专利名称：一种添加羟胺提高发酵法制备谷氨酰胺转胺酶产量的方法
技术领域：
一种添加羟胺提高发酵法制备谷氨酰胺转胺酶产量的方法，涉及吸水链霉菌发酵制备谷氨酰胺转胺酶。
背景技术：
谷氨酰胺转胺酶(Microbial transglutaminase，简称MTG)，催化蛋白质分子内的交联、分子间的交联、蛋白质和氨基酸之间的连接以及蛋白质分子内谷氨酰胺酰胺基的水解，从而进一步改善蛋白质功能性质，提高蛋白质的营养价值，生产出满足人们需求的新型蛋白食品。现在谷氨酰胺转胺酶已经广泛应用在许多方面在肉制品加工中，谷氨酰胺转胺酶的交联作用将一些低价值的碎肉进行重组，从而改善其外观、结构、风味，以提高其营养价值和市场价值；在食品加工过程中，谷氨酰胺转胺酶可以保护食品蛋白质中的赖氨酸避免发生化学反应，从而保护限制性氨基酸；在乳制品加工中，谷氨酰胺转胺酶提高蛋白质的营养性；在医药工业中，谷氨酰胺转胺酶包埋脂类或脂溶性物质，形成耐热耐水性的膜；在非肉类的豆类食品中，谷氨酰胺转胺酶提高食品的弹性和持水能力；在纺织行业，谷氨酰胺转胺酶还被用来提高蚕丝织物的品质。
现在生产MTG的方法主要是微生物发酵法生产，目前商业化的谷氨酰胺转胺酶产品主要由日本味之素等公司生产。国内用微生物生产谷氨酰胺转胺酶尚停留在研究阶段，菌种主要是茂原链霉菌，生产水平很低。
发明内容
本发明的目的是一种添加羟胺提高发酵法制备谷氨酰胺转胺酶产量的方法。
本发明的技术方案菌种吸水链霉菌(Streptomyces hygroscopicus)WSH03-13，CCTCC NO203062(中国专利03152956.9 2003年.)，由江南大学生物工程学院环境生物技术研究室保藏和提供。
培养基麦汁斜面培养基(g/L)麦汁50，葡萄糖20，酵母膏20，琼脂20，pH7.0。
种子培养基(g/L)甘油20，葡萄糖20，酵母膏5，NaH2PO45，Na2HPO45，MgSO45，pH7.0。
发酵培养基(g/L)淀粉15，葡萄糖15，蛋白胨25，酵母膏5，碳酸钙5，NaH2PO45，Na2HPO45，MgSO45，pH7.0。
培养方法将成熟的孢子接种到麦汁斜面上，32℃下培养7-8d。待孢子成熟后，刮取斜面上的孢子，用无菌水制成孢子悬液接种于种子培养基中，32℃摇床培养至对数生长后期。吸取种子培养液，按2-4％的接种量接种于发酵培养基中，32℃摇床培养48h。
谷氨酰胺转胺酶活力的测定方法发酵液经离心后的清液稀释5倍后用于活力的测定。
谷氨酰胺转胺酶活力采用分光光度法在37℃下测定。吸取0.4ml稀释样品于试管中，加入1ml试剂A，37℃水浴保温10min，加入0.4ml试剂B，终止反应，525nm比色。试剂A将100mg底物CBZ-GLN-GLY(Nalpha-Carbobenzyloxy-Glutamine Glycine)完全溶解于2ml 0.2N的NaOH中，并加入4ml a，2mlb，2ml c，调pH为6.0。(a0.2M三羟甲基氨基甲烷盐酸(Tris-HCl)缓冲液，pH6.0；b1M羟胺；c0.01M GSH(还原型谷光甘肽))。试剂B3N HCl，12％TCA(三氯乙酸)，5％FeCl3·6H2O(溶于0.1N HCl中)按1∶1∶1混合配制。一个单位谷氨酰胺转胺酶酶活定义(u/mL)37℃时每分钟催化形成1μmol L-谷氨酸-γ-单羟胺酸的酶量。
提高谷氨酰胺转胺酶产量的培养方式谷氨酰胺转胺酶的测定原理是羟胺与底物Nα-CBZ-GLN-GLY反应生成L-谷氨酸-γ-单异羟肟酸，与铁离子结合形成络合物显色，用比色法测定。因此认为羟胺是极有可能是谷氨酰胺转胺酶合成的诱导物。系统中诱导物的存在能够使酶提前处于工作状态，使其产酶也处于诱导状态从而促进产酶。
在发酵过程中，适时添加适量的羟胺可以促进产酶。通过在发酵过程中添加羟胺在发酵至36-40h添加0.3-0.7mmol/L羟胺，促进了系统产酶，发酵终了时发酵液中谷氨酰胺转胺酶的酶活水平为5.1U/mL。
本发明的有益效果本发明选用的吸水链霉菌(Streptomyceshygroscopicus)WSH03-13合成的谷氨酰胺转胺酶为胞外酶，并且是迄今为止已报道过的热、碱稳定性和蛋白质交联特性最好的谷氨酰胺转胺酶，用于食品加工以及纺织行业具有很大的潜力。所用的羟胺价格低廉，用量少，显著提高了谷氨酰胺转胺酶的产量，摇瓶培养的实验水平达国内领先水平。
具体实施例方式
实施例1在发酵的38h添加0.5mmol/L的羟胺，发酵结束时，发酵液中谷氨酰胺转胺酶的产量为5.3U/mL，比不加羟胺的对照例提高了32.5％。不添加羟胺的发酵液中谷氨酰胺转胺酶的产量为4.0U/mL。
实施例2在发酵的36h添加0.3mmol/L的羟胺，发酵结束时，发酵液中谷氨酰胺转胺酶的产量为4.6U/mL。
实施例3在发酵的40h添加0.7mmol/L的羟胺，发酵结束时，发酵液中谷氨酰胺转胺酶的产量为5.1U/mL。
权利要求
1.一种提高发酵法制备谷氨酰胺转胺酶产量的方法，其特征是采用吸水链霉菌(Streptomyces hygroscopicus)WSH03-13作为出发菌株，经液体发酵制备谷氨酰胺转胺酶，通过在发酵过程中添加羟胺，实现了谷氨酰胺转胺酶的高表达。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征是在发酵过程中添加羟胺，发酵至36-40h在发酵液中添加0.3-0.7mmol/L的羟胺。
全文摘要
一种添加羟胺提高发酵法制备谷氨酰胺转胺酶产量的方法，涉及吸水链霉菌发酵制备谷氨酰胺转胺酶。本发明采用吸水链霉菌为发酵菌株，经斜面培养和种子培养后，接种在发酵培养基中经液体发酵制备谷氨酰胺转胺酶，通过在发酵过程中添加羟胺，实现了谷氨酰胺转胺酶的高表达。本发明的优点是所用羟胺价格低廉，用量少，可显著提高谷氨酰胺转胺酶的产量，在其它培养条件相同的情况下，本发明比不添加羟胺的对照例产量提高约30％，达到发酵法制备谷氨酰胺转胺酶的先进水平。
文档编号C12P21/02GK1597928SQ20041004169
公开日2005年3月23日 申请日期2004年8月12日 优先权日2004年8月12日
发明者陈坚, 张程杰, 堵国成, 李寅 申请人:江南大学