] 详细的，基因组的DNA从所述实施例3生产的转化水稻中分离，其后进行聚合酶 链反应。在聚合酶链反应中使用了所述用于生产PSB2220载体的正向和反向引物（正向； 5'-CGGATCCATGGTGTCTGTGAGTG)-3'，SEQ ID N0:4,反向；5'-CGAGCTCCGTTATATGGCCACA-3'， SEQ ID NO :5)〇
[0117] 聚合酶链反应进行如下：94°C下初始变性2分钟；然后，94°C下变性20秒，64°C下 退火20秒，72 °C下扩增50秒，如此循环35次；最后，72 °C下终极扩增7分钟。
[0118] 所述聚合酶链反应显示一个I. Ikb的带，其对应于白藜芦醇合酶基因，从而证实 了白藜芦醇合酶基因被稳定的插入至所述转化水稻的基因组中。
[0119] 4-2.所沭被插入基闵的插入冈域分析
[0120] 为验证所述白藜芦醇合酶基因在本发明实施例3中制得的用于生物合成白藜芦 的转化水稻的基因组中的位置，在用限制酶处理后连接一转接子，此后进行PCR。通过测序 对PCR产物进行分析和证实。
[0121] 详细的，从实施例3生产的转化水稻分离基因组DNA并用限制酶进行处理。在37°C 下与HaeIII限制酶反应4小时之后，连接一转接子（tccctttagtgagggtaaattg)，然后进行 PCR反应。
[0122] PCR反应如下进行，94°C下初始变性2分钟；然后，94°C下变性20秒，64°C下退火 20秒，72°C下扩增50秒，如此循环35次；最后，72°C下终极扩增7分钟。测序采用LI-COR 公司（美国）的DNA测序仪4200进行，并使用水稻中存在的T7和SP6引物。
[0123] 因此，所述水稻的带线，已证实有白藜芦醇合酶基因插入至水稻的第12号染色体 中，被选为本发明的所述的转化（白藜芦醇强化转基因）水稻。
[0124] 4-3.被插入基闵的结构分析和相邻核苷酸序列测宙
[0125] 为证实所述被插入基因在所述基因组DNA中的插入区域和关于本发明实施例3制 得的用于生物合成白藜芦醇的转化水稻的所述插入区域相邻的核苷酸序列，对一侧翼DNA 序列进行分析。对两个T-DNA插入至本发明所述的转化水稻这一事实进行了分析。同时， 对相邻的核苷酸序列和被插入的T-DNA的结构进行了分析。总之，证实了，两个T-DNA是以 彼此相反的方向插入至水稻第12号染色体的同一位置。
[0126] 将本发明所述的用于生物合成白藜芦醇的转化水稻中引入的T-DNA插入区域相 邻的区域与NCBI所公开的日本晴的序列数据相比，其中日本晴是与本发明使用的东津稻 在序列上具有相似性且具有完整的序列分析的粳稻，比较显示第一个T-DNA插入至NCBI披 露的日本晴序列（NCBI登录号No. NC_008405)的第12号染色体的第330872个碱基位，随 后是第二个T-DNA在相反方向的插入。详细的，证实了，第12号染色体的第330871个碱基 和所述第一个T-DNA的插入起始区（左边缘）是相连接的，所述第二个T-DNA的插入起始 区（左边缘）是与同一条染色体的第330908个碱基相连。总之，证实了所述两个T-DNAs 是以反向相连的单个结构被插入至本发明所述的转化水稻的第12号染色体中（图Ib)。
[0127] 发现所分析的相邻核苷酸序列是一个由SEQ ID N0:7表示的核酸序列。特别是， 本发明的所述白藜芦醇合酶基因已证实是被插入至SEQ ID NO: 7的第572个碱基之后。因 此，分析了两个T-DNA是被连续的插入和连接至SEQ ID NO: 7的第572个碱基和第609个 喊基。
[0128] 这样，所述的转化水稻种子被命名为白藜芦醇强化水稻且于2013年12月5日被 存至韩国生物科学与生物技术研究所生物资源中心的登录号KCTC12529BP之下。
[0129] 实施例5.转化水稻的白藜芦醇牛物合成分析
[0130] 通过HPLC分析证实了实施例3所生产的转化水稻中是否确实合成了白藜芦醇。
[0131] 详细的，对T5代转化水稻的糙米种子进行磨碎，将600毫克的粉末放入一 2毫升 管，随后加入30%甲醇600 μ L。将混合物在45°C下以150RPM的速度搅拌50分钟，从而提 取白藜芦醇。在4°C，1000 Og转速的条件下离心5分钟，上清液通过0. 2 μ m膜滤器过滤，并 用高效液相色谱（HPLC)分析。将（Waters2695,爱尔兰）Waters和Xterra RP18联用，采用 5 μΜ 4. 6mm X 250mm柱（Waters，爱尔兰）进行HPLC分析，并采用水和乙腈作为溶剂用于 梯度条件。
[0132] 建立和分析的梯度条件为0至5分钟时水和乙腈的比率为90:10 (v/v)，5至65分 钟时水和乙腈的比率为70:30 (v/v)。分析进行通过注入10 μ L的提取物并以lmL/min的流 量和UV308nm的波长进行测量。结合紫外光谱和标准物质的保留时间来估计白藜芦醇以及 白藜芦醇与糖苷，白藜芦醇苷（白藜芦醇-3-0-葡萄糖苷）的复合物的峰。
[0133] 分析结果证实，本发明实施例3生产的所述转化水稻包含高浓度的白藜芦醇和白 藜芦醇苷。
[0134] 实施例6.白藜芦醇合成水稻的牛长和取决于收获的条件的白藜芦醇浓度的差异
[0135] 实施例6-1.田间栽培条件下依据水稻務栽时间的水稻牛长特件
[0136] 所述本发明的白藜芦醇合成水稻在田间栽培条件下分别移栽于6月1日，15日，和 30日，结果表明，6月1日，15日，和30日的水稻移植后，其主茎叶片的生长终止分别发生 在每一次移植后的75. 1天，65. 1天，55. 1天，此时的积温分别是1886°C，1688°C和1474°C。 这里，成熟叶子数量分别为13.0,11. 6,和11. 2,且与典型的中晚熟品种相比，在6月1日移 植的水稻抽穗期表现了推迟4天到5天的趋势（图11)。
[0137] 因此，在6月1日，15日，和30日移栽的水稻抽穗期开始于8月22日，8月27日， 和8月31日。因此，看出延迟插秧情况下的抽穗特征是很大可能不完全成熟。
[0138] 实施例6-2.高淵培育条件（淵宰）下依据水稻務栽日期的水稻牛长特征
[0139] 在高温条件下，相比于田间培养条件下于6月1日移植的水稻（于8月22日抽 穗），本发明所述的白藜芦醇合成水稻随温度的升高，其抽穗期越早。因此，在温度升高 3. 5°C的条件下，抽穗期提前了 5天。
[0140] 表 1
[0141] 在高温培养条件下抽穗期的变化
[0143] 如表1中所示，于6月15日移栽的水稻抽穗期比田间栽培条件下提前2天，即是8 月27日，于6月30日移栽的水稻抽穗期比田间栽培条件下提前1天，即8月31日。因此， 相比于6月1日的水稻移植，温度升高对于缩短水稻生长的作用随水稻移栽日期的推迟而 下降。
[0144] 实施例6-3.水稻产量依据水稻務棺日期和高淵条件的夺化
[0145] 测量了依据本发明的白藜芦醇合成水稻的水稻移植日期和高温条件下水稻产量 的变化。
[0146] 表 2
[0147] 水稻产量依据水稻移植日期和高温条件的变化
[0148]
[0149] 如表2所示，在2010年，与平均年相比，由于在成熟期中日照时间不足，且在成熟 期后期急剧降温，在6月1日移植的水稻产量最高，为520kg/10a。然而，随水稻移植日期的 推迟，水稻产量降低。
[0150] 对于6月1日水稻移植来说，其表现了较为提前的抽穗期，随着温度的升高，水稻 产量急剧下降，且在温升为3. 5°C的条件下，水稻产量是很低的，为217kg/10a。
[0151] 水稻移植日期的推迟，由于温度增加导致水稻产量的减少是比较小的，且水稻产 量在温升为1.4°C的条件下是最高的。对于6月1日的水稻移植来说，产量构成因素中对在 升温条件下产量减少具有最大的影响的是成熟期，且当温度升高，成熟率明显降低。
[0152] 实施例6-4.依据水稻務棺日期的水稻产量和白藜芦醇含量的夺化
[0153] 依据本发明的白藜芦醇合成水稻的水稻移植日期，测量了白藜芦醇含量的变化。
[0154] 随着水稻移植日期的推迟，白藜芦醇含量升高，6月15日移植的水稻表现了最高 的水稻产量和最高的白藜芦醇含量（图12)。
[0155] 实施仿Il · 6_5依丰居7k禾替H才直曰其月、栽士咅温.度矛口?|女获曰其月的白薬芦酉享矛口白薬芦酉享# 含量的夺化
[0156] 依据本发明的白藜芦醇合成水稻的水稻移植日期、栽培温度和收获日期，测量了 白藜芦醇和白藜芦醇苷含量的变化。
[0157] 表 3
[0158] 依据水稻移植日期、栽培温度和收获日期的种子（精米）中白藜芦醇含量的变化
[0161] 表 4
[0162] 依据水稻移植日期、栽培温度和收获日期的植物体中白藜芦醇苷含量的变化
[0165] 如表3所示，随着水稻移植日期的推迟，白藜芦醇含量增加，且在相同的水稻移植 条件下，当高温应力处理时白藜芦醇含量增加。抽穗40天后收获的这一组，具有整体较高 的白藜芦醇含量。
[0166] 此外，如表4所示，白藜芦醇苷是白藜芦醇苷水稻的糖苷形式，且随成熟的进程， 叶片中的白藜芦醇苷的含量逐渐降低。然而，当水稻移植日期被推迟从而导致延迟成熟或 在高温条件下发生成熟，叶片中白藜芦醇苷含量趋于变高。这被确定为是由于高热应激下 植保素的影响。
[0167] 实施例6-6.种子中白藜芦醇含量依据收获时间的夺化
[0168] 测量了本发明所述白藜芦醇合成水稻种子（糙米）中白藜芦醇含量依据收获时间 的变化。
[0169] 如图13所示，在成熟期高温条件下种子中白藜芦醇含量增加，并在温升大于等于 2°C的条件，白藜芦醇含量相比于田间栽培条件增加20%。
[0170] 对于6月1日和6月15日的水稻移植，高温条件下白藜芦醇的增加表现出相似的 趋势，但是6月30日的水稻移植随温度的升高，白藜芦醇急剧增加。
[0171] 实施例6-7.依据实际冈域间的差异的牛长特征
[0172] 为了研究本发明的白藜芦醇合成水稻的农业特点，对本发明的白藜芦醇合成水稻 和作为母种和比较品种的转化东津稻的农业的特点进行测验。
[0173] 详细的，东津稻，常规转化水稻（转化水稻中两拷贝数白藜芦醇合酶基因被反向 插入至天然水稻的第4号染色体），和本发明所述的白藜芦醇强化转基因水稻被栽培在隔 离的田中，种植间隔为30cmX 15cm，每块培土3株苗，通过3个周期的随机分组设计，在3个 不同的区域益山、水原和密阳中种植。测量了生长特征和数量。
[0174] 表 5
[0175] 区域主要生长特征和水稻的产量构成
[0176]
[0177] 如表5所示，虽然益山和密阳区域在生长特性和数量上显示出类似的结果，但与 益山区的实验组相比，在水原种植的所有的实验组显示出延迟抽穗和高度降低12厘米或 更多。由于减少了穗，每穗粒数，和成熟率，水稻产量与益山相比减少约12%。相比于对照 组，东津稻、益山、水原和密阳全部显示出相同趋势的产量指数。
[0178] 此外，通过上述方法收获和捣碎在隔离田中栽培的种子，并分析了精米中的白藜 芦醇含量。
[0179] 表 6
[0180] 白藜芦醇和白藜芦醇苷的含量分析
[0181]
[0182] 如表6所示，证实了 I. 40 μ g/g和2. 01 μ g/g的白藜芦醇分别在常规转化水稻和 本发明的白藜芦醇强化转基因水稻中被合成。
[0183] 将东津稻，常规转化水稻（转化水稻中两拷贝数的白藜芦醇合酶基因被反向插入 至天然水稻的第4号染色体），和本发明所述的白藜芦醇强化转基因水稻的3个周期的样品 种植于3个不同的区域，益山、水原和密阳，并被捣碎和生产为精米，随后通过高效液相色 谱分析分析白藜芦醇的含量。<