总脂肪量减少了 21. 55% (对照组减少了 25. 43%组），内脏脂肪量减 少了 16.33% (对照组减少了 20.02% )，皮下脂肪量减少了 3. 1% (对照组减少了 3.83% 组）。因此，证实了总脂肪含量与对照组相比显著降低。这证实了白藜芦醇强化转基因水稻 对降低血糖的作用优于简单的含有白藜芦醇。
[0072] 同时，为了比较白藜芦醇强化转基因水稻，本发明人生产了对照转基因水稻，其中 的白藜芦醇合酶基因插入至天然水稻的第4号染色体，从而旨在证实本发明的白藜芦醇强 化转基因水稻的良好效果。因此，通过证实所述对照转基因水稻，虽然插入了白藜芦醇合酶 基因，与具有相同白藜芦醇添加量的天然水稻相比没有表现出显著的差异，间接证实了本 发明的白藜芦醇强化转基因水稻在降低血糖水平，改善血脂，降低体重和身体脂肪等等上 表现出优异的效果。
[0073] 在另一个实施例中，本发明提供了用于预防和改善代谢性疾病的动物饲料组成， 包括由用于生物合成白藜芦醇的白藜芦醇强化转基因水稻生产的水稻种子，其中，两拷贝 数的白藜芦醇合酶基因可表达的插入至天然水稻的第12号染色体中。
[0074] 本文所用的术语"动物"指的是一种根据畜牧法第2(2) (i)条和该法实施条例的 第二条中每一款所定义的，野生的由于驯服行为而适合饲养的动物。所述动物可以是牛， 马，骡，驴，山羊，斑玲，绵羊，鹿，猪，兔子，狗，猫，家禽等。
[0075] 本文所用的术语"饲料"指的是任何天然的或人工的日粮，餐粮，或其供动物食用、 摄取、消化等的组分。在一个实施例中，一种包括本发明的高白藜芦醇含量水稻的动物饲料 组成，其可以包括浓缩饲料，粗饲料，和/或特种饲料。
[0076] 浓缩饲料可以包括：仁果，包括谷类如小麦，燕麦，玉米等；麸皮如米糠，小麦麸， 大麦鼓等，是来自精制谷粒的副广品；芝麻柏，是从大S·，油采轩，芝麻，挪子等中提取油的 副产品；残留物如剩余淀粉物质，是红薯，土豆等去除淀粉后留下的淀粉残留的主要组成部 分；鱼浆，一种从鱼粉，鱼废物和鱼肉得到的液体生物浓缩物；动物基饲料如肉粉，血粉，羽 毛粉，脱脂奶粉，干燥从牛奶制得的奶酪或从脱脂牛奶制得的酪蛋白生产的残余物乳清制 得的乳清粉；酵母菌，小球藻，海藻等。
[0077] 粗饲料可以包括新鲜草饲料如野草，牧草，喂青饲料等；块根类蔬菜如饲料用萝 卜，饲料用甜菜，作为一种萝卜的芜菁甘蓝等；青贮饲料，一种储藏饲料，通过向筒仓中填充 新鲜青草，喂青饲料作物，构树等，并乳酸发酵制得；嫩干草，通过切削和干燥野草、牧草，和 畜牧用农作物秸杆制得；以及豆类和植物的叶子。特种饲料可以包括矿物质饲料如牡蛎壳， 岩盐等；尿素饲料如尿素及其衍生物，二酰脲异丁烯等；和饲料添加剂，当只混合了天然饲 料原料或为了增加饲料的保质期时，其被少量加入混合饲料中以补充可能缺乏的成分。
[0078] 在另一个实施例中，本发明提供了一种用于预防和改善代谢性疾病的药物组成， 其包括由用于生物合成白藜芦醇的白藜芦醇强化转基因水稻生产的水稻种子，其中，两拷 贝数的白藜芦醇合酶基因可表达的插入至天然水稻的第12号染色体中。特别的，本发明提 供了一种用于预防和改善代谢性疾病的药物组成，其包括由本发明的白藜芦醇强化转基因 水稻生产的水稻种子。
[0079]白藜芦醇强化水稻的种子，其包含在本发明的药物组成中，可以不仅包括未加工 的水稻生产的水稻种子，还包括从水稻种子产生的所有形式，比如那些加工后激活水稻种 子活性物质的产品，水稻提取物，水稻组分等。
[0080] 此外，本发明的药物组成可以包括药学上可接受的载体。
[0081] 本发明的药物组成可以通过本领域众所周知的方法以药物制剂的形式生产，以在 施用给哺乳动物之后，提供快速的，持续的或延迟的释放活性物质。对于制剂的生产，首选 的是将活性物质与载体混合或稀释，或者把它装入容器形式的载体之中。
[0082] 因此，本发明的药物组成可以按常规方法制成制剂，其形式为粉末，颗粒，片剂，胶 囊剂，悬浮剂，乳液，糖浆，口服剂型如气雾剂，外用制剂，栓剂和无菌注射，其可以进一步包 括通常用于制备组合物的载体，辅料，和稀释剂。
[0083]例如，可以包括在本发明的组成中的载体，可以是乳糖，葡萄糖，蔗糖，山梨糖醇， 甘露醇，木糖醇，赤藓糖醇，麦芽糖醇，淀粉，阿拉伯胶，海藻酸盐，明胶，磷酸钙，硅酸钙，纤 维素，甲基纤维素，微晶纤维素，聚乙烯吡咯烷酮，水，羟基苯甲酸甲酯，对羟基苯甲酸丙酯， 滑石粉，硬脂酸镁和矿物油等，但不限于此。当配制该制剂时，可以使用常用的填充剂，扩链 剂，粘合剂，润湿剂，崩解剂，稀释剂如表面活性剂等或辅料。
[0084] □服固体制剂包括片剂，丸剂，粉末，颗粒，胶囊等，并可以通过混合至少一种辅料 如淀粉，碳酸钙，蔗糖或乳糖，明胶等至复合物而生产。此外，除了简单的辅料，润滑剂如硬 脂酸镁、滑石粉，也可以使用。
[0085] 口服液体制剂可以是悬浮液，溶液，乳液，糖浆等，且可以不仅包括一般用的简单 的稀释剂，如水和液体石蜡，还可以包括其他各种辅料如润湿剂，甜味剂，调味剂，防腐剂 等。
[0086]胃肠外给药制剂可以包括灭菌水溶液，非水溶剂，悬浮液，乳液，冻干制剂和栓剂。 作为非水溶剂或悬浮剂，可使用丙二醇、聚乙二醇、植物油如橄榄油、和可注射型酯类如油 酸乙酯。作为栓剂基质，可使用半合成椰油酯/棕榈油酯，聚乙二醇，吐温61，可可脂，月桂 酸甘油酯，甘油明胶等。
[0087] 实施例
[0088] 以下，将更详细的描述本发明参考的实施例，但实施例仅作说明用途，因此本发明 的范围不限于此。
[0089] 实施例1,分离白藜芦醇合_基_并测序
[0090] 为了使用所述的白藜芦醇合酶基因来研发本发明的用于高浓度生物合成白藜芦 醇的水稻，分离出落花生的白藜芦醇合酶基因，其在高浓度下生物合成白藜芦醇。
[0091] 首先，收获由韩国农村发展局种植培育的落花生的荚，使用液态氮细磨，采用TRI 试剂（MRC公司，美国）分离总RNA。使用NucleoTrap mRNA Midi纯化试剂盒（Clontech公 司，美国）获得总RNA。
[0092] 其次，使用一步法RNA PCR试剂盒（Takara公司，日本），以正向/反向引物进行 逆转录-聚合酶链反应。所述逆转录-聚合酶链反应进行如下：50°C下30分钟的1次逆 转录；94°C下2分钟的1次变性；和94°C下30秒的35次变性，在57°C下退火一分钟，并在 68°C下扩增1分钟。此处使用的正向/反向引物如下：
[0093] 正向引物
[0094] 5'-ATGGTGTCTGTGAGTGGAATTC-3' （SEQ ID N0:2)
[0095] 反向引物
[0096] 5'-CGTTATATGGCCACACTGC-3' （SEQ ID N0:3)
[0097] 所述白藜芦醇合成酶cDNA，是从落花生的mRNA的扩增而得，其被克隆至基因载 体，g卩pGEM-T Easy载体（Promega,美国），转移至大肠杆菌JM109而用于序列分析。序列 分析的进行使用了 LI-COR公司（美国）的DNA测序仪4200,以及存在于载体中的T7和SP6 引物（SEQ ID N0:1)。
[0098] 实施例2. -种转化载体的律立
[0099] 为了诱导从实施例1中得到的所述白藜芦醇合酶基因至水稻中，建立了一种转化 载体。
[0100] 特别的，为了建立水稻的一种转化载体，引入了泛素启动子用于诱导植物体的组 成型表达，且引入一种抗除草剂基因，Bar，作为选择标记，同时利用pCAMBIA 3300载体作 为骨架。得到的载体被命名为PSB22载体。
[0101] 通过PCR反应使用正向引物和反向引物使实施例1中所述的白藜芦醇合酶基因扩 增，所述正向引物具有被BamHl限制性酶靶向的序列（5' -CGGATCCATGGTGTCTGTGAGTG-3'， SEQIDN0:4)，且所述反向引物具有被Sacl限制性酶靶向的序列（5'-CGAGCTCCGTTATATGG CCACA-3'，SEQ ID N0:5)
[0102] PCR反应进行如下：在94°C下2分钟的初始变性；然后，在94°C下20秒变性，64°C 下20秒的退火，72°C下50分钟的扩增，如此，循环35次；最后，在72°C下50秒的终极扩增。
[0103] PCR反应得到的PCR产品以限制酶BamHl和Sacl进行处理，其被引入至pSB22水 稻转化载体中。从引入产生的载体命名为PSB2220,其结构如图1所示。
[0104] 实施例3.牛产白藜芦醇合酶基闵转化水稻
[0105] 为了向水稻中导入实施例2中生产的用于水稻转化的所述pSB2220载体，采用冻 融法将所述载体导入根癌农杆菌（LBA 4404)中（An，1987 ;An等人，1988)。
[0106] 导入 pSB2220 的农杆菌在 AB 液体培养基（K2HP046g，NaH2P042g，NH 4Cl 2g，KCl 0· 3g，MgS04 ·7Η20 0· 6g，CaCl2 ·2Η20 0· 025g，FeS04 ·7Η200· 05g，葡萄糖 10g，去离子水 IOmL) 之中于28°C培养3天，增殖，浓缩10倍后用于愈伤组织的感染。
[0107] 成熟水稻种子的糙米用70%乙醇消毒一分钟，用2%的次氯酸钠消毒一小时。灭 菌后，用消毒水冲洗种子至少5次，并在2N6培养基（N6盐3. 95g/L，蔗糖30g/L，酪蛋白水 解物lg/L，2, 4-D 2mg/L，植物凝胶2g/L，pH 5. 6-5. 7)中，于25°C黑暗条件下培养约3周， 从而诱导愈伤组织。
[0108] 在诱导的水稻愈伤组织中，将其直径约3至4毫米的所述愈伤组织再次投入2N6 培养基中并在25°C黑暗条件下培养4天。在培养的愈伤组织与培养有农杆菌的培养基混合 并感染20分钟之后，将其放入2N6AS100培养基（2N6,100 μΜ乙酰丁香酮）并在20°C黑暗 条件下培养3天。混合培养后用消毒水，其中加入了 250mg/L头孢噻肟，冲洗愈伤组织至少 5次，以去除其中没被诱导的残留的农杆菌。
[0109] 将农杆菌感染的愈伤组织放入2N6-PT5培养基（N6盐3. 95g/L，蔗糖30g/L， 酪蛋白氨基酸lg/L，2, 4-D 2mg/L，草丁膦5mg/L，头孢噻聘250mg/L，植物凝胶2g/L，pH 5.6-5.7)中，并在25°C黑暗条件下培养4周，之后挑选具有草丁膦（PPT)选择标记抵抗性 的愈伤组织，这样积极生长。
[0110] 将从2N6-PT5培养基挑选的愈伤组织放入N6-BA培养基（N6盐3. 95g/L，蔗糖 20g/L，山梨醇 30g/L，酪蛋白氨基酸 2g/L，2,4-D lmg/L，BAP 0.5mg/L，PPT 6mg/L，头孢噻 肟250mg/L，植物凝胶2g/L，pH 5. 6-5. 7)中并在25°C黑暗条件下培养2周，之后挑选生长 旺盛的愈伤组织
[0111] 将从N6-BA培养基选取的愈伤组织放入MSR培养基（MS盐3. 95g/L，蔗糖40g/L， 山梨醇 20g/L，肌醇 100mg/L，NAA (λ lmg/L，激动素 2mg/L，PPT 6mg/L，头孢噻肟 250mg/L，植 物凝胶5g/L，pH 5. 6-5. 7)中，并在25°C和16小时的光照条件下培养至少一个月，随后分 化成植物体。
[0112] 当再分化水稻在皮氏培养皿中尺寸达约4至5cm时，将其移到瓶子培养基中，在约 200001ux的照明，温度25°和16小时的光照条件下生长到2至3叶期。然后，将幼苗移栽 至转基因温室的土壤中，并收获种子。假定目前的再分化植物体是TO代，且从该植物体收 获的种子是Tl代，连续进展直到T5代。
[0113] 实施例4.证明白藜芦醇合酶基闵是否被诱导至转化水稻中
[0114] 4-1.诱导的简单证明
[0115] 通过聚合酶链反应来证明白藜芦醇合酶基因是否被诱导至实施例3生产的转化 水稻中
[0116