. 8 μ g/g至4. 1 μ g/g 的白藜芦醇。
[0051] 本文所用的术语"白藜芦醇苷"是指白藜芦醇的糖苷,且已知的,是虎杖 (Polygonum cuspidatum)根的一种主要成分,用于中药治疗。
[0052] 优选的,本发明的水稻成熟时,其精米可包括约1. 0 μ g/g到6. 5 μ g/g的白藜芦醇 苷。
[0053] 在一个实施例中,本发明证实了,当源自落花生(Arachis hypogaea)的白藜芦醇 合酶基因被分离并插入至水稻中时,其对应的基因序列与SEQ ID NO: 1相同。证实了,对于 转化水稻种子,本发明已确认其在高浓度下生物合成白藜芦醇,对应的白藜芦醇合酶基因 被插入至水稻的第12号染色体中。特别的,证实了,两个T-DNAs是在彼此相反的方向上被 插入至水稻(亚洲型栽培稻)的第12号染色体中相同的位置。尤其的,与T-DNAs被插入 的区域相邻的序列与在NCBI上公开的日本晴相比,其为具有完整的序列分析的亚洲型栽 培稻粳稻(Oryza sativa japonica)水稻,且被证实,第一 T-DNA插入开始于第330872号 碱基位,接着第二T-DNA在相反的方向插入。本发明的具有这样插入结构的转化水稻,与常 规的转化水稻相比,能够具有相当优越的白藜芦醇合成能力。所述的转化水稻种子命名为 白藜芦醇强化水稻或白藜芦醇强化转基因水稻,且于2013年12月5日存放在韩国生物科 学与生物技术研究所生物资源中心的登录号KCTC12529BP之下。
[0054] 然而,本发明中分析的碱基位置可能由于各种错误而在一定程度上被改变,通常 发生在对几十万到几百万的碱基染色体分析的过程中,且可能依据分析方法,进行不同的 分析。但是,这仅仅是分析方法中的一个错误,不是突变位置的实际变化,因此不影响本发 明的实质内容。尽管本发明中的所述白藜芦醇合酶基因的碱基位置可能依据未来分析方法 的改进或在核苷酸序列分析水平的改变等而受到不同的分析,但是可以重新分析,或基于 存放在韩国生物科学与生物技术研究所生物资源中心的登录号KCTC12529BP之下的本发 明的种子,进行解释。
[0055] 进一步的,本发明生产的用于生物合成白藜芦醇的转基因水稻,其被证实包括,插 入至东津稻的第12号染色体的以SEQ ID N0:7表示的核苷酸序列的一个区域,尤其是在以 SEQ ID NO: 7表示的核苷酸序列的第572号碱基之后的白藜芦醇合酶基因。当通过NCBI blast程序对所述基因插入的位置进行分析时,证实是在NCBI登录号NC_008405的第12号 染色体中,其正是在本发明的东津稻分类中的亚洲型栽培稻粳稻水稻的核苷酸序列分析。
[0056] 特别的,证实了尤其是在插入NC_008405的第330872号碱基位。然而,因为该碱 基位可以根据发生在生长、交配等过程中的突变而改变,如果该插入位置是本质上可能等 同的,我们认为没有超出本发明的范围。
[0057] 在一个实施例中,本发明证实了,当在本发明的转基因水稻的糙米种子中含有白 藜芦醇和白藜芦醇苷时,所含有的白藜芦醇和白藜芦醇苷是高浓度的。特别是,在精米中包 含约1. 8 μ g/g至4. 1 μ g/g的白藜芦醇,和约L 0 μ g/g至6. 5 μ g/g的白藜芦醇苷(表3), 且在糙米中包含约2 μ g/g至5. 3 μ g/g的白藜芦醇(图13)。同时,考虑到白藜芦醇苷主要 集中在水稻种子的外壳,白藜芦醇苷在糙米中的浓度预期明显更高。
[0058] 在另一个实施例中,本发明提供了所述用于生物合成白藜芦醇的白藜芦醇强化的 转基因水稻生产的水稻种子,其中,两拷贝数的白藜芦醇合酶基因被可表达地插入至天然 水稻的第12号染色体中。特别的,本发明提供了从本发明的水稻生产的水稻种子。
[0059] 本文所用的术语"东津稻"是指于1975年开发的金南风(Geumnampung)和洛东稻 (Nakdong rice)以及Satominori三元杂交育种产生的种子,目的是为了开发一种抗病,质 量好,产量高的新品种,其中,洛东稻是疾病高抗水稻。在1981年,在韩国其被选为推荐种 子并分布开来,命名为东津稻。
[0060] 本文所用的术语"水稻种子"是指水稻的种子,包含所有的只要是种子情况,无论 是无磨的、半磨的(糙米)、或全磨的(精米)。
[0061] 在另一个实施例中,本发明提供了一种用于预防和改善代谢性疾病的保健功能性 食物组成,包括从用于生物合成白藜芦醇的白藜芦醇强化转基因水稻生产的水稻种子,其 中,两拷贝数的白藜芦醇合酶基因被可表达地插入至天然水稻的第12号染色体中。特别 的,本发明提供了一种保健功能性食物组成,用于预防和改善代谢性疾病,其包括本发明的 白藜芦醇强化转基因水稻产生的水稻种子。本发明的食物组成可作用的代谢性疾病可以包 括肥胖症、糖尿病、高脂血症、高胆固醇血症、动脉粥样硬化、其他心血管疾病等。优选地,本 发明的代谢性疾病可以为糖尿病或肥胖症。
[0062] 本文所用的术语"保健功能性食物"是指根据保健功能性食物法律6727号,使用 对人体有益的原材料或成分生产或加工的食物。所述术语"功能性"是指,用于对人体的结 构和功能营养调节获得有益效果或对健康如生理应用获得有益效果的食物摄入。
[0063] 本发明所述的用于预防和改善代谢性疾病的保健功能性食物组成可以是丸状、粉 末、颗粒、浸剂、片剂、胶囊、或液体形式。本发明的组合物可被添加至例如各种食品中,如饮 料、口香糖、茶、维生素复合物、保健食品等食物中。
[0064] 作为可以包含在所述的用于预防和改善代谢性疾病的保健功能性食物组成中的 必要成分,可以包括一种用于预防和改善代谢性疾病的组分,其含有用于生物合成白藜芦 醇的水稻产生的水稻,或该组分的一种活性物质、或该组分的一种药学上可接受的盐,但不 限于此。像传统的食品,可能包含,各种中草药提取物,食品补充添加剂,或天然的碳水化合 物作为附加成分。
[0065] 进一步的,如所述的,食品补充添加剂可额外添加,食品补充添加剂可以包括本领 域中的常规食品补充添加剂如调味剂、香料、色素、填料、稳定剂等。
[0066] 天然碳水化合物的实例是单糖如葡萄糖、果糖等,二糖如麦芽糖、蔗糖等,和多糖 例如常规糖如糊精、环糊精等以及糖醇如木糖醇、山梨糖醇、赤藓糖醇。除了上述的那些,天 然调味剂如索马甜、甜叶菊提取物(例如莱鲍迪甙A、甘草甜素等),和人工调味剂如糖精、 阿斯巴甜等,可以有利地使用。
[0067] 对上述进一步的,本发明的一种用于预防和改善代谢性疾病的保健功能性食物组 成可以包括各种营养素,维生素,矿物质(电解质),调味剂如合成调味剂和天然调味剂,着 色剂,填料(奶酪,巧克力等),果胶酸及其盐类,褐藻酸及其盐类,有机酸,保护胶体增稠 剂,PH调整剂,稳定剂,防腐剂,甘油,醇类,用于碳酸饮料的炭化剂等等。此外,所述保健功 能性食品组成可以包括用于生产天然果汁、果汁饮料和植物饮料的果肉。这些组分可以单 独使用或组合使用。
[0068] 在本发明的一个实施例中,本发明所述的白藜芦醇强化转基因水稻产生的水稻种 子含有高浓度白藜芦醇,以该种子或东津稻种子生产的饲料给患有诱导代谢性疾病的动物 模型(小鼠)通过长期高脂饮食喂食12周。
[0069] 首先,在向患诱导代谢性疾病的小鼠投喂饲料之后,其中,用东津稻和白藜芦醇强 化转基因水稻代替该饲料中的碳水化合物组分,测血糖。消耗白藜芦醇强化转基因水稻生 产的饲料的小鼠从第八周开始显示血糖降低,且血糖水平在第十二周下降达22%。另一方 面,对照组显示血糖升高或不变。进一步的,当给小鼠喂以含有白藜芦醇(Resv)的常规饲 料,其中的白藜芦醇(Resv)含量等同于由白藜芦醇强化转基因水稻所产的饲料中所含的 白藜芦醇,小鼠没有表现出任何明显的差异,从而证实了白藜芦醇强化转基因水稻对降低 血糖的作用优于简单的含有白藜芦醇(图2)。
[0070] 其次,在向患诱导代谢性疾病的小鼠投喂饲料之后,其中,用东津稻和白藜芦醇强 化转基因水稻代替该饲料中的碳水化合物组分,测定血液中的总胆固醇,血液中的总天然 脂肪,和血液中的LDL和HDL胆固醇。消耗白藜芦醇强化转基因水稻生产的饲料的小鼠显示 血液中的总胆固醇降低27.0%,血液中的总天然脂肪降低37.4%,且血液中的LDL胆固醇 降低59. 6%,而血液中HDL胆固醇显示升高14. 8%,起到预防代谢性疾病的作用。另一方 面,与消耗白藜芦醇强化转基因水稻生产的饲料的组相比其他对照组显示无作用或作用较 低。此外,即使与喂食含有白藜芦醇(Resv)的常规饲料的组相比,其中的白藜芦醇(Resv) 含量等同于由白藜芦醇强化转基因水稻所产的饲料中所含的白藜芦醇,消耗白藜芦醇强化 转基因水稻生产的饲料的组表现出改善血脂的作用。这证实了白藜芦醇强化转基因水稻对 改善血脂的作用优于简单的含有白藜芦醇(图3)
[0071] 进一步的,向患诱导代谢性疾病的小鼠投喂饲料之后,其中,用东津稻和白藜芦醇 强化转基因水稻代替该饲料中的碳水化合物组分,测量体重变化和总脂肪。消耗白藜芦醇 强化转基因水稻生产的饲料的小鼠显示体重下降24. 7%。同时,当使用活体微计算机断层 扫描测量总脂肪量时,
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