专利名称：制备2-脱氧核糖5-磷酸的方法
技术领域：
本发明涉及使用微生物本身或者衍生自所述微生物的酶以高产率稳定地制备2-脱氧核糖5-磷酸的方法。本发明也涉及能产生酶的微生物，所述酶可以用于制备2-脱氧核糖5-磷酸。在脱氧核苷的生化合成中使用2-脱氧核糖5-磷酸作为原料。而且，通过去磷酸化2-脱氧核糖5-磷酸可以获得2-脱氧核糖。在核苷的化学合成中使用2-脱氧核糖作为原料。
背景技术：
通常，2-脱氧核糖5-磷酸用酶水解DNA或化学磷酸化2-脱氧核糖来制备。但是，前一方法存在如下的问题DNA作为原料很昂贵，且需要大量的分离/纯化工艺。后一方法也存在如下的问题区域选择磷酸化2-脱氧核糖很难。因此，2-脱氧核糖5-磷酸不能通过上述两种方法廉价地制备。
在体内，已知2-脱氧核糖5-磷酸通过2-脱氧核糖5-磷酸醛缩酶(脱氧核糖磷酸醛缩酶EC4.1.2.4)的催化作用，由甘油醛3-磷酸和乙醛产生。但是，上述反应中2-脱氧核糖5-磷酸的制备存在如下问题甘油醛3-磷酸作为底物的化学合成并不容易，且作为另一底物的甘油醛不稳定，易于异构形成更加稳定的异构体二羟丙酮。
还已知由于通过丙糖磷酸异构酶(EC5.3.1.1)异构化二羟丙酮磷酸的异构化反应，在体内产生甘油醛3-磷酸。作为上述反应底物的二羟丙酮磷酸可以化学或者生化合成(例如，参考Itoh，N.Tsujibata，Y.，Liu，J.Q.，Appl.Microbiol.Biotechnol.，第51卷，193-200页，1999)。
但是，上述报告的目标是对戊糖体内代谢和醛缩酶立体特异作用的学术分析，且甘油醛3-磷酸和2-脱氧核糖5-磷酸的工业生产绝对超出报告的范围。至今，并没有报道工业生产2-脱氧核糖5-磷酸的方法。
关于使用酶或者酶试剂来制备2-脱氧核糖5-磷酸的方法，在以下学术文献中报道了若干例子。
其中，就有以下的报道通过2-脱氧核糖5-磷酸醛缩酶的作用由甘油醛3-磷酸和乙醛作为底物制备2-脱氧核糖5-磷酸(Barbas，III，C.F.，Wang，Y.，Wong，C.，J.Am.Chem.Soc.，第112卷，第2013-2014页，1990)。但是，在这一报告中并不能获知2-脱氧核糖5-磷酸就作为原料的底物量而言的产率，因为所述报告没有揭示产生2-脱氧核糖5-磷酸的量。
而且在另一实例中，有以下的报道使用作为生化试剂的市售丙糖磷酸异构酶和通过大肠杆菌制备的2-脱氧核糖5-磷酸醛缩酶的粗制酶，由二羟丙酮磷酸和乙醛作为底物制得2-脱氧核糖5-磷酸，所述粗制酶已经在EDTA作为磷酸酶抑制剂和氮气存在下，用具有2-脱氧核糖5-磷酸醛缩酶基因(deo C基因)的质粒转化(Chen，L，Dumas，D.P.，Wong，C.，J.Am.Chem.Soc.，第114卷，第741-748页，1992)。但是，在这些学术报告中，所述酶衍生自不同的来源，在试剂等级下进行纯化。此外，虽然使用显著量的EDTA来抑制磷酸酶的去磷酸化作用，但是并不能完全消除磷酸酶的影响。因此，所述方法并不适合2-脱氧核糖5-磷酸的工业生产。
在糖代谢如糖酵解途径和戊糖磷酸循环中，甘油醛3-磷酸是重要的中间体(例如，参考《生物化学词典》第三版，1998，Tokyo Kagaku，Dojin，第411页，)。因此，甘油醛3-磷酸通过细胞中的各种酶向各种途径进行代谢。而且，存在以下的问题甘油醛3-磷酸的磷酸基容易被磷酸酶切去。
发明披露考虑到上述的问题，本发明的目的是提供以高产率稳定地制备2-脱氧核糖5-磷酸的方法。本发明的第一目的是发现有显著量酶的微生物，所述微生物涉及2-脱氧核糖5-磷酸的合成，但是仅含有极少量不需要的糖酵解酶如磷酸酶，使得可以使用作为底物的甘油醛3-磷酸和乙醛，或者作为底物的二羟丙酮磷酸和乙醛以高产率制得2-脱氧核糖5-磷酸。
为了达到上述目的，本发明的发明人分三步寻找所述微生物，从大量和多种菌株中完成上述的条件。因此，本发明人发现了由作为底物的甘油醛3-磷酸和乙醛、或者二羟丙酮磷酸和乙醛以高产率产生2-脱氧核糖5-磷酸的微生物，由此完成本发明。
本发明概述如下(1)制备2-脱氧核糖5-磷酸的方法，所述方法包括在微生物本身或衍生自所述微生物的酶存在下，反应甘油醛3-磷酸和乙醛，所述微生物包含2-脱氧核糖5-磷酸醛缩酶，但基本上不含磷酸酶。
(2)制备2-脱氧核糖5-磷酸的方法，所述方法包括在微生物本身或衍生自所述微生物的酶存在下，反应二羟丙酮磷酸和乙醛，所述微生物包含2-脱氧核糖5-磷酸醛缩酶和丙糖磷酸异构酶，但基本上不含磷酸酶。
(3)根据上面(1)所述制备2-脱氧核糖5-磷酸的方法，其中，所述微生物是属于肠杆菌科的微生物。
(4)根据上面(2)所述制备2-脱氧核糖5-磷酸的方法，其中，所述微生物是属于肠杆菌科的微生物。
(5)制备2-脱氧核糖5-磷酸的方法，所述方法包括在微生物本身或衍生自所述微生物的酶存在下，反应甘油醛3-磷酸和乙醛，所述微生物属于克雷伯氏菌属，且包含2-脱氧核糖5-磷酸醛缩酶。
(6)制备2-脱氧核糖5-磷酸的方法，所述方法包括在微生物本身或衍生自所述微生物的酶存在下，反应二羟丙酮磷酸和乙醛，所述微生物属于克雷伯氏菌属，且包含2-脱氧核糖5-磷酸醛缩酶和丙糖磷酸异构酶。
(7)根据上面(1)、(3)和(5)任一项所述制备2-脱氧核糖5-磷酸的方法，其中，所述微生物是肺炎克雷伯氏菌B-44(IFO 16579)。
(8)根据上面(2)、(4)和(6)任一项所述制备2-脱氧核糖5-磷酸的方法，其中，所述微生物是肺炎克雷伯氏菌B-44(IFO 16579)。
(9)肺炎克雷伯氏菌B-44(IFO 16579)能产生2-脱氧核糖5-磷酸醛缩酶和丙糖磷酸异构酶，但基本上不含磷酸酶。
附图简要说明
图1是显示培养时间对2-脱氧核糖5-磷酸产生的影响的图。
图2是显示反应溶液pH对2-脱氧核糖5-磷酸产生的影响的图。
图3是显示Tris-盐酸缓冲溶液(pH9.0)浓度对2-脱氧核糖5-磷酸产生的影响的图。
图4是显示反应溶液中微生物细胞浓度对2-脱氧核糖5-磷酸产生的影响的图。
图5是显示反应溶液中乙醛浓度对2-脱氧核糖5-磷酸产生的影响的图。
图6是显示反应溶液中底物浓度对2-脱氧核糖5-磷酸产生的影响的图，其中，各情况分别使用甘油醛3-磷酸和二羟丙酮磷酸作为底物。
图7是显示反应溶液温度对2-脱氧核糖5-磷酸产生的影响的图。
图8是显示在最佳条件下随时间推移，由甘油醛3-磷酸产生的2-脱氧核糖5-磷酸量的改变的图。
图9是显示在最佳条件下随时间推移，由二羟丙酮磷酸产生的2-脱氧核糖5-磷酸量的改变的图。
实施本发明的最佳方式以下将详细说明本发明。
{通过酶反应合成2-脱氧核糖5-磷酸}在本发明方法中，如以下反应式(1)所示，通过包含2-脱氧核糖5-磷酸醛缩酶的微生物本身的催化作用或者衍生自所述微生物的酶的催化作用，由作为原料的甘油醛3-磷酸和乙醛产生2-脱氧核糖5-磷酸。下文中，2-脱氧核糖5-磷酸醛缩酶也称为“DERA”。通式(1)的反应是平衡反应，但是所述平衡偏向于2-脱氧核糖5-磷酸的生产方面。
通式(1) 甘油酯3-磷酸乙醛 2-脱氧核糖5-磷酸本发明中，如以下通式(2)所示，通过包含丙糖磷酸异构酶的微生物本身的催化作用或者衍生自所述微生物的酶的催化作用，异构化二羟丙酮磷酸来产生甘油醛3-磷酸。下文中，丙糖磷酸异构酶还称为“TPI”。
通式(2) 二羟丙酮磷酸 甘油醛3-磷酸当微生物包含丙糖磷酸异构酶和2-脱氧核糖5-磷酸醛缩酶时，由于所述微生物本身或者衍生自所述微生物的酶的催化作用，通式(2)的异构化反应和通式(1)的醛缩酶反应顺序地发生。因此，在本发明中，可以由作为原料的二羟丙酮磷酸和乙醛，通过上述微生物本身或衍生自所述微生物的酶的催化作用产生2-脱氧核糖5-磷酸。
在本发明中，当所述微生物基本上不含磷酸酶时，在通式(1)和(2)的反应时间，可以防止产生不必要的代谢，如由磷酸酶除去磷酸基。在这种情况下，由于防止了上述不必要的代谢，所得2-脱氧核糖5-磷酸量的实际值更加接近理论值。
{原料}本发明作为原料用的乙醛、甘油醛3-磷酸和二羟丙酮磷酸均可购得(例如，参考Sigma Aldrich Japan Co.，的“《精细化学品目录手册》”)。关于本发明中用作原料的化合物纯度，如果所述化合物至少和工业通用原料一样纯的化合物时就足够了。
至于甘油醛3-磷酸，可以使用DL-甘油醛3-磷酸。但是，更好是D-甘油醛3-磷酸。
通过合成而不是使用市售产品可以制得二羟丙酮磷酸。例如，使用二羟丙酮和三氯氧化磷作为工业原料可以合成二羟丙酮磷酸。或者通过二羟丙酮激酶(EC2.7.1.29)的催化作用，使用二羟丙酮和乙酰磷酸作为原料可以生化合成二羟丙酮磷酸(例如，参考Itoh，N.，Tsujibata，Y.，Liu，J.Q.，Appl. Microbiol.Biotechnol，第51卷，第193-200页，1999)。
{微生物和酶}
本发明使用的脱氧核糖磷酸醛缩酶(DERA，EC 4.1.2.4)和丙糖磷酸异构酶(TPI，EC5.3.1.1)理论上可以来自任何类型的微生物。在本发明中，当甘油醛3-磷酸和乙醛作为底物时，所用的微生物类型并没有特殊限制，只要所述微生物包含DERA(这里，微生物也包含TPI是可以接受的)。当使用二羟丙酮磷酸和乙醛作为底物时，所用微生物的类型并没有特殊限制，只要所述微生物包含DERA和TPI。在使用甘油醛3-磷酸和乙醛，或者使用二羟丙酮磷酸和乙醛作为底物的各种情况下，所述微生物优选基本上不含磷酸酶。在本发明中，术语“所述微生物基本上不含磷酸酶”是指所述微生物绝对不含磷酸酶或者，若有的话，所述酶仅表现很弱的活性，几乎不会影响本发明的制备方法。
在使用甘油醛3-磷酸/使用二羟丙酮磷酸的各情况下，优选满足上述条件的微生物的例子包括属于肠杆菌科的微生物。特别是，这些例子包括属于克雷伯氏菌属、肠杆菌属类或者埃希氏菌属的微生物。更特别是，在各种情况下，优选的例子包括肺炎克雷伯氏菌，和更优选的例子包括肺炎克雷手氏菌B-44(IFO16579)。
在2001年3月1日的大坂发酵研究所(IFO，2-17-85，Juso-honmachi，Yodogawa-ku，Osaka，532-8686，JAPAN)保存了肺炎克雷伯氏菌B-44菌株。其保存号是IFO 16579。若需要的话，这种“IFO菌株”任何人都可以获得。根据国立传染病研究所(JAPAN)提出的微生物生物研究安全性等级，肺炎克雷伯氏菌B-44菌株归为等级2。因此，国立先进工业科学和技术研究所(JAPAN)，以前原名称为工业科学和技术署国立生物科学和人类技术研究所拒绝接受这一菌株，虽然AIST是由布达佩斯条约指定的国际保藏管理机构。AIST已经于2001年2月27日官方接受了这一拒绝。
在本发明中，所述表达“在微生物本身或者衍生自微生物的酶存在下反应”是指使用包含所述微生物(微生物细胞悬浮液)的悬浮液或者使用包含由所述微生物产生的酶的溶液来进行反应。即在本发明中，所述反应可以通过使用微生物细胞悬浮液或者通过收集微生物产生的酶并使用它来进行。
{反应条件、产物的分离和纯化、以及产物的定量测定}接着，描述了产生2-脱氧核糖5-磷酸的反应中的反应条件。为使用甘油醛3-磷酸和乙醛作为底物以及使用二羟丙酮磷酸和乙醛作为底物的两个反应提供以下反应条件，除非另有所述。
在本发明中，在使用甘油醛3-磷酸和使用二羟丙酮磷酸作为磷酸盐化合物原料的情况下，所述磷酸盐化合物的起始浓度优选为5-500mM，更优选是25-150mM。乙醛的起始浓度优选为15-1000mM，更优选是150-400mM。相对于作为底物的磷酸盐浓度，乙醛的浓度越高，则预期每消耗的磷酸盐化合物2-脱氧核糖5-磷酸的产率越高。
所述反应溶液的pH优选为4.0-12.5，更优选是8.5-9.5。所述反应溶液的温度优选为20-60℃，更优选是25-40℃。所述反应时间可以根据反应的条件而不同，但是通常为2-6小时。
至于用作反应溶液的缓冲溶液，可以使用其pH在上述范围内调节的任何缓冲溶液或水。当甘油醛3-磷酸用作底物时，优选100-400mM缓冲溶液(pH8.5-9.5)。尤其是，在这种情况下，更优选200mM Tris-盐酸缓冲溶液(pH9.0)。当二羟丙酮磷酸用作底物时，优选使用水作为缓冲溶液。
至于反应中使用的微生物，优选使用通过在营养培养基(例如，DR培养培养基)中预先培养贮存微生物3-25小时而获得的微生物。更优选是，可以使用在营养培养基中预先培养贮存微生物8-20小时而获得的微生物。
反应中使用的微生物细胞浓度优选为1.0-20重量％。所述微生物的细胞浓度越高，在2-脱氧核糖5-磷酸制备过程中获得的效果就越好。
所产生的2-脱氧核糖5-磷酸可以通过超滤、离子交换分离、吸附色谱等从反应溶液中收集。
按以下两种方法可以测定反应产物的量。所述第一方法是Burton方法(例如，参见“Seikagaku Jiten(生物化学词典)1998，第三版，第664页；Tokyo KagakuDojin)。这种方法通过二苯胺-乙酸-硫酸反应来选择性地检测2-脱氧核糖5-磷酸，并由此获得高特异性。所述2-脱氧核糖5-磷酸的吸附系数等于2-脱氧核糖的吸附系数。
所述第二方法是使用半胱氨酸-硫酸盐方法，是DNA的比色法(例如，参见Stumpf，P.K.，J.Biol.Chem.，第169卷，第367-371页，1947)。在本发明中，通过这些方法定量测定2-脱氧核糖5-磷酸。
{培养条件和所述酶的制备}本发明微生物能在细菌的常规培养基中良好地生长，并产生上述的酶。就提高所述酶活性来说，以所述培养基的0.1-2.0重量％加入2-脱氧核糖、果糖、果糖-1，6-二磷酸盐、二羟丙酮磷酸等更加有效。
至于本发明微生物的碳源和氮源，可以使用酵母提取物、肉提取物、蛋白胨等。至于无机盐，可以使用氯化铵、硝酸钾等。
对本发明的酶反应来说，可以使用在上述条件中培养的微生物，而不需要进一步处理。或者，通过已知的方法从所述微生物中获得所述酶(例如，通过使用超声波或研磨来破裂、离心沉淀、硫酸铵分级、膜分离)，也可以使用所得的粗制酶来进行所述酶反应。
{细菌学特性}按照《Bergey氏系统细菌系手册》，第1卷(1984)”和“Bergey氏鉴别细菌学手岫，第九版(1994)”研究所述保存菌株的细菌学特性的结果如下。基本上按照Takeji Hasegawa的《微生物的分类和鉴别》(Classification and Determinationof Microorganism)”修订版(Gakkai Shuppan Center)，1985所述的方法进行实验。
肺炎克雷伯氏菌B-44(IFO 16579)(下文也称为“B-44菌株)1.形态特征(1)细胞的形状和大小杆状，0.8微米×0.8-3.2微米(2)革兰氏染色阴性(3)细胞多形态的存在/不存在不存在(4)运动性无(5)鞭毛分布状态无(6)孢子的存在/不存在无(7)耐酸性无2.培养中的特性(1)Bouillon琼脂平板培养圆形、周边均光滑，稍稍凸起，表层光滑，带略黄的乳白色。
(2)Bouillon琼脂斜面培养带略黄的乳白色、不透明、分布在整个培养基上，生长良好。
(3)Bouillon液体培养中度且均匀地悬浮，无色。
(4)Bouillon明胶穿刺培养没有变化(5)石蕊牛奶略带酸性，凝结、观察到气体产生。
3.生理学特性(1)硝酸盐的减少阳性(2)反硝化反应阴性
(3)MR试验阳性(4)VP试验阴性(5)吲哚的产生阴性(6)硫化氢的产生阴性(7)淀粉的水解阴性(8)柠檬酸的利用·Koser培养基阳性·Christensen培养基阳性(9)无机氮源的利用·硝酸盐阳性(弱)·铵盐阳性(弱)(10)染料的产生阴性(11)脲酶阴性(12)氧化酶阴性(13)过氧化氢酶阳性(14)生长范围·pH3.5-10.2(最佳范围5.0-8.0)·温度范围10-40℃(最佳范围22-30℃)(15)和氧的反应均匀生长，观察到气体产生(16)O-F试验·葡萄糖F4.表现种类特性必需的其它特征(1)各种碳源的利用·乳糖+·麦芽糖+·D-木糖+·D-甘露糖醇+·棉子糖+·D-山梨糖醇+·蔗糖+·肌醇+
·核糖醇+·L-鼠李糖+·L-阿拉伯糖+·D-甘露糖+(2)β-半乳糖+(3)精氨酸的去羧基化-(4)赖氨酸的去羧基化+(5)鸟氨酸的去羧基化-(6)七叶苷的水解+(7)有机酸的利用·丙二酸+·柠檬酸+·葡糖酸+·正-癸酸-·己二酸-·DL-苹果酸+(8)乙酰胺的利用-(9)吲哚-丙酮酸的产生-(10)精氨酸脱水解酶-(11)明胶的水解-(12)利用苯乙酸作为营养的能力-5.化学分类学特性(1)GC含量50-52摩尔％(HPLC方法)从上述细菌学特性来判断，该菌株可以确定为肺炎克雷伯氏菌。
实施例通过以下实验实施例和实施例更加详细地描述了本发明。
在实验实施例和实施例中，按照以下所述TLC、Burton方法和半胱氨酸-硫酸盐方法来分析2-脱氧核糖和2-脱氧核糖5-磷酸。将标准化合物加入DR培养基(如以下实验实施例3所述)，按照Burton方法和半胱氨酸-硫酸盐方法进行鉴别和定量测定。所得结果显示通过定量测定所获得的值和所称量的重量一致。
(1)通过薄层层析(TLC)检测和鉴别糖将2-脱氧核糖5-磷酸、2-脱氧核糖、乙醛、甘油醛3-磷酸和二羟丙酮磷酸的标准化合物、样品点于薄层层析用平板(Kieselgel 60F254，Merck Co.制造)上。使用正丁醇、乙酸和水为3∶1∶1(v/v/v)的混合物作为展开剂来进行展开。之后，将p-茴香醛-硫酸喷在平板上，并加热所述平板，所述p-茴香醛-硫酸通过将0.5mLp-茴香醛溶解在50mL乙酸中并向其中加入1mL浓硫酸来制备。以Rf值以及所呈现的颜色进行所述产物的检测和鉴别。
(2)用Burton方法定量测定2-脱氧核糖5-磷酸1.5g二苯胺溶解在100mL包含1.5mL浓硫酸的重蒸馏冰乙酸中。向20mL溶液中加入0.1mL乙醛水溶液(16mg/mL)，由此制得试剂。向2mL的试剂中加入1mL含5-100微克2-脱氧核糖的样品。将所得的混合物静置在30℃16-20小时，然后测量在600nm处的吸光度。将标度适当降低。测量值可以认为是产生的2-脱氧核糖5-磷酸的量，除非通过TLC来检测2-脱氧核糖。
(3)用半胱氨酸-硫酸盐方法定量测定2-脱氧核糖5-磷酸预先制备含5-100微克2-脱氧核糖5-磷酸的标准样品溶液。将17.5微升的5％(重量/体积)半胱氨酸-盐酸溶液加入17.5微升的标准样品溶液中。并进一步加入175微升的70％硫酸。所得混合物迅速搅拌，并在室温(25℃)静置10分钟，然后测量在490nm处的吸光度。
实验实施例1以降解2-脱氧核糖的能力为基础进行第一次筛选使用常规的振荡培养或者静止培养来培养700个细菌菌株、100个放线菌菌株、100个霉菌菌株、100个担子菌菌株和500个土壤细菌菌株，它们能利用2-脱氧核糖作为营养，由此获得各类微生物的湿细胞。所述各类微生物的湿细胞加入含2-脱氧核糖(20mM)的磷酸盐缓冲溶液(100mM，pH7.0)中，并在28℃振荡1或2小时。过滤所得溶液，并将预定量的过滤液点于TLC平板上。由此，分析降解2-脱氧核糖的能力。结果列于表1中。
表1
实验实施例2以通过细胞提取溶液的作用从2-脱氧核糖产生乙醛的能力为基础进行第二次筛选通过常规方法培养在实验实施例1中已经证实能降解2-脱氧核糖的各菌株。通过超声波和离心分离破碎各培养菌株的细胞，由此获得上清液。向20微升所得的上清液中加入20微升的100m MTris-盐酸缓冲溶液(pH8.8)、10微升的0.5mMNaDH(还原的烟酰胺腺嘌呤二核苷酸)、30U醇脱氢酶(由Sigma Aldrich Japan co.制造，“1U”表示酶活性，由此，在25℃、pH8.8，1.0微摩尔的乙醇在1分钟内完全转化成醛)、10微升的2-脱氧核糖5-磷酸或者2-脱氧核糖。将所得溶液静置在30℃。测量随时间推移在340nm处的吸光度变化。
在所述测量中，以在340nm处的吸光度变化为基础，估计因乙醛还原成乙醇引起的NADH降低，来确定因2-脱氧核糖5-磷酸醛缩酶的作用降解2-脱氧核糖5-磷酸或2-脱氧核糖产生的乙醛的量。
各菌株的2-脱氧核糖5-磷酸醛缩酶的活性已经从所产生的乙醛量来估计，结果列于表2中。在表2中，“-”表示没有检测到任何酶活性，“+”表示至少检测到一些酶活性。“+”的数目越多表示酶活性越高。
表2
实验实施例3培养微生物用的培养基的选择将在实验实施例2中表现高酶活性的8个土壤细菌菌株转移到下述各种类型的培养基。在28℃将各样品进行振荡培养基过夜。对各样品，以和实验实施例2类似的方式测量降解2-脱氧核糖5-磷酸的活性。结果表明，在其它两种类型的培养基中观察到的酶活性相比，在DR培养中的酶活性通常增大两倍或者几倍。在类似地向DR培养基中加入果糖、果糖-1，6-二磷酸盐、二羟丙酮磷酸等来代替2-脱氧核糖的例子中，提高了所述酶活性，虽然提高的效果并不如2-脱氧核糖一样杰出。
(培养基)(1)NB培养基营养肉汤(由DIFCO co.制造)，其中已经加入0.1％酵母提取物(2)TGY培养基0.5％胰蛋白陈(由DIFCO co.制造)、0.5％酵母提取物、0.1％葡萄糖、0.1％磷酸氢二钾(pH7.0)(3)DR培养基0.5％2-脱氧核糖、0.2％氯化铵、0.1％磷酸二氢钾、0.1％磷酸氢二钾、0.03％硫酸镁.七水合物，以及0.01％酵母提取物(pH7.0)。
实验实施例4以从乙醛和甘油醛3-磷酸产生2-脱氧核糖5-磷酸的能力为基础进行第三次筛选在8个土壤细菌菌株中，在以下条件下测量合成2-脱氧核糖5-磷酸的酶活性，所述细菌在实验实施例2中表现出高的脱氧核糖磷酸醛缩酶的酶活性。因此，检测了2-脱氧核糖5-磷酸，但没有检测2-脱氧核糖。从测量值来看，发现B-44菌株是最优良的菌株。也发现在pH8.5时产生的2-脱氧核糖5-磷酸的量比在pH7.0时大。
(湿细胞的制备)将5mlDR培养基加入试管(16×165mm)中，将土壤细菌菌株用铂环接种到培养基中。所述接种的菌株在28℃振荡培养(300rpm)2天。所得培养溶液转移到含500ml DR培养基的2L锥形烧瓶中，并在28℃振荡培养(120rpm)2天。在8000rpm离心所得的培养溶液。用0.85％(重量/体积)盐溶液洗涤沉淀物两次，由此获得湿细胞。
(反应条件)将20％(重量/体积)的上述湿细胞加入60微升水溶液中，所述水溶液已经制成含166mM Tris-盐酸缓冲溶液(pH8.5)，或者166mM磷酸盐缓冲溶液(pH7.0)、333mM乙醛和100mM DL-甘油醛3-磷酸。在30℃搅拌所述混合物3小时，然后离心，由此得到上清液。测定在所述上清液中产生的2-脱氧核糖5-磷酸的量。
实施例1可以由B-44菌株的酶系统用于产生2-脱氧核糖5-磷酸的底物将表3中所列的No.1-12的各底物和333mM乙醛一起加到以下任一溶液中150mM乙酸-乙酸钠缓冲溶液(pH5.5)、150mM磷酸盐缓冲溶液(pH7.0)、和166mMTris-盐酸缓冲溶液(pH8.5)。将20％(重量/体积)的B-44菌株的温细胞(已经在实验实施例3中所述的DR培养基中，28℃振荡培养过夜)加入含各底物的所制备的溶液。在30℃搅拌各混合物3小时，然后离心，由此获得上清液。测定在所述上清液中产生的2-脱氧核糖5-磷酸的量。
结果列于表3中。已经证实2-脱氧核糖5-磷酸有利地在碱性一侧产生，且DL-甘油醛3-磷酸和二羟丙酮磷酸作为底物是极好的。在表3中，“-”表示产生的2-脱氧核糖5-磷酸的量为零或者几乎不能追踪，“+”表示证实了2-脱氧核糖5-磷酸的产生。“+”数目越多，表明产生的2-脱氧核糖5-磷酸量越大。
表3
实施例2微生物的最佳培养时间在以下条件中培养所述B-44菌株，并周期性收集所述湿细胞。评价产生2-脱氧核糖5-磷酸的细菌能力。
结果在图1中显示。在使用甘油醛3-磷酸和使用二羟丙酮磷酸作为底物的情况下，已经培养10-12小时的细胞呈现最高的活性。因此，在所有随后的实施例中使用已经培养10-12小时的湿细胞。在图1中，“-○-”表示当使用甘油醛3-磷酸作为底物时产生的2-脱氧核糖5-磷酸的浓度(mM)。“-△-”表示当使用二羟丙酮磷酸作为底物时产生的2-脱氧核糖5-磷酸的浓度(mM)。“-□-”表示B-44菌株的生长程度(浊度的程度)。类似地，图2-9中所用的符号“-○-”和“-△-”表示和图1中的相同意思。
(湿细胞的培养条件和制备)将5mDR培养基加入试管(16×165mm)中，将B-44菌株用铂环接到到培养基中。接种的B-44菌株在28℃振荡培养(300rpm)2天。所得培养溶液转移到含500mlDR培养基的2L锥形烧瓶中，并在28℃振荡培养(120rpm)2天。周期性收集所述培养溶液，并在8000rpm离心。用0.85％(重量/体积)盐溶液洗涤沉淀物两次，由此获得温细胞。为了从浊度程度知道B-44菌株的生长程度，分析湿细胞量和浊度程度之间的关系，并预先制得转化的通式。
(反应条件)(1)在使用甘油醛3-磷酸作为底物的情况下甘油醛3-磷酸87.5mM乙醛200mMTris-盐酸缓冲溶液200mM，pH9.0湿细胞12.5％(重量/体积)反应在30℃振荡3小时(2)在使用二羟丙酮磷酸作为底物的情况下二羟丙酮磷酸116.6mM乙醛200mMTris-盐酸缓冲溶液200mM，pH9.0湿细胞16.6％(重量/体积)反应在30℃振荡3小时(定量测定的方法)在反应完成之后，所述反应溶液立即进行离心，得到上清液。测定所述上清液中产生的2-脱氧核糖5-磷酸的量。
实施例3反应中的最佳pH通过使用已经培养10-12小时的湿细胞研究反应溶液的最佳pH。所述反应条件基本上和实施例2的那些相同，除了通过使用150mM磷酸盐缓冲溶液将反应溶液的pH值从pH6.0变为pH8.5，以及使用150mM Tris-盐酸缓冲溶液将pH7.5变为pH10.0以外。结果在图2中显示。在使用甘油醛3-磷酸和使用二羟丙酮磷酸作为底物的情况下，最佳pH为9.0。
实施例4反应的缓冲溶液的最佳浓度通过使用已经培养10-12小时的湿细胞研究反应溶液的最佳浓度。所述反应条件基本上和实施例2的那些相同，除了将pH9.0 Tris-盐酸缓冲溶液的浓度在0-900mM范围内变化以外。结果在图3中显示。当使用甘油醛3-磷酸作为底物时，在缓冲溶液浓度为200mM的情况中，活性呈现最高值。另一方面，当使用二羟丙酮磷酸作为底物时，缓冲溶液的浓度越低，就能获得越高的活性。当不使用缓冲溶液(即，只有水)时，所述活性达到最高的水平。
实施例5反应溶液中的最佳细胞浓度通过使用已经培养10-12小时的湿细胞研究反应溶液中的最佳浓度。所述反应条件基本上和实施例2的那些相同，除了当使用二羟丙酮磷酸作为底物时，使用水作为反应溶液之外。结果在图4中显示。在使用甘油醛3-磷酸和二羟丙酮磷酸作为底物的情况下，细胞浓度越高，在所研究的细胞浓度范围(即，0.75-16.6％(重量/体积))内产生的2-脱氧核糖5-磷酸的量越大。在所研究的细胞浓度范围内，观察到在细胞浓度和产生的2-脱氧核糖5-磷酸量之间存在线性比例关系。
实施例6反应溶液中的最佳乙醛浓度通过使用已经培养10-12小时的湿细胞研究反应溶液中的最佳乙醛浓度。所述反应条件基本上和实施例2的那些相同，除了乙醛的浓度在0-1000mM范围内变化，且当使用二羟丙酮磷酸作为底物时，用水来代替缓冲溶液之外。结果在图5中显示。在使用87.5mM甘油醛3-磷酸以及使用116.6mM二羟丙酮磷酸作为底物的情况中，乙醛的最佳浓度为200mM。
实施例7底物的最佳浓度通过使用已经培养10-12小时的湿细胞研究底物的最佳浓度。所述反应条件基本上和实施例2的那些相同，除了作为底物的甘油醛3-磷酸和二羟丙酮磷酸浓度在0-125mM范围内变化，且当使用二羟丙酮磷酸作为底物时，用水来代替缓冲溶液之外。
结果在图6中显示。在甘油醛3-磷酸和二羟丙酮磷酸中，在200mM乙醛存在下，底物的浓度越高，产生的2-脱氧核糖5-磷酸的量越大。在使用二羟丙酮磷酸作为底物的情况下，在所述底物的研究浓度范围内，产生的2-脱氧核糖5-磷酸的量几乎是线性增长，即通常和底物的浓度增长成比例。但是，在使用甘油醛3-磷酸作为底物的情况下，在底物浓度范围为25mM或更高时，产生的2-脱氧核糖5-磷酸的量基本上达到平稳定状态。
实施例8最佳反应温度通过使用已经培养10-12小时的湿细胞研究反应溶液的最佳温度。所述反应条件基本上和实施例2的那些相同，除了温度发生变化，以及当使用二羟丙酮磷酸作为底物时，用水来代替缓冲溶液之外。结果在图7中显示。在使用甘油醛3-磷酸和使用二羟丙酮磷酸作为底物的情况下，最佳温度为30℃。
实施例9在最佳条件下，由甘油醛3-磷酸产生的2-脱氧核糖5-磷酸的量随时间推移发生的变化以上述实施例获得的结果为基础，观察在最佳条件下，由甘油醛3-磷酸产生的2-脱氧核糖5-磷酸的量随时间推移发生的变化。结果在图8中显示。在反应开始5小时之后获得的2-脱氧核糖5-磷酸的产率最高。具体是，从200mM乙醛和87.5mM甘油醛3-磷酸得到70.8mM 2-脱氧核糖5-磷酸。相对于所消耗的甘油醛3-磷酸，2-脱氧核糖5-磷酸的产率为80.9％。
(湿细胞的培养条件和制备)将5mlDR培养基加入试管(16×165mm)中，将B-44菌株用铂环接种到培养基中。接种的B-44菌株在28℃振荡培养(300rpm)2天。所得培养溶液转移到含500mlDR培养基的2L锥形烧瓶中，并在28℃振荡培养(120rpm)10-12小时。之后，用0.85％(重量/体积)盐溶液洗涤所得菌株两次，由此获得湿细胞。
(反应条件)甘油醛3-磷酸87.5mM乙醛200mMTris-盐酸缓冲溶液200mM，pH9.0湿细胞12.5％(重量/体积)
反应在30℃振荡3小时实施例10在最佳条件下，由二羟丙酮磷酸产生的2-脱氧核糖5-磷酸的量随时间推移发生的变化以上述实施例获得的结果为基础，观察在最佳条件下，由二羟丙酮磷酸产生的2-脱氧核糖5-磷酸的量随时间推移发生的变化。结果在图9中显示。在反应开始5小时之后获得的2-脱氧核糖5-磷酸的产率最高。具体是，从200mM乙醛和116.6mM二羟丙酮磷酸得到98.7mM 2-脱氧核糖5-磷酸。相对于所消耗的二羟丙酮磷酸，2-脱氧核糖5-磷酸的产率为84.6％。
(湿细胞的培养条件和制备)将5mDR培养基加入试管(16×165mm)中，将B-44菌株用铂环接种到培养基中。接种的B-44菌株在28℃振荡培养(300rpm)2天。所得培养溶液转移到含500mlDR培养基的2L锥形烧瓶中，并在28℃振荡培养(120rpm)10-12小时。之后，用0.85％(重量/体积)盐溶液洗涤所得菌株两次，由此获得湿细胞。
(反应条件)二羟丙酮磷酸116.6mM乙醛200mM水溶液使用蒸馏水代替缓冲溶液湿细胞16.6％(重量/体积)反应在30℃振荡3小时{本发明的有利效果}根据本发明，通过使用微生物的酶反应，由作为原料的甘油醛3-磷酸和乙醛可以以高产率稳定地产生2-脱氧核糖5-磷酸。类似地，根据本发明，通过使用微生物的酶反应，由作为原料的二羟丙酮磷酸和乙醛可以以高产率稳定地产生2-脱氧核糖5-磷酸。
对本领域的那些技术人员来说，容易产生另外的优点和改变。因此，本发明在其更广的方面中并不限于本文所示和所述的具体细节和代表性实施方案。因此，在不背离所述附带权利要求书及其等价物所定义的一般发明概念的精神或范围的情况下，可以作出各种修改。
权利要求
1.一种制备2-脱氧核糖5-磷酸的方法，其特征在于，所述方法包括在微生物本身或衍生自所述微生物的酶存在下，反应甘油醛3-磷酸和乙醛；所述微生物包含2-脱氧核糖5-磷酸醛缩酶，但基本上不含磷酸酶。
2.一种制备2-脱氧核糖5-磷酸的方法，其特征在于，所述方法包括在微生物本身或衍生自所述微生物的酶存在下，反应二羟丙酮磷酸和乙醛；所述微生物包含2-脱氧核糖5-磷酸醛缩酶和丙糖磷酸异构酶，但基本上不含磷酸酶。
3.如权利要求1所述制备2-脱氧核糖5-磷酸的方法，其特征在于，所述微生物是属于肠杆菌科的微生物。
4.如权利要求2所述制备2-脱氧核糖5-磷酸的方法，其特征在于，所述微生物是属于肠杆菌科的微生物。
5.一种制备2-脱氧核糖5-磷酸的方法，其特征在于，所述方法包括在微生物本身或衍生自所述微生物的酶存在下，反应甘油醛3-磷酸和乙醛，所述微生物属于克雷伯氏菌属，并包含2-脱氧核糖5-磷酸醛缩酶。
6.一种制备2-脱氧核糖5-磷酸的方法，其特征在于，所述方法包括在微生物本身或衍生自所述微生物的酶存在下，反应二羟丙酮磷酸和乙醛，所述微生物属于克雷伯氏菌属且包含2-脱氧核糖5-磷酸醛缩酶和丙糖磷酸异构酶。
7.如权利要求1、3和5的任一项所述制备2-脱氧核糖5-磷酸的方法，其特征在于，所述微生物是肺炎克雷伯氏菌B-44(IFO 16579)。
8.如权利要求2、4和6的任一项所述制备2-脱氧核糖5-磷酸的方法，其特征在于，所述微生物是肺炎克雷伯氏菌B-44(IFO 16579)。
9.肺炎克雷伯氏菌B-44(IFO 16579)，它能产生2-脱氧核糖5-磷酸醛缩酶和丙糖磷酸异构酶，但基本上不含磷酸酶。
全文摘要
本发明披露了在微生物本身或衍生自所述微生物的酶存在下，反应甘油醛3－磷酸和乙醛来制备2－脱氧核糖5－磷酸的方法；所述微生物包含2－脱氧核糖5－磷酸醛缩酶但基本上不含磷酸酶。本发明也披露了在微生物本身或衍生自所述微生物的酶存在下，反应二羟丙酮磷酸和乙醛来制备2－脱氧核糖5－磷酸的方法；所述微生物包含2－脱氧核糖5－磷酸醛缩酶和丙糖磷酸异构酶，但基本上不含磷酸酶。
文档编号C12N9/88GK1494596SQ0280578
公开日2004年5月5日 申请日期2002年2月26日 优先权日2001年3月2日
发明者清水昌, 小川顺 申请人:有机合成药品工业株式会社