专利名称：一种分离猪肝干细胞的方法
技术领域：
本发明涉及猪肝干细胞，特别是涉及一种分离猪肝干细胞的方法。
背景技术：
科学家预言干细胞相关技术在21世纪有可能成为治疗难治性疾病的新方法。据统计，全球慢性肝炎病毒携带者总数超过3.5亿人，其中我国有1.2亿多人。临床上由于乙肝和丙肝的持续感染、酒精或其他毒物等引起的急性肝损伤、肝纤维化、肝硬化甚至肝癌的情况比较多见，如慢性乙肝患者2000万人。肝炎、肝硬化的发病率逐年增加，每年有成千上万的肝病患者在等待肝移植期间死亡。肝脏移植是解决晚期肝脏器质性病变的有效手段，而供体肝脏的严重不足是世界范围内的严重问题。
肝细胞移植是治疗肝病的重要手段之一，它不仅维持病人正常的肝功能，而且对一些代谢失调的病人有良好的治疗作用。生物型人工肝支持系统能够为急性肝衰竭患者提供有效的肝脏解毒、代谢和生理支持功能。目前，肝细胞的来源缺乏是限制肝细胞移植和生物型人工肝广泛应用的主要障碍。成年人肝组织来源有限，人的胎肝和幼肝又涉及到伦理问题，因而，人们把注意力转向猪肝组织。猪肝组织具有以下优越性(1)来源丰富；(2)猪肝组织和人肝组织的形态与大小相近；(3)猪肝组织与人肝组织的生理和生化特性具有相似性。近些年来，国际上报道了将猪肝细胞用于生物型人工肝治疗严重肝衰竭病人，取得了令人满意的效果。在我国，北京佑安医院人工肝治疗中心和中国人民解放军总医院等单位将原代猪肝细胞应用于生物型人工肝支持系统，成功地治疗了急性肝衰竭病人。然而，猪肝实质细胞存在以下缺点①体外存活时间短；②需每次新鲜分离；③存在动物病原体污染的潜在危险性等问题。猪肝干细胞具有较强的增殖能力，体外培养存活时间长，并可分化为有功能的成熟肝细胞，污染源易控制等优点，这将为各种肝病的治疗提供新的途径，具有广泛的临床应用前景。
由于肝干细胞缺乏特异性细胞表面标记物，给猪肝干细胞的分离带来很大困难。因此，必须建立良好的分离方法，获取足够量、纯度高且存活率好的猪肝干细胞，以满足基础研究和临床应用的需要。
国际上猪肝干细胞研究很少。通常使用的猪肝干细胞的分离方法有如下几种1)肝组织块培养法曾被用来分离小鼠肝干细胞，如文献1Monga SP，Tang Y，Candotti F，Rashid A，Wildner O，Mishra B，Iqbal S，Mishra L.Expansion of hepatic and hematopoieticstem cells utilizing mouse embryonic liver explants.Cell Transplant.，2001，10(1)81-89所述，这种方法的缺点是分离的细胞数量少，所需时间较长；2)胶原酶消化和差速离心分离猪肝非实质细胞(这种细胞被证明为肝干细胞)，如文献2Kano J，Noguchi M，Kodama M，Tokiwa T.The in vitro differentiating capacity of nonparenchymal epithelialcells derived from adult porcine livers.Am.J.Pathol.，2000，1562033-204，文献3Kano J，Tokiwa T，Zhou X，Kodama M.Colonial growth and differentiation of epithelial cellsderived from abattoir adult porcine livers.J.Gastroenterol.Hepatol.，1998，13S62-89所述，由于肝脏包含多种非实质细胞如内皮细胞、库普弗细胞、贮脂细胞和卵圆形细胞等，因此，这种方法分离得到的肝干细胞纯度可能不高，他们的结果显示培养第1天形成的细胞丛至少包含三种非实质细胞。
发明内容
本发明的目的在于克服已有技术的分离方法所获得细胞的数量少、细胞纯度低或者所需时间太长的缺陷，从而提供一种可以在短时间内分离足够量、纯度高且存活率好的分离猪肝干细胞的方法。
本发明的目的是通过如下技术方案实现的本发明提供一种分离猪肝干细胞的方法，其包括如下步骤1)按常规方法进行猪肝大部分切除术；2)术后饲养5～10天，每天向步骤1)处理的试验猪的腹腔注射30～80ml含100IU抗生素的10wt％葡萄糖溶液；3)取出试验猪的肝组织，置于冰浴的平皿内，剪除被膜血管，使用冷Hank’s平衡盐溶液洗涤，剪碎肝组织块；4)加入50ml含0.02～0.03wt％EDTA的0.020～0.040wt％胶原酶，在37℃下于恒温振荡器上消化15～20分钟，加等体积Hank’s平衡盐溶液终止消化；5)过滤除去非细胞纤维成分和消化不完全的组织块，以500～1000rpm转速离心3～5min，分出的上清液再以1500rpm转速再离心5～10min；6)向步骤5)得到的沉淀物加入50ml的DMEM培养基，在37℃于恒温振动器上消化15～20分钟，消化1～3次，然后以1500rpm转速离心8～12min；
7)向步骤6)得到的沉淀物，按3ml/108细胞的量加入含NH4Cl的Tris缓冲溶液，处理1～5min，再加入50ml冷Hank’s溶液洗涤后，以1500rpm转速离心5～10min；8)倾出上层清液，沉淀物加入10ml Gey’s平衡盐溶液，制成细胞悬液；9)向离心管中依次加入10ml的28.7％wt/v聚乙酰胺吡咯烷酮，10ml 17.2％wt/v聚乙酰胺吡咯烷酮，10ml Gey’s平衡盐溶液和10ml步骤8)制得的细胞悬液，室温下以1500rpm转速离心15～20min，收集17.2％wt/v聚乙酰胺吡咯烷酮和28.7％wt/v聚乙酰胺吡咯烷酮交界面的细胞，得到猪的肝干细胞。
所述步骤1)的猪肝大部分切除术，其步骤如下a)按每公斤试验猪体重使用10～25mg/kg量的戊巴比妥钠，对试验猪进行腹腔麻醉；b)对所用手术器械进行高压灭菌，手术间紫外消毒；c)剪去试验猪腹腔体表毛发，用70～75wt％酒精对试验猪体表消毒，铺巾；d)剪开表皮，再解剖腹腔；e)用止血钳固定好表皮和腹腔肌，将0.90wt％生理盐水滴加到腹腔中，将肠系膜推到左侧，加0.90wt％生理盐水，用无菌纱布包裹肠系膜；f)剪开肝脏包膜，使猪的左肝小叶和中叶游离出来；g)用缝线结扎好左、中叶门静脉和肝动脉；h)切除肝左小叶和中叶，向腹腔补充含抗生素的生理盐水；i)分别用缝线缝合内皮和外皮。
所述步骤h)的抗生素为青霉素G。
所述步骤2)的抗生素为青霉素或庆大霉素。
所述步骤6)的DMEM培养基包括0.008～0.012％wt/v蛋白酶E(Pronase E)、0.010～0.012％wt/v胶原酶和0.0035～0.0045％wt/v脱氧核糖酶I(DNnase I)。
本发明提供的分离猪肝干细胞的方法使用肝大部分切除术、酶消化和密度梯度离心相结合的方法，为猪肝干细胞的基础研究和临床应用提供大量的细胞来源，与已有技术相比，其优越性在于能收获大量的猪肝干细胞，平均获得107以上的细胞；所需的时间较短；猪肝干细胞的纯度高、存活率好。
图1为实施例1中的猪肝干细胞的形态特征；其中放大倍数(A)×200，(B)×200，(C)，(D)×10000；图2为使用流式细胞仪分析实施例2中的猪肝干细胞的生化表型；图3为使用流式细胞仪分析实施例3的猪肝干细胞的生化表型。
具体实施例方式
实验用的试验猪均为雄性，体重3～5kg，由中国农业大学实验动物繁殖中心提供。
实施例1、使用本发明的方法分离猪肝干细胞试验猪进行肝部分切除手术，促进肝再生，其步骤如下1)按每公斤试验猪体重使用20mg/kg量的戊巴比妥钠，对试验猪进行腹腔麻醉；2)对所用手术器械进行高压灭菌，手术间紫外消毒；3)用电推剪将试验猪腹腔体表的毛发剪去，用70wt％酒精对试验猪进行体表消毒，铺巾；4)剪开表皮，再解剖腹腔，注意不要剪开胸腔膜，以免造成气胸而致死；5)用止血钳固定好表皮和腹腔肌，将0.90wt％生理盐水滴加到腹腔中，将肠系膜推到左侧，加0.90wt％生理盐水，用无菌纱布包裹肠系膜；6)剪开肝脏包膜，使猪的左肝小叶和中叶游离出来；7)用缝线结扎好左、中叶门静脉和肝动脉；8)切除肝左小叶和中叶，向腹腔补充含青霉素G的生理盐水；9)分别用缝线缝合内皮和外皮。
术后饲养7天，每天向试验猪的腹腔注射50ml含青霉素的10％葡萄糖溶液，然后按以下方法分离与纯化猪肝干细胞1)小心取出试验猪的一叶肝组织，置于冰浴的平皿内，剪除被膜血管等纤维组织，冷Hank’s平衡盐溶液洗三次，小心剪碎肝组织块；2)加入50ml含0.025wt％EDTA的0.030wt％胶原酶在37℃于恒温振动器上消化15分钟，加等体积冷Hank’s平衡盐溶液终止消化；3)100目筛网过滤除去非细胞纤维成分和消化不完全的组织块，500rpm离心3min，弃去沉淀物；取出的上清液，以1500rpm转速再离心10min；
4)向步骤3)的沉淀加入50ml的DMEM[含0.010％wt/v蛋白酶E(Pronase E)、0.011％wt/v胶原酶和0.0040％wt/v脱氧核糖酶I(DNnase I)]，在37℃于恒温振荡器消化20分钟，共消化3次，然后以1500rpm转速离心10min；5)向步骤4)得到的沉淀物，加Tris缓冲NH4Cl(3ml/108细胞)溶液，以溶解红细胞，处理时间为5min，加50ml冷Hank’s溶液迅速洗去Tris缓冲NH4Cl溶液，以1500rpm转速离心10min；6)弃去上层清液，沉淀加入10ml Gey’s平衡盐溶液制成细胞悬液；7)用长针头缓慢向50ml离心管中依次加入10ml的28.7％wt/v Percoll(聚乙酰胺吡咯烷酮)，10ml 17.2％wt/v Percoll，10ml Gey’s平衡盐溶液和10ml细胞悬液，室温下1500rpm离心20min，收集17.2％wt/v Percoll和28.7％wt/v Percoll交界面的细胞，得到猪的肝干细胞。
对此猪肝干细胞按如下步骤进行存活率判断①取数滴新鲜分离细胞悬液与等体积0.25％台盼蓝液相混合；②3分钟内将混合细胞悬液注入有盖玻片的血细胞计数板内；③按血细胞计数法，相差显微镜下计数4个大方格内着色和未着色(活)细胞，计算存活细胞百分率和获取猪肝干细胞的数量。
使用透射电镜观察此猪肝干细胞的超微结构新鲜分离的猪肝干细胞用2.5％戊二醛在4℃固定30min，PBS洗2次，1％wt/v饿酸后固定30min，再用PBS冲洗3次；使用不同浓度的甲醇脱水，树脂包埋，超薄切片，醋酸铀和柠檬酸铅染色，于Philips EM301电镜观察细胞的超微结构。
经台盼蓝染色测定实施例1分离的猪肝干细胞的活率为99％，经计数从一叶肝收获6.4×107的猪肝干细胞。新鲜分离的细胞在相差显微镜下，其形态特征为卵圆形，如图1A所示；贴壁后细胞呈鹅卵石样，细胞核/质比例大，如图1B所示；透射电镜下，细胞的超微结构特征①细胞较小，细胞直径4.5～6μm；②卵圆形细胞核(图1C)；③细胞质少，核/质比例大；④细胞质内细胞器少，含线粒体(Mi)、内质网(Er)和溶酶体(Ly)；⑤染色质(Ch)，如图1D。
实施例2、用流式细胞仪鉴定和分析猪肝干细胞(单染检测)按实施例1中方法分离2头猪的肝干细胞。
用流式细胞仪鉴定此猪肝干细胞将新鲜分离细胞加入eppendoff管(105细胞/管)，以1500rpm转速离心10min，PBS洗1次；弹散细胞沉淀，加入冷丙酮1ml，4℃固定8min；以1500rpm转速离心5min，PBS洗3次，以1500rpm转速离心10min；沉淀物加入0.1ml PBS制成细胞悬液，分别滴加一抗白蛋白、CK-19，37℃孵育45min；以1500rpm转速离心10min，弃上清，沉淀物加0.1ml PBS制成细胞悬液；再滴加PE标记的IgG，37℃孵育30min，PBS洗3次；以1500rpm转速离心10min，沉淀物视细胞量加入0.5～1mlPBS制备成细胞悬液；用流式细胞仪检测，用CellQuest软件分析数据，阴性对照用PE标记的IgG取代一抗。
流式细胞仪分析新鲜分离猪肝干细胞的生化表型，绘于图2。单染检测结果显示93.85％细胞表达白蛋白(如图2B)，96.37％细胞表达细胞角蛋白19(CK-19)(如图2C)。白蛋白是肝细胞特异性标记，而CK-19是胆上皮细胞的标记物，上述结果表明，93％以上新鲜分离细胞是双潜能肝干细胞。
实施例3、用流式细胞仪鉴定和分析猪肝干细胞(双染检测)按实施例1中方法，肝部分切除术后6天，按实施例1中的方法从3头试验猪中分离猪肝干细胞，每只试验猪平均获得了5.3×107的细胞。
双染步骤与实施例2中的单染相似，不同之处在于一抗为白蛋白+CK-19，二抗包括FITC标记的兔抗小鼠IgG(结合CK-19)和PE标记的羊抗兔IgG(结合白蛋白)。阴性对照用FITC标记的兔抗小鼠IgG和PE标记的羊抗兔IgG取代一抗。
流式细胞仪分析新鲜分离猪肝干细胞的生化表型，绘于图3。双染检测结果显示92.23％细胞共表达白蛋白和CK-19(如图3B)。白蛋白是肝细胞分泌的蛋白，而CK-19是胆上皮细胞的标记，结果表明，92％以上新鲜分离细胞是双潜能肝干细胞。
实施例4、使用本发明的方法分离猪肝干细胞试验猪进行肝部分切除手术，促进肝再生，其步骤如下1)按每公斤试验猪体重使用10mg/kg量的戊巴比妥钠，对试验猪进行腹腔麻醉；2)对所用手术器械进行高压灭菌，手术间紫外消毒；3)用电推剪将试验猪腹腔体表的毛发剪去，用72wt％酒精对试验猪进行体表消毒，铺巾；
4)剪开表皮，再解剖腹腔，注意不要剪开胸腔膜，以免造成气胸而致死；5)用止血钳固定好表皮和腹腔肌，将0.90wt％生理盐水滴加到腹腔中，将肠系膜推到左侧，加0.90wt％生理盐水，用无菌纱布包裹肠系膜；6)剪开肝脏包膜，使猪的左肝小叶和中叶游离出来；7)用缝线结扎好左、中叶门静脉和肝动脉；8)切除肝左小叶和中叶，向腹腔补充含青霉素G的生理盐水；9)分别用缝线缝合内皮和外皮。
术后饲养5天，每天向试验猪的腹腔注射30ml含庆大霉素的10％葡萄糖溶液，然后按以下方法分离与纯化猪肝干细胞1)小心取出试验猪的一叶肝组织，置于冰浴的平皿内，剪除被膜血管等纤维组织，冷Hank’s平衡盐溶液洗三次，小心剪碎肝组织块；2)加入50ml含0.02wt％的EDTA的0.020wt％胶原酶在37℃于恒温振动器上消化18分钟，加等冷体积Hank’s平衡盐溶液终止消化；3)100目筛网过滤除去非细胞纤维成分和消化不完全的组织块，1000rpm离心4min，弃去沉淀物；分出的上清液，以1500rpm转速再离心8min；4)向步骤3)的沉淀加入50ml的DMEM[含0.008％wt/v蛋白酶E(Pronase E)、0.010％wt/v胶原酶和0.0035％wt/v脱氧核糖酶I(DNnase I)]，在37℃于恒温振荡器上消化20分钟，消化1次，然后以1500rpm转速离心8min；5)向步骤4)得到的沉淀物，加Tris缓冲NH4Cl(3ml/108细胞)溶液，以溶解红细胞，处理时间为3min，加50ml冷Hank’s溶液迅速洗去Tris缓冲NH4Cl溶液，以1500rpm转速离心5min；6)倾出上层清液，沉淀加入10ml Gey’s平衡盐溶液制成细胞悬液；7)用长针头缓慢向50ml离心管中依次加入10ml的28.7％wt/v Percoll(聚乙酰胺吡咯烷酮)，10ml 17.2％wt/v Percoll，10ml Gey’s平衡盐溶液和10ml细胞悬液，室温下1500rpm离心18min，收集17.2％wt/v Percoll和28.7％wt/v Percoll交界面的细胞，得到猪的肝干细胞。
经台盼蓝染色测定其活率为98％，经计数收获4.8×107的猪肝干细胞。
实施例5、使用本发明的方法分离猪肝干细胞试验猪进行肝部分切除手术，促进肝再生，其步骤如下1)按每公斤试验猪体重使用25mg/kg量的戊巴比妥钠，对试验猪进行腹腔麻醉；2)对所用手术器械进行高压灭菌，手术间紫外消毒；3)用电推剪将试验猪腹腔体表的毛发剪去，用75wt％酒精对试验猪进行体表消毒，铺巾；4)剪开表皮，再解剖腹腔，注意不要剪开胸腔膜，以免造成气胸而致死；5)用止血钳固定好表皮和腹腔肌，将0.90wt％生理盐水滴加到腹腔中，将肠系膜推到左侧，加0.90wt％生理盐水，用无菌纱布包裹肠系膜；6)剪开肝脏包膜，使猪的左肝小叶和中叶游离出来；7)用缝线结扎好左、中叶门静脉和肝动脉；8)切除肝左小叶和中叶，向腹腔补充含青霉素G的生理盐水；9)分别用缝线缝合内皮和外皮。
术后饲养10天，每天向试验猪的腹腔注射80ml含庆大霉素的10％葡萄糖溶液，然后按以下方法分离与纯化猪肝干细胞1)小心取出试验猪的一叶肝组织，置于冰浴的平皿内，剪除被膜血管等纤维组织，冷Hank’s平衡盐溶液洗三次，小心剪碎肝组织块；2)加入50ml含0.03wt％的EDTA的0.040wt％胶原酶在37℃于恒温振动器上消化20分钟，加等体积冷Hank’s平衡盐溶液终止消化；3)100目筛网过滤除去非细胞纤维成分和消化不完全的组织块，800rpm离心5min，弃去沉淀物；分出的上清液，以1500rpm转速再离心5min；4)向步骤3)的沉淀加入50ml的DMEM[含0.012％wt/v蛋白酶E(Pronase E)、0.012％wt/v胶原酶和0.0045％wt/v脱氧核糖酶I(DNnase I)]，在37℃于恒温振荡器上消化15分钟，消化2次，然后以1500rpm转速离心12min；5)向步骤4)得到的沉淀物，加Tris缓冲NH4Cl(3ml/108细胞)溶液，以溶解红细胞，处理时间为1min，加50ml冷Hank’s溶液迅速洗去Tris缓冲NH4Cl溶液，以1500rpm转速离心8min；6)倾出上层清液，沉淀加入10ml Gey’s平衡盐溶液制成细胞悬液；7)用长针头缓慢向50ml离心管中依次加入10ml的28.7％wt/v Percoll(聚乙酰胺吡咯烷酮)，10ml 17.2％wt/v Percoll，10ml Gey’s平衡盐溶液和10ml细胞悬液，室温下1500rpm离心15min，收集17.2％wt/v Percoll和28.7％wt/v Percoll交界面的细胞，得到猪的肝干细胞。
经台盼蓝染色测定其活率为99％，经计数收获5.2×107的猪肝干细胞。
权利要求
1.一种分离猪肝干细胞的方法，其包括如下步骤1)按常规方法进行猪肝大部分切除术；2)术后饲养5～10天，每天向步骤1)处理的试验猪的腹腔注射30～80ml含100 IU抗生素的10wt％葡萄糖溶液；3)取出试验猪的肝组织，置于冰浴的平皿内，剪除被膜血管，使用冷Hank’s平衡盐溶液洗涤，剪碎肝组织块；4)加入50ml含0.02～0.03wt％EDTA的0.020～0.040wt％胶原酶，在37℃下于恒温振荡器上消化15～20分钟，加等体积Hank’s平衡盐溶液终止消化；5)过滤除去非细胞纤维成分和消化不完全的组织块，以500～1000rpm转速离心3～5min，分出的上清液再以1500rpm转速再离心5～10min；6)向步骤5)得到的沉淀物加入50ml的DMEM培养基，在37℃于恒温振动器上消化15～20分钟，消化1～3次，然后以1500rpm转速离心8～12min；7)向步骤6)得到的沉淀物，按3ml/108细胞的量加入含NH4Cl的Tris缓冲溶液，处理1～5min，再加入50ml冷Hank’s溶液洗涤后，以1500rpm转速离心5～10min；8)倾出上层清液，沉淀物加入10ml Gey’s平衡盐溶液，制成细胞悬液；9)向离心管中依次加入10ml的28.7％wt/v聚乙酰胺吡咯烷酮，10ml 17.2％wt/v聚乙酰胺吡咯烷酮，10ml Gey’s平衡盐溶液和10ml步骤8)制得的细胞悬液，室温下以1500rpm转速离心15～20min，收集17.2％wt/v聚乙酰胺吡咯烷酮和28.7％wt/v聚乙酰胺吡咯烷酮交界面的细胞，得到猪的肝干细胞。
2.按权利要求1所述的分离猪肝干细胞的方法，其特征在于，所述步骤1)的猪肝大部分切除术，其步骤如下a)按每公斤试验猪体重使用10～25mg/kg量的戊巴比妥钠，对试验猪进行腹腔麻醉；b)对所用手术器械进行高压灭菌，手术间紫外消毒；c)剪去试验猪腹腔体表毛发，用70～75wt％酒精对试验猪体表消毒，铺巾；d)剪开表皮，再解剖腹腔；e)用止血钳固定好表皮和腹腔肌，将0.90wt％生理盐水滴加到腹腔中，将肠系膜推到左侧，加0.90wt％生理盐水，用无菌纱布包裹肠系膜；f)剪开肝脏包膜，使猪的左肝小叶和中叶游离出来；g)用缝线结扎好左、中叶门静脉和肝动脉；h)切除肝左小叶和中叶，向腹腔补充含抗生素的生理盐水；i)分别用缝线缝合内皮和外皮。
3.按权利要求2所述的分离猪肝干细胞的方法，其特征在于，所述步骤h)的抗生素为青霉素G。
4.按权利要求1所述的分离猪肝干细胞的方法，其特征在于，所述步骤2)的抗生素为青霉素或庆大霉素。
5.按权利要求1所述的分离猪肝干细胞的方法，其特征在于，所述步骤6)的DMEM培养基包括0.008～0.012％wt/v蛋白酶E、0.010～0.012％wt/v胶原酶和0.0035～0.0045％wt/v脱氧核糖酶I。
全文摘要
本发明涉及一种分离猪肝干细胞的方法，该方法结合了大部分肝切除、酶消化与密度梯度离心法，分离出猪肝干细胞，其步骤包括大部分肝切除促进肝再生、胶原酶将肝组织消化为单个细胞、离心去除肝内的成纤维细胞、蛋白酶E特异性消化肝实质细胞，而保留肝非实质细胞、Percoll密度梯度离心进一步纯化。本发明提供的方法能获得纯度高、数量多且活性好的猪肝干细胞，为猪肝干细胞的基础研究和临床应用提供大量的细胞来源。
文档编号C12M3/00GK1594553SQ0315680
公开日2005年3月16日 申请日期2003年9月8日 优先权日2003年9月8日
发明者丰美福, 何祖平 申请人:中国科学院动物研究所