8 x 8网格。每个板的第9th和第10th列完全不接受 抗微生物剂，只接受介质，分别作为阳性和阴性生长对照。在构造所述的棋盘微孔板后，接 种植物乳杆菌，在37°C培养，并按MIC法所述的方法评分。图1给出了棋盘微孔板。 实施例1 :二氧化氯与啤酒花酸和柠檬酸的协同性
[0089] 在pH 5的条件下用上述方法以植物乳杆菌作为测试微生物确定了二氧化氯、啤 酒花酸和柠檬酸的最小抑制浓度。如上述构造了三元协同板，接种的孔的最终浓度为~5x 10 5cfu/ml，培养18-24小时，然后视觉评价生长/不生长。根据Kull等人所述的改动公式 计算协同指数。该实施例证实了组合二氧化氯、啤酒花酸和柠檬酸的效果大于任何抗微生 物剂单独的效果。抑制细菌生长所需二氧化氯的量从54ppm被降低至2. 75-40ppm。啤酒花 酸的浓度从5ppm降至0? 625-2. 5ppm的范围，且梓檬酸从6, 250ppm降至78_1250ppm。
实施例2 :发酵实验室数据
[0090] 在国家玉米-到-乙醇研究中心利用二氧化氯、啤酒花酸提取物和柠檬酸进行了 评估。测试的样品及它们的浓度可见图2和表2。进行所述测试评估了三元抗微生物剂对在 类似于燃料乙醇工业中所用条件下生产的玉米醪中生产乙醇的效果进行了评估。对两个具 体效果进行了调查：（1)抗微生物剂影响乙醇产率及乳酸菌污染发酵中糖转化率的能力， 和（2)相比于对照无细菌发酵，抗微生物剂控制细菌感染的能力。为每个处理和对照（接 种和未接种）都制备了三个160克玉米面浆料、水和酶（30% w/w干固体）。将所述浆料在 83 °C培养90分钟，然后接种植物乳杆菌。随后，计量抗微生物剂到所述浆料中。设备计量二 氧化氯、啤酒花酸提取物和柠檬酸到250-mL三角烧瓶中，在加入抗微生物剂后的15、30、和 60分钟收集样品。收集3个时间点样品后，通过加入300 y 1 5N的硫酸调节所述醪的pH至 〈5.2。所有的酶、养分、和加入到发酵瓶中的其它补充物都是使用前新鲜制备的。加入尿素 的无菌0. 2g/ml溶液，基于尿素的氮含量（w/w，基于醪的总质量）使最终浓度为500ppm(w/ w)。制备葡糖淀粉酶（Spirizyme Excel, Novozymes)的 0? 25g/ml 溶液，并以 0? 066%的计 量（w/w，基于玉米的湿重）加入。加入无菌水以均衡每个处理的总固体含量。所有的发酵 瓶都接种〇.2g/ml的酵母（酿酒酵母）悬浮液。在接种到所述发酵瓶中前，将该悬浮液在 40°C培养并混合30分钟。每个发酵瓶都接种170 y 1所述酵母悬浮液以达到lxlO7酵母细 胞/ml的起始浓度。所有添加完成后记录每个烧瓶的质量，然后将消毒的发酵阱插入到每 个烧瓶中并重新称重。将烧瓶在培养器/振荡器中在32°C和170rpm震荡下培养共64小 时。在3-天的培养中，通过定期（在接种酵母后的0、17.5、22.5、42.5、48和64小时）称 量发酵瓶监测发酵的进展。在发酵终点利用HPLC测量底物（葡萄糖、DP2、DP3、和DP4+，其 中"DPx"代表有"x"个亚单元的葡萄糖低聚物）和产物（乙醇、甘油、乳酸、和乙酸）的浓 度。HPLC样品的制备是通过离心除去大的固体，然后用0. 45-y m注射器过滤器过滤，并通 过添加硫酸酸化pH至约为2使最终浓度为0. 01N。在培养64小时后，测量所述最终pH、干 固体和溶解干固体的总体浓度、及啤酒滤液的密度。将每个烧瓶的样品铺板用于菌落计数。 表2
[0091] 该实施例表明在发酵过程中，5ppm的二氧化氯与5ppm的啤酒花酸及200ppm的梓 檬酸的组合可以有效地减少细菌，在看到实验室MIC和协同数据后，其数量是出乎意料的 低。
[0092] 图3和表3给出了未感染对照和三个样品在发酵后的平均乙醇产率。利用AN0VA， 没有观察到所有处理例（P = 〇. 769)间平均乙醇产率的显著不同。在图3和表3中，数据 代表三次独立复制发酵瓶的平均值。 表3 _
【主权项】
1. 含水组合物，包括： a) 二氧化氯， b) 啤酒花酸，和 c) 至少一种有机酸或它们的盐， 其中二氧化氯的浓度至少为Ippm或5ppm或15ppm，其中啤酒花酸的浓度至少为 0. 5ppm或lppm，及其中所述至少一种有机酸的浓度至少为50ppm或75ppm或lOOppm。2. 含水组合物，包括： (a) 二氧化氯，和 (b) 至少一种第一有机酸或它的盐，和 (c) 至少一种第二有机酸或它的盐， 其中二氧化氯的浓度至少为Ippm或5ppm或15ppm，其中所述第一有机酸和第二有机酸 的浓度之和至少为50ppm或75ppm或lOOppm。3. 权利要求1的组合物，其中至少一种啤酒花酸选自P酸化合物、a酸、异构化的a 酸、P异构化的a酸、四异构化的a酸、六异构化的a酸和啤酒花叶或其组合。4. 权利要求1-3之一的组合物，其中所述至少一种有机酸或所述至少一种第一有机酸 选自柠檬酸、丙酸、苯甲酸、或它们的盐及其组合。5. 权利要求1-3之一的组合物，其中所述至少一种有机酸或所述至少一种第一有机酸 包括柠檬酸或它的盐。6. 权利要求1的组合物，其中二氧化氯对有机酸的比例为1:1至1:15, 000、或1:1至 1:10, 000、或 1:1 至 1:2000、或 1:1 至 1:1000、或 1:4 至 1:10, 000、或 1:4 至 1:2000、或 1:4 至 1:1000、或 1:20 至 1:100。7. 权利要求2的组合物，其中二氧化氯对所述第一有机酸和第二有机酸之和以ppm为 单位的比例为 1:1 至 1:15, 000、或 1:1 至 1:10, 000、或 1:1 至 1:2000、或 1:1 至 1:1000、或 1:4 至 1:10, 000 或 1:4 至 1:2000、或 1:4 至 1:1000、或 1:20 至 1:100。 8?权利要求1和3-6之一的组合物，其中二氧化氯的浓度至少是l-50ppm或5-10ppm， 啤酒花酸的浓度至少是〇? 5-20ppm或5-10ppm，及所述至少一种有机酸的浓度至少是 50-5000ppm 或 100-500ppm。9. 权利要求2-5和7之一的组合物，其中所述至少一种第一有机酸是柠檬酸，所述至少 一种第二有机酸选自丙酸、苯甲酸或它们的盐及其组合。10. 控制在水体系中不想要的微生物浓度的方法，该方法包括步骤： (a) 将二氧化氯引入到水体系中， (b) 将有机酸引入到该水体系中， (c) 将啤酒花酸引入到该水体系中， 其中所述有机酸选自柠檬酸、丙酸、苯甲酸及它们的盐，二氧化氯在被处理水体系中的 浓度至少为lppm，且二氧化氯对有机酸的比例为1:1-1:64, 000。11. 控制在发酵过程所用水体系中不想要的微生物浓度的方法，该方法包括步骤： (a) 将可发酵的碳水化合物引入到水溶液中； (b) 将至少一种酵母引入到所述的溶液中； (c) 将二氧化氯引入到水体系中， (d) 将有机酸引入到所述水体系中， (e) 将啤酒花酸引入到所述水体系中， 其中在被处理水体系中二氧化氯的浓度至少为lppm。12. 控制水体系中不想要的微生物的方法，该方法包括步骤： (a) 将二氧化氯引入到水体系中， (b) 将至少一种第一有机酸引入到所述水体系中， c)将至少一种第二有机酸引入到所述水体系中， 其中所述第一有机酸选自于由柠檬酸、丙酸、苯甲酸及它们的盐所组成的组中，和其 中在被处理水体系中二氧化氯的浓度至少为IP P m，且二氧化氯对有机酸总量的比例为 1:1-1:64, 000〇13. 控制在发酵过程所用水体系中不想要的微生物浓度的方法，该方法包括步骤： (a) 将可发酵的碳水化合物引入到水溶液中； (b) 将至少一种酵母引入到所述溶液中； (c) 将二氧化氯引入到水体系中， (d) 将至少一种第一有机酸引入到所述水体系中， (e) 将至少一种第二有机酸引入到所述水体系中， 其中在被处理水体系中二氧化氯的浓度至少为lppm。14. 权利要求10-13之一的方法，其中在被处理体系中二氧化氯的浓度至少为lOppm。15. 权利要求10-13之一的方法，其中在被处理水体系中二氧化氯的浓度为l-50ppm或 5-10ppm〇16. 权利要求10-15之一的方法，其中所述至少一种有机酸或所述至少一种第一有机 酸包括柠檬酸或它的盐，且二氧化氯对至少一种有机酸或者所述至少一种第一有机酸和至 少一种第二有机酸之和以ppm为单位的比例为1:1-1:1000。17. 权利要求10或15的方法，其中所述至少一种有机酸或所述至少一种第一有机酸包 括丙酸或它的盐，且二氧化氯对至少一种有机酸或者所述至少一种第一有机酸和至少一种 第二有机酸之和以ppm为单位的比例为1:1-1:1000。18. 权利要求10-15之一的方法，其中所述至少一种有机酸或所述至少一种第一有机 酸包括柠檬酸或它的盐。19. 权利要求10或11的方法，其中所述至少一种有机酸是苯甲酸或它的盐，且二氧化 氯对苯甲酸的比例为1:1-1:32, 000,及二氧化氯在所述组合物中的浓度是l-50ppm，更优 选组合物具有5-IOppm的二氧化氯。20. 权利要求16或17的方法，其中二氧化氯对至少一种有机酸或所述至少一种第一有 机酸和至少一种第二有机酸之和的比例为1:4-1:1000。
【专利摘要】本发明提供了用抗微生物剂的协同相互作用控制细菌污染的方法。本发明包括二氧化氯与有机酸的组合，其组合的抗微生物效果大于它们单独活性之和，即协同性。
【IPC分类】A01N59/00, A01P3/00, A01P1/00, C12P7/06, A01N65/08
【公开号】CN105120669
【申请号】CN201480014736
【发明人】J·S·查普曼, C·E·科恩萨洛
【申请人】索理思科技开曼公司
【公开日】2015年12月2日
【申请日】2014年3月14日
【公告号】CA2901153A1, US20140335204, WO2014152683A1