专利名称：母系遗传耳聋线粒体基因1555位a→g突变的检测方法及其试剂盒的制作方法
技术领域：
本发明涉及基因工程技术领域，具体是涉及母系遗传耳聋线粒体基因1555位A→G突变的检测方法。本发明还涉及制备根据该方法的体外检测母系遗传耳聋线粒体基因1555位A→G突变的试剂盒，以及该试剂盒在检测所说的A→G突变中的应用。
背景技术：
氨基糖甙类抗生素(链霉素、庆大霉素、卡那霉素、妥布霉素及小诺霉素等)因其广谱高效的抗菌作用以及低廉的价格在临床上被广泛用于控制革兰氏阴性和阳性菌感染，但此类抗生素具有严重的耳毒性副作用，可使患者发生不可逆转的听力损失。近十年来研究发现，部分氨基糖甙类抗生素致聋患者有母系遗传家族史，并与线粒体DNA12SrRNA基因(以下简称为线粒体基因，或mtDNA)第1555位A→G均质性点突变有关(PrezantTR等，Nat Genet,1993，4289-294；袁慧军等，中华耳鼻咽喉科杂志，1998，3367-70)。单次剂量的氨基糖甙类药物应用即可导致携带此突变个体的重度听力损失。根据目前己有的研究结果可知，几乎携带此突变的个体在应用不同剂量的氨基糖甙类抗生素后均发生严重或较严重的听力损失，是后天性获得性耳聋发生的重要原因。鉴于这一耳聋的有明确的基因变化和诱发因素，使得这种耳聋成为一种可以预防的疾病。
在中国己报道的线粒体基因1555A→G(mtDNA1555A→G)突变母系遗传耳聋家系己超过50个，各家系发病人数从2-50人不等，考虑到尚有很多同类家系尚未被发现报道，以及此突变在散发性耳聋的致病机制中占有一定的比例，对这种耳聋的预防变得更为重要。其预防的关键环节在于通过筛查，检测发现携带mtDNA1555A→G突变的个体，绝对禁止此类个体接触氨基糖甙类抗生素，从而避免严重的耳毒性反应发生。
自1993年以耒，对此突变的检测除了直接测序外，最常用的筛选方法为BsmA1(Alw261)酶切法(Fische1-Ghodsian等，AmJOtolaryngol，1993，14399-403；Fischel-Ghodsian等，AmJOtolaryngol，1997b，18173-178；袁慧军等，中华耳鼻咽喉科杂志，1998，3367-70)。在国内外，普遍应用限制性酶BsmAI(Alw26I)酶切配合序列分析鉴定有无mtDNA1555A→G突变，酶切鉴定方便快捷，结果可靠，但不足的是BsmAI(Alw26I)价格较贵，与常用的限制性酶相比，价格差异达50-100倍，因此，迫切需要一种简单、快速、准确而且成本低的检测方法，以满足对mtDNA1555A→G突变进行广泛筛查的需要。
发明内容
本发明的目的是针对目前检测mtDNA1555A→G突变的方法所存在的缺点，提供一种简单、快速、成本低的检测母系遗传性耳聋mtDNA1555A→G突变的方法；本发明的另一个目的是提供检测母系遗传性耳聋mtDNA1555A→G突变的试剂盒；本发明还有一个目的是提供本发明的试剂盒在预防母系遗传性耳聋中的应用。
本发明的目的通过下述的方案实现使用GenetoolLite程序(美国Biotools公司提供的软件)协助设计引物，通过PCR扩增，在被测样本的PCR扩增片段上产生定点突变，从而在该基因的1555位邻近引入一个包括1555位在内的新的限制性酶切位点，然后用相应的限制性酶消化，检测该突变的存在。其中所设计的引物中，正向引物是线粒体DNA的核苷酸1463-1482，其序列为序列表中的SEQIDNO1；反向引物是线粒体DNA的核苷酸1575-1556，其中1557位的A置换为C，其序列为序列表中的SEQIDNO2；引入的新的限制酶位点为HaeIII，其识别序列位于线粒体DNA的核苷酸1554-1557。本发明人还利用本发明的方法和设计的引物提供用于体外检测母系遗传耳聋线粒体基因1555位A→G突变的试剂盒，用于体外检测母系遗传耳聋线粒体基因1555位A→G突变，该试剂盒含有1.提取血样DNA的试剂；2.PCR扩增反应试剂，包括dNTP、10XPCR缓冲液、Mg++、三蒸水、Taq酶；3.等比例混合的权利要求2所述的正向引物和反向引物；4.限制性酶HaeIII及其配套的缓冲液；5.阳性标本对照、阴性标本对照，以及6.使用说明书。
在本发明的实施方案中，引物设计的指导思想是在1555位点邻近的2-4个碱基引入一个碱基替换，造成可能的能够鉴别mtDNA1555野生型(A)和突变型(G)的新的限制性酶切位点。使用GenetoolLite程序协助设计引物，设计原则为根据己知的线粒体基因的序列，使正向引物的3’末端位于1554位，反向引物在1555位的下游约120bp处，或使反向引物的3’末端位于1556位，正向引物在1555位的上游约120bp处，从而使PCR扩增后的产物包含1555位核苷酸(参照图1)；同时分别在1552、1553和1557、1558位引入可能的碱基置换，使形成的新的限制酶识别序列中包含1555位核苷酸，然后用enetoolLite程序检索出能鉴别线粒体基因1555野生型(A)和1555突变型(G)的新的限制性酶位点。
应用GenetoolLite程序将1553、1552位点分别进行所有可能的碱基替换，未发现能够鉴别1555A→G突变型和野生型的新增限制性酶切位点；将1557、1558位点分别进行所有可能的碱基替换时，GenetoolLite程序发现将1557位点的A替换为C时，在mtDNA1555A→G突变型分子中造成限制性酶HaeIII的识别序列(GGCC)，其切点在1555和1556之间，而在mtDNA1555野生型分子中无此序列(其相应的序列为GACC)。由此设计出反向引物R1为nt1575-nt1556，其中3’端第二个碱基(1557)为异配碱基(T-G)；正向引物F1为nt1463-1482。F1R1扩增子长113bp。
用以上设计的引物F1R1，以被测样本的DNA为模板，通过PCR扩增后能够获得明亮清晰的略大于100bp条带，证明反向引物3’端第二个碱基与模板异配并没有影响PCR的效率。F1R1PCR产物包含mtDNA1555位点，若模板为1555A→G突变型分子，则113bp的PCR产物存在HaeOII酶切位点，HaeOII酶切后获得93bp和20bp两个条带；若模板为mtDNA野生型分子，则113bp的PCR产物不存在HaeOII酶切位点，不能被HaeOII切开，酶切后仍是113bp一个条带。利用此区别，可以对1555A→G突变型分子进行简单、快速的测定。
本发明者还根据本发明中设计的引物序列，通过人工合成(通过给定序列由自动化核酸合成仪合成)获得引物，并与提取血样DNA的试剂；PCR扩增反应试剂，包括dNTP、10×PCR缓冲液、Mg++、三蒸水、Taq酶；限制性酶HaeOII及其配套的缓冲液；阳性标本对照、阴性标本对照，以及使用说明书组合起来，提供了用于体外检测母系遗传耳聋线粒体基因1555位A→G突变的试剂盒，其主要功能在于将所有试剂集成在一个小盒内，使得DNA提取、核酸片段扩增、酶切鉴定可以在试剂盒提供的试剂基础上顺序完成。根据取血方式或被测样本形式的不同，本发明的试剂盒有三种类型可供选用，三种类型中除了提取血样DNA的试剂外，其余组分都相同。一型试剂盒的提取血样DNA的试剂为用作DNA裂解液的溶液1，其主要成分是Chelex(ABI公司产品)，适用于足跟血血片被测样本；二型试剂盒的提取血样DNA的试剂为外周血DNA试剂盒(选用市售产品配套使用)，适用于外周血被测样本；三型试剂盒不含提取血样DNA的试剂，适用于直接提供DNA的被测样本。
用本发明的方法检测母系遗传耳聋线粒体基因1555位A→G突变与现有技术BsmAI酶切鉴定方法相比有以下优点1.本发明的HaeIII酶切法的操作步骤及所需时间与BsmAI酶切鉴定方法基本相同，但BsmAI酶需要从国外购买，供应不及时，而且价格昂贵，而HaeOII限制性酶国内供应源丰富，成本极低，其价格仅为BsmAI的1/50-1/100，这些特点为在全国范围内实行mtDNA1555A→G突变的筛查和抗生素应用前预防性检测提供了便利的条件，从而从根本上减少对氨基糖甙类抗生素敏感的个体发生药物性耳聋的机会。
2.本发明的方法用HaeOII酶切突变型分子，A→G突变型分子能被HaeIII切开，酶切阳性直接表示mtDNA1555A→G突变的存在；而BsmAI切的是野生型分子，A→G突变型分子不能被BsmAI切开，在这种情况下，被测样本除了A→G突变的可能外，不排除其他突变的可能，因此，本发明的方法更直接、可靠。
图1是本发明的引物设计方案示意图。
A正向引物的3’末端位于1554位，反向引物在1555位的下游约120bp处；B反向引物的3’末端位于1556位，正向引物在1555位的上游约120bp处；图1中，1表示mtDNA；2表示正向引物；3表示反向引物；O表示核苷酸位置。
图2是母系遗传耳聋家系13的系谱图。图中□代表男性个体；O代表女性个体；黑色图标代表发病个体； 代表先证者；/代表已死亡的个体。
图3是HaeOII酶切法鉴定mtDNA1555A→G突变的2％琼脂糖凝胶电泳图。
泳道1-3、5-7mtDNA1555A-G突变患者；泳道4、8正常个体；泳道9分子量标志(100bp间隔)。
具体实施例方式
实施例一母系遗传耳聋家系线粒体基1555A→G突变的检测1.检测样本选择以母系遗传为传递特征的耳聋家系14个，总人数为301人，其中耳聋患者共84人，受检者中，耳聋患者为33人，与耳聋家系无关的正常听力个体11人，从被检个体提取外周全血DNA(袁慧军等，中华耳鼻咽喉科杂志，1998，33(2)67-70；李为民等，临床耳鼻咽喉科杂志，2001，15(增刊)53-58)，作为检测样本。14个家系综合情况见表1，其中家系13的系谱图见图2。其余家系的疾病传递方式均与家系13类似，每个家系均有患者应用过氨基糖甙类抗生素，特点为女性患者若应用过AmAn均发病早、耳聋程度重，若未用过AmAn则听力正常或耳聋发病晚，程度轻。
2.引物设计使用GenetoolLite程序协助设计改良引物，根据己公开的线粒体基因剑桥序列(CambridgeSequence)，引物的设计方案有2种(1)使正向引物的3’末端位于1554位，反向引物在1555位的下游约120bp处(参照图1，A)；(2)使反向引物的3’末端位于1556位，正向引物在1555位的上游约120bp处(参照图1，B)，从而使PCR扩增后的产物包含1555位核苷酸。同时分别在1552、1553和1557、1558位引入可能的碱基置换，使形成的新的限制酶识别序列中包含1555位核苷酸，然后用GenetoolLite程序检索出能鉴别线粒体基因1555野生型(A)和1555突变型(G)的新的限制酶位点。应用GenetoolLite程序将1553、1552位点分别进行所有可能的碱基替换，未发现能够鉴别1555A→G突变型和野生型的新增酶切位点；将1557、1558位点分别进行所有可能的碱基替换，GenetoolLite程序发现将1557位点的A替换为C时，在mtDNA1555A→G突变型分子中造成限制性酶HaeOII的识别序列(GGCC)，其切点在1555和1556之间，而在mtDNA1555野生型分子中无此序列(其相应的序列为GACC)。由此设计出反向引物R1为mtDNAnt1575-nt1556，即5′-ACTTACCATGTTACGACTGG-3′，其中3’端第二个碱基(1557)为异配碱基(T-G)，该序列设定为SEQIDNO2；另外，设计正向引物F1为mtDNAnt1463-1482，即5′-GGCCCTGAAGCGCGTACACA-3′，该序列设定为SEQIDNO1，F1R1扩增子长113bp。
3.PCR扩增反应根据上述设计的引物序列SEQIDNO1和SEQIDNO2，通过人工合成(通过给定序列由自动化核酸合成仪合成)得到正向引物F1和反向引物R1，并以上述提取的被测样本周边血DNA为模板，进行PCR扩增反应反应体系模板50ng引物F1，R1 各50ng10×dNTP5μl10×Buffer 5μlMg++终浓度1.5mmol/LTaq酶 1.0u加三蒸水至50μl体积。
反应条件95变性5分钟后，接着94℃变性30秒，50℃退火30秒，72℃延伸30秒，共进行30个循环，最后在72℃下再延伸7分钟。
用2％琼脂糖凝胶电泳检查产物。PCR扩增后F1R1能够获得明亮清晰的略大于100bp条带，证明反向引物3’端第二个碱基与模板异配并没有影响PCR的效率，F1R1PCR产物包含mtDNA1555位点，若模板为1555A→G突变型分子，则113bp的PCR产物存在HaeIII酶切位点，HaeIII酶切后获得93bp和20bp两个条带；若模板为mtDNA野生型分子，则113bp的PCR产物不存在HaeIII酶切位点，不能被HaeIII切开，酶切后仍是113bp一个条带。
4.HaeIII酶切检测被测样本的PCR扩增产物按下述条件检测1555A→G突变。酶切反应体系PCR产物 12-18μl10x缓冲液 3μlHaeIII限制性酶5-10uBSA 0.3μl三蒸水补足体积至30μl，35℃温育1小时。酶切反应物用2％琼脂糖凝胶检查。
5.结果如表1所示，在总共14个家系中，13个家系的33个耳聋患者的F1R1扩增产物(113bp)可以被HaeIII切成93bp和20bp两条带，表明其存在mtDNA1555A-G突变(参见图2的泳道1-3、5-7)。另一个家系内的一个耳聋患者的F1R1扩增产物不能被HaeIII切开，表明此家系内不存在mtDNA1555A-G突变(表1中的家系3)，11名与患者无血缘关系的家系内个体以及正常对照个体的F1R1扩增产物均不能被HaeIII切开(参见图2的泳道4、8)，表明其不存在mtDNA1555A→G突变。
6.HaeIII酶切法可靠性的检验所有被检测个体的1555位点均经过BamAI(Alw261)酶切检验(袁慧军等，中华耳鼻咽喉科杂志，1998，33(2)67-70；李为民等，临床耳鼻咽喉科杂志，2001，15(增刊)53-58)，如表1所示，其结果证明根据HaeIII酶切表明其携带1555A→G突变的33个耳聋患者，其含有1555位点的扩增产物均不能被BamAI切开；而HaeIII酶切表明不携带1555A→G突变的11个正常个体，其含有1555位点的扩增产物均能被BamAI切开。家系3亦表现为母系遗传性氨基糖甙类敏感的耳聋家系，此家系的一个女性受检者HaeOII酶切表明其不携带1555A-G突变，经BamAI(Alw26I)酶切法进一步检测，此患者及其两个妹表1母系遗传家系情况及线粒体1555位点检测结果
1AmAn氨基糖甙类抗生素妹、及她们的三个子女均表明无1555A-G突变。两种酶切方法的吻合率为100％，说明使用本发明方法检测1555A→G突变的可靠性和稳定性。
此外，每个家系均选取至少1例患者经酶切检测表明具有1555A→G突变的DNA标本进行1555位点的直接测序检查，结果除家系3外，测序结果均显示mtDNA1555位点发生A→G的替换，与HaeIII酶切法的结果完全一致。
实施例二体外检测母系遗传耳聋线粒体基因1555位A→G突变的一型试剂盒及其应用1.适用于足跟血片的一型试剂盒(100人份)包含以下组分(1)溶液I(主要成份为5％Chelex)25ml；(2)PCR试剂(包括8mM dNTP 150μl、10×PCR缓冲液1ml、25mM Mg++溶液1ml、三蒸水1ml×4管、5u/μl Taq酶25μl)；(3)正向引物mtDNAnt1463-1482；反向引物mtDNAnt1575-1556，其中mtDNAnt1557位碱基A突变为G，正反向引物按等比例混合(浓度均为10μM)，共150μl；(4)限制性酶HaeOII，20u/μl，110μl及配套的10x缓冲液1ml；(5)阳性对照标本125μl、阴性对照标本125μl；(6)使用说明书。
2.检测对象选择家系13(见表1)为被测家系，该家系共有4代25个成员，共有8名耳聋患者，发病前均有氨基糖甙类抗生素用药史。本实施例选择其中4名耳聋患者为受检对象。
3.检测方法及结果按照本试剂盒的使用说明书，用溶液I(主要成份为5％Chelex)提取受检者的足根血血片DNA，并取50ng作为模板，加入引物混合物100ng、10×dNTP 5μl、10x缓冲液5μl、Mg++终浓度为1.5mmol/L，加三蒸水至50μl后，加1.0u Taq酶，95℃变性5分钟后，接着94℃变性30秒，50℃退火30秒，72℃延伸30秒，共进行30个循环，最后在72℃下再延伸7分钟。按同样的PCR反应条件，用试剂盒内提供的1555A→G阳性模板和阴性模板同时作阳性和阴性对照PCR反应，并设立无模板PCR空白对照管，反应后用2％琼脂糖凝胶电泳检查扩增产物，结果，无模板对照物未见扩增产物，4名患者及阳性、阴性对照标本的PCR产物均为113bp。PCR产物用HaeIII酶切检测，酶切反应体系为30μl，包括10x缓冲液3μl100×BSA 0.3μlHaeIII 20uPCR产物 12-18μl以三蒸水补足体积，30℃温育1小时。酶切反应物用2％琼脂糖凝胶电泳检查，4名耳聋患者及阳性对照的PCR产物可见93bp和20bp条带，表明mtDNA1555A→G突变阳性；阴性对照仅见113bp条带，表明无mtDNA1555A→G突变。进一步用Alw26酶切和测序证实此4名患者均携带mtDNA1555A→G突变。
实施例三体外检测母系遗传耳聋线粒体基因1555位A→G突变的二型试剂盒及其应用本实施例选择家系2(参见表1)的6名耳聋患者中的3名为受检对象。除了受检样本为周边血，以及试剂盒中的血样DNA提取剂为市售的周边DNA提取试剂盒，并用该试剂盒提取周边血DNA以外，试剂盒中其他组分和检测方法与实施例二相同。检测结果见表1。
实施例四体外检测母系遗传耳聋线粒体基因1555位A→G突变的三型试剂盒及其应用本实施例选择家系11(参见表1)的6名耳聋患者中的3名为受检对象。除了受检样本为从血样提取的DNA，以及试剂盒中不含血样DNA提取剂以外，试剂盒中其他组分和检测方法与实施例二相同。检测结果见表1。
本发明用于体外检测母系遗传耳聋线粒体基因1555位A→G的突变。
母系遗传耳聋线粒体基因.ST25SEQUENCE LISTING<110>戴，朴<120>母系遗传耳聋线粒体基因A-G突变的检测方法及其试剂盒<130>Patentln3.1<160>2<170>Patentlnversion3.1<210>1<211>20<212>DNA<213>Homo sapiens<400>1ggccctgaag cgcgtacaca 20<210>2<211>20<212>DNA<213>Homo sapiens<400>2acttaccatg ttacgactgg 20
权利要求
1.一种母系遗传耳聋线粒体基因1555位A→G突变的检测方法，其特征在于该方法使用Genetool Lite程序协助设计引物，通过PCR扩增，在被测样本的PCR扩增片段上产生定点突变，从而在该基因的1555位邻近引入一个包括1555位在内的新的限制性酶位点，然后用相应的限制性酶消化，检测该突变的存在。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于其中所设计引物中，正向引物是线粒体DNA的核苷酸1463-1482，其序列为序列表中的SEQIDNO1；反向引物是线粒体DNA的核苷酸1575-1556，其中1557位的A置换为C，其序列为序列表中的SEQIDNO2。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于其中PCR扩增后引入的新的限制性酶位点为HaeIII。
4.制备根据权利要求2所述方法的体外检测母系遗传耳聋线粒体基因1555位A→G突变的试剂盒，其特征在于该试剂盒含有(1)提取血样DNA的试剂；(2)PCR扩增反应试剂，包括dNTP、10×PCR缓冲液、Mg++、三蒸水、Taq酶；(3)等比例混合的权利要求2所述的正向引物和反向引物；(4)限制性酶HaeIII及其配套的缓冲液；(5)阳性标本对照、阴性标本对照；(6)使用说明书。
5.根据权利要求4所述的试剂盒，其特征在于其中所说的提取血样DNA的试剂为提取足根血DNA的溶液I，其主要成分为Chelex。
6.根据权利要求4所述的试剂盒，其特征在于其中所说的提取血样DNA的试剂为外周血DNA提取试剂盒。
7.根据权利要求4所述的试剂盒，其特征在于其中包含除所说的提取血样DNA的试剂以外的其他组成和使用说明书。
全文摘要
本发明涉及母系遗传耳聋线粒体基因1555位A→G突变的检测方法。该方使用GenetoolLite程序协助设计改良引物，通过聚合酶链反应引入新的限制酶位点HaeIII，再用相应的酶切反应检测A→G突变。本发明还涉及制备根据该方法的体外检测母系遗传耳聋线粒体基因1555位A→G突变的试剂盒，以及该试剂盒在检测所说的A→G突变中的应用。该方法简单、成本低，检测结果直接、可靠，适用于对母系遗传耳聋线粒体基因1555位A→G突变的大规模的筛查或预防性检查。
文档编号C12Q1/68GK1490415SQ0315676
公开日2004年4月21日 申请日期2003年9月10日 优先权日2003年9月10日
发明者戴朴, 袁慧军, 李为民, 曹菊阳, 戴 朴 申请人:戴朴, 戴 朴