专利名称：：等效竞争多聚酶链反应内参照、制备方法及其应用的制作方法
技术领域：
：本发明涉及病毒基因检测
技术领域：
，具体地讲是把一种病毒基因的一部分进行突变，获得的突变基因片段与拟检测的目的片段等长，以此充当竞争多聚酶链反应(PCR)的内参照，在PCR过程中内参照与目的片段等效扩增，可用于各种病毒基因的PCR定量检测。PCR法是基因诊断技术中敏感度最高的一种方法，一开始用于定性检测，后来扩展到定量检测。经过多年的研究表明，采用PCR技术进行定量检测，必须是竞争PCR法，也就是说必须设置内参照，否则其定量结果不仅无法标准化，而且很不精确。所以内参照已成为PCR定量技术的关键成分。制备竞争PCR内参照(突变模板)应注意的两个最基本的问题是①最大限度地保证在PCR过程中突变模板与野生模板的等效扩增；②简便而能精确地对产物中的突变片段和野生片段进行鉴定分析。目前有文献报告的最常用的方法有三种加长法、截短法和加酶切位点法(DiviaccoS，NorioP，ZentilinL，etalGene1992；1223013，ClementiM，ManzoS，BagnareliP，etalPCRMethodsAppl1993；2191，WuJ，SullivanDEandGerberMAJVirolMethods1994；49331)。加长和截短法所制备的突变模板，虽然在PCR产物分析时具有直观、简便的优点，但由于突变模板是在野生模板序列的基础上加长或缩短，和野生模板在长度上的差异明显，无法保证两者扩增效率的一致，影响竞争PCR定量分析精确度；加酶切位点法所制备的内参照与目的片段等长，可以保证两者等效扩增，但该方法有两个缺陷第一，选择或增加合适的酶切位点有较高的难度，实际应用时受到一定限制；第二，如不能保证对内参照扩增产物的完全酶切，则会降低产物分析的精确度。1993年，Jalava等报告，把用于扩增目的片段的上下游引物的互补序列分别加在一段异源DNA片段的两侧，再用这对引物作PCR后，亦得到与野生模板等长的突变片段(JalavaT，LehtovaaraP，KallioABioTechniques1993；1134)。该方法仍有不足制备方法繁琐；所选择的异源片段序列的G+C含量与目的基因片段比较，不可避免地有一定差异，因而也可导致两种片段扩增效率的差别。有人采用化学合成法制备100bp左右、与野生片段等长的突变内参照(GerlichWH，HeermannKH，ThomssenRViralHepRev1995；153)，并引入产物杂交定量分析，比前述方法均有重大进步，但目前人工合成100nt长的寡核苷酸在技术上仍存在较大困难，仅为数甚少的实验室可以为之，况且由于产量很低而成本太高。另外，必须合成两条互补的寡核苷酸，并经过杂交成为双链DNA后才可用作内参照，不仅费用更高，而且制备过程复杂。为此，本发明的目的是提供一种等效竞争PCR内参照，它是一种突变片段。本发明的另一目的是提供该内参照的制备方法，是通过用突变引物和目的基因的下游引物，进行PCR制得。本发明的又一目的是提供该内参照的应用，用于病毒基因的定量检测。一、本发明提供一种在竞争PCR中能与目的基因等效扩增的内参照，它是一种与目的片段长度相等且A、C、T、G含量相同的突变片段，在第21-70位是突变部分，除突变部分的碱基序列与目的片段不同外，其余部位都与目的片段相同。二、本发明提供等效竞争PCR内参照的制备方法，它包括下列步骤1、突变引物的设计选择拟定量检测的病原体的保守区域序列作为目的基因，并根据目的基因的序列及其在基因组中的位置设计突变引物。突变引物由三个部分组成，即PCR上游引物序列，突变序列和连接序列。突变引物长40-80个碱基。突变序列在第21-70位碱基，突变形式是随机地改变突变部分的碱基顺序，但碱基A、C、T、G的绝对数目不变，突变序列长度为10-50个碱基，突变序列的Tm值，形成发夹结构和引物二聚体的能量值，均与原目的基因序列相同。2、突变片段的制备通过用突变引物和目的基因的下游引物，以目的基因为模板，进行PCR所得产物突变片段即是内参照。这个突变片段与拟检测的目的片段(或称野生片段)的差别就在于第21-70位碱基序列，其它部位尤其是两端的引物结合区完全相同，从而可以保证在作竞争PCR时两种片段的扩增效率完全一致。3、突变片段的克隆与鉴定a、克隆克隆的目的有二第一，将突变片段插入一定的载体，得到含突变片段的质粒，从而可以在大肠杆菌内大量复制，成为内参照的原料来源；第二，含突变片段的质粒系环状，且大小与待检测的病毒基因组相似，因而更符合内参照的要求，克隆方法是采用PCR产物TA克隆法，即应用PCR克隆试剂盒，将新扩增的突变片段直接克隆至载体中。挑选的阳性克隆作进一步鉴定。b、鉴定目的是证实突变片段是否已成功地插入了载体，同时还要证实突变序列的碱基序列是否与设计要求一致。方法如下(1)PCR法另合成了一根引物，其序列与突变引物的第1-20位碱基相同，将其与下游引物一起，对阳性克隆质粒DNA行PCR，扩增阳性者再作进一步鉴定。(2)DNA序列分析取PCR扩增阳性的质粒DNA，对克隆片段作序列分析。保留序列正确的克隆。三、本发明等效竞争PCR内参照应用于定量检测病毒基因利用本发明所制备的内参照，建立了竞争PCR及其产物酶联杂交技术，以定量检测病毒基因。检测包括两个部分第一，竞争PCR，在同一反应管内含有待测目的基因和内参照，进行多聚酶链反应；第二，酶联杂交，以一种微孔反应板作为固相载体，进行酶联杂交反应。该检测可以达到三个目的①区分扩增后的野生片段和内参照片段；②分别对上述两种片段定量；③进一步提高基因检测的精确度和灵敏度。本发明的优点与常用的加长法、截短法及加酶切位点法制备竞争PCR内参照技术相比，本发明有以下优点第一，制备方法的优势在目的片段上选择理想的扩增区域，并设计合适的突变引物，将突变引物与另一根配对引物及目的基因一起作一轮PCR即可获得突变片段，与目前所有报道方法相比，这种方法最简单、方便、易行。第二，完全等效扩增突变片段的长度和A、T、C、G组成均与野生片段完全相同，因此可以保证两种模板在PCR过程中等效扩增，提高了定量分析的精确度。第三，为竞争PCR产物的杂交检测提供了最佳条件突变片段的第21-70位突变后的突变序列，是突变片段特异的杂交位点，而且这个杂交位点的所有杂交参数均与拟扩增的目的片段的相应部分相同，因此可在此基础上建立竞争PCR产物的酶联杂交定量分析方法。与人工化学合成等长DNA内参照相比，在应用原理方面有相同的特点，即既能保证与野生片段等效扩增，又可在杂交检测过程中与野生片段区分，但在制备方法上则比之更简单、易行和经济，任何一个具有最基本的分子生物学实验条件的实验室均能实施。以下以HBV基因为目的基因为例结合附图和实施例作进一步阐述，但并不限止本发明的范围。图1．突变引物的结构示意图上行HBV基因第2278-2333位序列，其中第2299-2318位(黑线框内)为拟突变区域下行突变引物序列，长度为56nt，红线框内为突变序列图2．突变片段制备过程示意图1．PCR反应管内加入突变引物、下游引物、野生模板等；2．双链模板变性解链后突变引物和下游引物退火、延伸；3．第1个PCR循环后形成2个新的片段，一个为突变片段，另一个为野生片段；4．进入第2个PCR循环；5．第2个PCR循环后形成3个突变片段和1个野生片段；6．经过30～40个循环后，产物呈指数级放大，突变片段占绝大多数，极少量为野生片段(可忽略)。图3．突变片段MS299与TA克隆载体pCR2．1重组示意图实施例1．用突变引物制备突变片段(内参照)一、突变引物的设计与合成HBV基因组的S基因系保守区，故在该区选择待扩增片段。采用电子计算机核酸序列分析软件HYBsimulatorVersion4．0(购自美国ACGT公司)进行设计。要求待扩增片段(野生片段)满足以下条件①长度为100-500bp；②第1-20位碱基和第21-40位碱基序列分别严格地符合引物和探针设计要求(包括Tm值、G+C含量、重复碱基数、形成发夹结构和引物二聚体的能量值等等)；③第41-56位碱基较严格地符合引物设计条件。拟扩增片段选定以后，分别列出第21-40位4种碱基(A、T、C、G)的数目，按每种碱基的绝对数随机组合成多个20nt的寡核苷酸序列，把这些序列输入电子计算机，用核酸序列分析软件进行分析，选出一至数个序列(称之为突变序列)，其Tm值、形成发夹结构和引物二聚体的能量值，均与野生片段第21-40位碱基序列相等或非常接近。取第1-56位野生片段序列，将其中的第21-40位碱基序列置换为突变序列(这段突变序列就是PCR产物杂交时的杂交位点)即构成突变引物。用这个引物与另一条下游引物去扩增HBV基因组，就可以得到本发明需要的突变片段，用作内参照。针对HBV基因S区设计的的突变引物(Pm)序列(56nt)包含了三个部分(图1)第一部分(20nt)与竞争PCR上游引物序列相同，位于5′端；第二部分为突变序列(20nt)，位于中间；第三部分为连接引物(16nt)，位于3′端，与待扩增片段负链的第41-56位碱基互补。依靠这段起连接作用的引物，才有可能使突变引物与HBV基因退火，完成PCR的过程，得到突变片段，见图2。二、制备突变片段(一)主要材料1．乙型肝炎病毒(adr型)质粒DNA由adr型HBV全基因经BamHI酶切后克隆至pBR322载体。质粒由第二军医大学分子生物学教研室胡为江博士惠赠。2．突变引物(Pm，56nt)由上海生工工程公司合成并用PAGE法纯化，序列见图1。3．常规PCR扩增引物上游引物(Pu，20nt)序列5′-GTTGCCCGTTTGTCCTCTAC-3′；下游引物(Pd，22nt)序列如下5′-GCCCCCAATACCACATCATC-3′。4．PCR缓冲液、Taq酶及底物等均为常规试剂，购自上海华美生物工程公司和上海生工工程公司。(二)PCR扩增突变片段取一只0．2ml薄壁PCR反应管，按下述配方加样成份加样量(μl)10×缓冲液515mmol／LMgCl25dNTP混合液(各10mmol／L)2Pm(25μmol／L)1Pd(25μmol／L)1HBVDNA质粒(μg/L)1TaqDNA聚合酶(1u／μl)1双蒸馏水34PCR扩增参数94℃5分钟；94℃1分钟、55℃30秒钟、72℃30秒钟，共35个循环；再72℃延伸5分钟。(三)PCR产物分析采用琼脂糖凝胶电泳法将PCR产物上样于1．5％琼脂糖凝胶，电泳后溴化乙锭染色，紫外光下观察，扩增所得片段长度为300bp左右，且无其他杂带，与推测的结果一致，即初步确认为突变片段，可进行克隆。三、PCR产物(突变片段)的克隆与鉴定(一)克隆1．主要材料①TA克隆载体pCR2．1载体，25ng／μl；T4DNA连接酶(4．0Weiss单位／μl)及缓冲液(购自COLONTECH公司)，②大肠杆菌DH5α株(本实验室保存)。2．操作过程如下(1)在0．5mlEppendorf管中依次加入新鲜PCR突变片段产物3μl10×连接缓冲液1μlPCR2．1载体1μl双蒸水4μlT4DNA连接酶1μ总量10μl，混匀，置反应管于14℃过夜；(2)按常规制备DH5α钙化菌；(3)将连接物加入100μl钙化菌中，4℃放置1小时，42℃水浴90秒；(4)加入LB培养基400μl，37℃恒温摇床缓慢振摇1小时；(5)离心，4000rpm，3分钟。吸取上清，留存液约50μl，加20μlIPTG(100mmol／L)，5μlX-Gal(40mg／ml)，轻轻吸打管底，使细菌充分悬浮；(6)将菌液涂布于含氨苄青霉素(50μg／ml)的固体LB-琼脂培养板，置37℃培养过夜；(7)挑取白色菌落，接种于含100μg／ml氨苄青霉素的5mlLB培养基中，在37℃恒温箱中，振摇(250转／分)；(8)细菌生长至对数后期收集细菌，用分离柱提取和纯化质粒DNA；(9)分别用EcoRⅠ单酶切及BamHⅠ加XbaⅠ双酶切，再进行琼脂糖凝胶电泳，以初步筛选阳性克隆。内参照片段插入载体的示意图见图3(二)鉴定阳性克隆用PCR初步鉴定并进一步作序列分析。1．PCR反应体系配方成份加样量(μl)10×缓冲液515mmol／LMgCl25dNTP混合液(各10mmol／L)2Pu(25μmol／L)1Pd(25μmol／L)1阳性克隆质粒(μg／l)1TaqDNA聚合酶(1u／μl)1双蒸馏水34PCR扩增参数94℃5分钟；94℃1分钟、56℃30秒钟、72℃30秒钟，共35个循环；再72℃延伸5分钟。产物上样于2％琼脂糖凝胶，电泳并用溴化乙锭染色后确认扩增片段为300bp左右，留待进一步鉴定。2．序列分析自动测序法，测得扩增产物位于HBVS基因区第2278-2576位，片段长299bp。留存读序正确的克隆，将其中一株命名为PCR2．1-MS299。四、重组质粒PCR2．1-MS299的扩增、纯化和定量取重组质粒PCR2．1-MS299再次转化DH5α大肠杆菌，以大量扩增该质粒，用质粒DNA分离柱(购自上海华舜生物工程公司，按说明书操作)纯化后再用酚-氯仿抽提一次(常规方法)。纯化品分别用琼脂糖凝胶电泳和紫外分光法定量。实施例2．竞争PCR扩增实验一、引物设计与合成上游引物序列为Pu，下游引物的序列为Pd(同实施例1)，但在5′端用生物素修饰，命名为Pb。引物合成与修饰由上海生工生物工程公司提供服务。二、制备HBVDNA标准品(一)HBVDNA质粒扩增和纯化在本实验室按常规进行扩增，采用柱分离加酚氯仿抽提法纯化。(二)质粒鉴定和定量采用琼脂糖凝胶电泳与定量标准品对比法及紫外分光光度计法。三、竞争PCR取10只0．2ml薄壁PCR反应管，首先按下述配方加样成分加样量(μl)10×缓冲液515mmol／LMgCl25DNTP混合液(各10mmol／L)2Pu(25μmol／L)1Pb(25μmol／L)1TaqDNA聚合酶(1u／μl)1双蒸馏水33然后加入pADR-1DNA和PCR2．1-MS299各1μl，加样量如下表(表1)表1．10支反应管内pADR-1DNA和PCR2．1-MS299的加样量<tablesid="table1"num="001"><table>管号12345678910pADR-1DNA(fM／管)PCR2．1-MS299(fM／管)10-310-310-310-410-310-510-410-310-410-410-410-510-510-310-510-410-510-500</table></tables>PCR扩增条件94℃5分钟；94℃30秒、55℃30秒、72℃45秒，共35个循环；再72℃延伸5分钟。扩增所得产物经琼脂糖凝胶电泳证实存在目的条带，再行产物杂交鉴定和定量。实施例3．酶联杂交法检测HBV基因竞争PCR扩增产物一、主要材料(一)微量条排DNA杂交反应板CoyningCostar公司生产。(二)链亲和素-碱性磷酸酶复合物(Say-Ap)及底物对-硝基苯基磷酸二钠(pNPP)分别为Gibco公司和Merck公司产品。(三)探针设计与合成1．野生片段捕获探针(CPw)5’-端用氨基修饰。该探针与野生片段(检测HBV基因的目的片段)第21-40位碱基互补，序列如下5’-amine-TGAGACTAACCTCCGATTGA-3’。2．突变片段捕获探针(CPm)5’-端用氨基修饰，该探针与突变片段(内参照)正链突变序列的(第21-40位碱基)20个碱基互补，序列如下5’-amine-ACGTACTGAATAGCTGCTAC-3’。(四)缓冲液及配方1．结合缓冲液(Bb)50mmol／LNa2HPO4，1mmol／LEDTA，0．02％NaN3，pH8．52．20×SSC3mol／LNaCl，0．3mol／L枸缘酸钠。3．封闭液结合缓冲液中含3％BSA，0．1mg／ml鲑鱼精DNA，0．02％NaN3。4．2×杂交缓冲液10×SSC，0．2％N-lauroylsarcosine，0．1mg／ml鲑鱼精DNA，0．05％NaN3，2．0％BSA，0．04％SDS。5．马来酸盐缓冲液0．1mol／L顺丁烯二酸，0．15mol／LNaCl，pH7．5。6．Sav-Ap缓冲液马来酸盐缓冲液中含3％BSA，0．05％吐温-20，0．02％NaN3。7．洗涤液Ⅰ2×SSC，含0．1％SDS。8．洗涤液Ⅱ马来酸盐缓冲液中含0．05％吐温-20。9．AP底物(pNPP)缓冲液30mmol／L三乙醇胺，lmmol／LMgCl2。二、微反应板酶联杂交定量(一)包被用结合缓冲液(Bb)分别稀释捕获探针CPw和CPm，浓度为500nmol／L，取两份DNA微量条排反应板，分别加入稀释后的CPw和CPm，每孔100μl，封孔后置37℃水浴箱，1hr，或4℃过夜。(二)封闭弃去孔内包被物，每孔加200μl封闭液，置37℃水浴箱，30min，弃封闭液，拍干。(三)杂交将PCR产物用蒸馏水作10倍稀释，100℃解链5min后立即置冰浴；加等体积2倍杂交液后取50μl加入杂交孔内，置反应板于56℃水浴箱，30min；用洗液Ⅰ洗三次，每次56℃，5min，弃液拍干。(四)信号检测每孔加50μl1∶1000稀释的Sav-AP复合物；室温下放置20min，甩干，用洗液Ⅱ洗四次，每次37℃，3min；拍干后用pNPP底物显色；读取405nmOD值。三、竞争PCR及产物酶联杂交定量检测的结果表2显示不同浓度内参照模板和野生模板在九种不同组合时的PCR产物用酶联杂交检测的结果。结果表明，当内参照的量和质粒HBVDNA量相同时，ODm和ODw(ODm和ODw分别代表捕获探针CPm和CPw包被孔所测的OD值)的比值非常接近于1．0，与期望值相符。表2．内参照和野生模板不同浓度组合后PCR产物酶联杂交检测结果<tablesid="table2"num="002"><table>管号12345678910pADR-1DNA(fm／管)PCR2．1-MS299(fm／管)10-310-310-310-410-310-510-410-310-410-410-410-510-510-310-510-410-510-500ODm值ODw值ODm／ODw比值1．982．000．991．990．573．492．330．2111．100．462．110．221．661．601．041．720．295．930．542．140．250．661．690．391．671．591．050．030．04-</table></tables>四、HBV基因初始量的确定方法(公式法)按Clementi等(ClementiMetal．，PCRMethodsAppl1993；2191)介绍的竞争PCR产物量计算公式M／W=M′／W′(1)。公式中M和W分别代表突变模板(即内参照)和野生模板的初始量，M′和W′则分别为PCR产物中突变片段和目的基因片段量。公式(1)可改写为M／W=ODm／ODw(2)。等式(2)中，W是未知数，M是已知数，ODm值，即PCR产物在CPm探针包被孔杂交后的OD值，ODw是CPm探针包被孔杂交后的OD值。由于酶联反应后所得OD值不与产物加样量呈直线比例关系，只有在内参照和质粒HBVDNA初始量比较接近时，上述公式才成立，因此可通过制作标准曲线，或每分析一份待测标本使用3个以上内参照浓度管，从而比较精确地求得待测标本中HBVDNA含量。实施例4．竞争PCR及其产物酶联杂交定量检测血清中HBVDNA一、主要材料(一)血清标本共收集了30份HBsAg、HBeAg、抗HBcAg均阳性(即所谓“大三阳”)的血清标本，均来自慢性乙型肝炎患者。上述所有标本均PCR定性技术检测证实乙型肝炎病毒基因(HBVDNA)阳性。(二)PCR及酶联杂交用材料见实施例2、3。二、血清标本处理及扩增反应管的准备采用血清直接煮沸法，即将100μl置于0．5mlEppendorf管内，100℃煮沸5分钟，吸取5μl上清用作PCR模板。每份标本均设置3个扩增管，3管中所含内参照分别为10-5、10-3、10-1fmol／管，其他PCR试剂按常规加样，反应体积为50μl。三、扩增条件PCR扩增条件94℃5分钟；94℃30秒、55℃30秒、72℃45秒，共32个循环；再72℃延伸5分钟。扩增产物经琼脂糖凝胶电泳证实存在目的条带，再行产物杂交定量。四、微反应板酶联杂交方法见实施例3。五、定量检测结果30份标本经琼脂糖凝胶电泳分析均见分子量在300bp左右得阳性条带。取2μl作酶联杂交检测，并按照前述公式计算血清标本扩增前HBVDNA含量。结果，30例乙型肝炎患者血清HBVDNA含量分布高低不等，最高者达3×108拷贝／ml，最低者4×103拷贝／ml。上述结果表明，本发明所制备的内参照可用于竞争PCR及酶联杂交定量检测HBV基因，并有临床应用价值。权利要求1.一种等效竞争多聚酶链反应内参照，其特征在于是一种与目的片段长度相等且各碱基含量相同的突变片段，在第21-70位是突变序列，除突变部分的碱基序列与目的片段不同外，其余部位都与目的片段相同。2.权利要求1所述等效竞争多聚酶链反应内参照的制备方法，其特征在于包括下列步骤(1)选择目的基因的保守区域序列，设计突变引物；(2)通过用突变引物和目的基因的下游引物，以目的基因为模板，进行PCR，所得产物即是内参照。3.如权利要求2所述内参照的制备方法，其特征在于根据目的基因保守区片段的序列及其在基因组中的位置设计突变引物。4.如权利要求2或3所述内参照的制备方法，其特征在于所述突变引物由三个部分组成PCR上游引物序列、突变序列和连接序列。5.如权利要求2或3所述内参照的制备方法，其特征在于所述突变引物长40-80个碱基，突变序列在第21-70位碱基，随机地改变突变部分的碱基顺序，但各碱基的绝对数不变，突变序列的Tm值，形成发夹结构和引物二聚体的能量值，均与原目的基因序列相同。6.如权利要求4所述内参照的制备方法，其特征在于所述突变序列长度为10-50个碱基。7.权利要求1所述等效竞争多酶链内参照的应用，其特征在于所述内参照用于等效竞争PCR及PCR产物酶联杂交定量检测病毒基因。8.如权利要求7所述内参照的应用，其特征在于所述PCR产物酶联杂交定量检测时是以突变序列为杂交位点。全文摘要在竞争PCR中能与目的基因等效扩增的内参照,是一种与目的片段长度相等且各碱基含量相同的突变片段,在第21—70位是突变部分。通过用突变引物和目的基因的下游引物进行PCR获得的突变片段,即是内参照,可应用于等效竞争PCR及PCR产物酶链杂交定量检测病毒基因。由于突变片段的长度和碱基含量与目的片段相同,因此保证两种模板在PCR过程中等效扩增,提高了定量分析的精确度,且内参照的制备方法简单、易行和经济。文档编号C12Q1/04GK1281052SQ0011706公开日2001年1月24日申请日期2000年7月7日优先权日2000年7月7日发明者缪晓辉,徐文胜,潘怡,孔宪涛,戚中田申请人:上海长征医院