专利名称：一种可消除非特异性条带的pcr方法以及利用该方法制备的rt－pcr芯片的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种适用于芯片技术获得特异基因表达(包括编码区、转录组、表达谱比较)、诊断的PCR(RT-PCR、PCR)方法以及利用该方法制备的RT-PCR芯片，特别是一种可消除非特异性条带、一步法精确获得目的基因的PCR方法以及利用这种方法制备的RT-PCR芯片，以构建一个高精度、高通量获得特异基因表达(包括编码区、转录组、表达谱比较)、诊断的技术平台。
背景技术：
随着人类基因组DNA序列草图的提前完成，人类进入后基因组时代。在后基因组时代，首先要求利用人类基因组DNA序列信息来研究基因及其蛋白质产物的结构与功能，更进一步则是其在细胞和组织发生、发展、衰老、死亡以及正常与疾病状态下的功能机制。每类细胞或组织只表达一套特定的基因(但在受刺激或分化时可能有所改变)，由于通常情况下许多生物学特性取决于各种基因表达水平的协同作用，针对单一基因变化的研究就显示出很大的局限性。只有全面掌握各种基因不同时期的表达差异、丰度差异、动态变化，才能了解基因型和表型的互动关系。因而亟需一种大规模、高通量的研究策略。生物芯片技术作为一种新兴生物技术，虽然各国学者已经看到了它的重要应用价值，但由于其高假阳性率、错配率、高成本、低重复性使该技术的迅速发展和广泛应用受到了一定的限制。
理论上讲，合理使用长度为17个核苷酸的引物，它的预期频率是平均每隔417＝17 179 869 184bp才会有一个结合点(或一段同源序列)，其长度超过了人类DNA总长度的5倍以上，可见17个核苷酸的引物在人类基因组上只可能有一个结合位点。所以使用17个核苷酸的引物17个核苷酸的引物对人类基因组DNA作PCR扩增，就有可能获得单一的特异性扩增条带。然而，事实并非如此，由于PCR反应的高度敏感性，引物与摸板不严格匹配，延伸反应也能进行，即使再提高退火温度也不能消除非特异反应。因此，由不具有3’-5’外切酶活性的Taq酶介导的常规PCR技术引物延伸反应在DNA扩增中可出现非特异性条带。PCR的延伸是从两个引物的3’端开始的，并决定着PCR产物的特异性；而5’端则限定着PCR产物的长度。过去使用的不具有3’-5’外切酶活性的Taq酶无校正功能，PCR产物的特异性由退火温度决定。在实际研究发现在Taq酶或其它低保真DNA聚合酶介导的引物延伸反映中，3’末端配对与不配对引物在大跨度的退火温度范围内均能被延伸，常需要提高退火温度来提高产物的特异性。然而，在不同反应体系中延伸反应产物保真要求的退火温度是不同的。在高变化的退火温度范围内，Taq酶等低保真DNA聚合酶介导无法去除，因此无法适用芯片技术中均一反应条件的要求，也是导致试验芯片中扩增的DNA产物错误；率或假阳性率高达30％-50％的直接原因。近年发现的Pfu高保真DNA具有严格的模板依赖性和3’-5’外切酶活性(校正活性)，能依据模板用3’-5’校正酶活性将引物3’端多个不配对碱基校正成与模板匹配而扩增出非目的性产物，并在较宽的退火温度范围内仍适用。所以单用Pfu高保真DNA聚合酶介导的引物延伸反应同样会出现非特异性条带，这也是该类高保真DNA聚合酶不能广泛使用的缺陷。
无论在体内或体外，聚合酶维持复制忠实性是校正酶活性位点和聚合酶活性位点高度协调一致的结果；在引导链结合模板及聚合酶结合后，聚合或复制倾向开始。其中体内复制高度忠实性主要是通过校正酶切活性位点的校正功能来实现的。通过校正酶切点核实引导链是否与模板匹配，并将不与模板匹配的引导链纠正得和模板一致后开始复制过程，这在引发和复制延伸过程中均有表现。而对聚合过程中难以纠正的错误，则可印发聚合或复制过程的关闭，从而维持子代与模板高度一致。
发明内容
本发明的目的之一是提供一种可精确获得目的产物，有效消除非特异性条带的PCR方法。利用本发明，可以精确对基因表达进行扩增、检测和定量分析，可用于制备高精度、高通量PCR(RT-PCR、PCR)芯片，以用于检测基因表达。
为了实现上述发明目的之一，本发明所采用的技术方案是一种可消除非特异性条带的PCR方法，具有常规PCR基本步骤，其特征是在目的基因的引物设计时，引物3’末端一个或多个碱基采用硫代磷酸化修饰；延伸反应所用的聚合酶为具有最强的3’-5’外切酶活性的Pfu高保真DNA聚合酶。
本发明目的之二是提供一种利用上述方法制备的RT-PCR芯片，以用于检测基因表达(包括基因表达与否及表达丰度定量检测)。
为了实现上述发明目的之二，本发明所采用的技术方案是一种利用可消除非特异性条带的PCR方法制备的RT-PCR芯片，其特征是引物下游为PolyA18-20个+3’末端碱基硫代修饰的A/G/C/T共4组；引物上游根据各种基因终止编码区设计，其每孔反应中加入荧光或其它可检测的标记物进行引物延伸反应产物实行适时、定量检测，以产物的有无或多少指示基因表达与否及基因表达丰度。
本发明的检测手段使用SYBR Green I荧光染料，用荧光适时PCR仪或常规琼脂糖电泳。
由于为Pfu高保真DNA聚合酶具有严格的模板依赖性和3’-5’外切酶活性(校正功能)，能有效识别引物3’末端一个或多个不配对碱基，加上引物3’末端硫化修饰后耐酶切的特性，因此Pfu高保真DNA聚合酶3’-5’外切酶活性不能将经过硫代磷酸化修饰的引物3’末端切除，使得Pfu高保真DNA聚合酶不能对引物3’末端不匹配或错配碱基进行纠正，而最终“关”闭引物与模板错配的DNA聚合反应，只允许引物3’端8bp完全与模板匹配的聚合得以延伸，并在延伸中保持与模板的高度忠实性，最终得到特异目的产物。该方法可以称之为实现PCR(PT-PCR、PCR)产物特异性效率的“开/关”机制。由于具有最强的3’-5’外切酶活性的Pfu高保真DNA聚合酶可以识别并关闭引物3’末端8bp内任一个或多个碱基不匹配的延伸反应。因此在各种PCR反应中，该方法只允许与引物3’末端8bp内完全匹配的模板得以延伸，并在延伸中保持与模板的高度忠实性。应用该方法可消除非特异产物，目的产物以双链形式出现。而SYBR Green I荧光染料可特异结合DNA双链发出荧光，因此可用荧光PCR仪对产物进行适时、精确定量分析，从而可高通量、平行性、高精度分析整个基因转录组、表达组和基因组(基因表达的有无、丰度的高低)。
本发明与现有PCR方法相比，具有如下优点和效果1、本发明是对传统的、产生非特异性条带的PCR(RT-PCR、PCR)方法的一次重要的改进，它的优点是可以消除非特异性条带，高度特异。
2、可广泛用于分子生物学研究领域，尤其适用于PCR(RT-PCR、PCR)中基因表达的扩增、检测、定量分析。
3、由于突破了在高变化的退火温度范围内Taq等低保真DNA聚合酶介导的非特异性产物无法去除的局限，本发明可用于制备高精度、高通量PCR(RT-PCR、PCR)，可有效去除试验芯片扩增中的错误率或假阳性率，用于检测基因表达，包括编码区/转录组及表达谱比较。
4、本发明简单、敬意、实用，便于推广。
图1是可特异性去除PCR(RT-PCR、PCR)中非特异性条带、一步法精确获得目的表达基因的实例。
具体实施例方式
下面结合附图和具体实施方式
对本发明作进一步说明。
利用本发明对Gaveolin-1基因进行扩增。图1中3(M)表示Marker，条带1和2分别表示基因Gaveolin-1全长和片段。
具体步骤如下第一步小鼠Gaveolin-1(小凹蛋白1)mRNA的提取和cDNA的合成，按照常规方法进行；第二步引物设计。本实施方式设计四中引物引物I3’端不匹配且末硫化修饰的引物(条带14-15，18)；引物II3’端不匹配而硫化修饰的引物(条带4-9)；引物III3’端匹配而末硫化修饰的引物(条带12-13)；引物IV3’端匹配且硫化修饰的引物(条带1-2，10-11，16-17)。
第三步DNA聚合酶的选择。
为了比较高保真DNA聚合酶和低保真聚合酶在RT-PCR中对产物的不同影响，分别对应的选择了Pfu高保真DNA聚合酶(条带1-2，4-5，8-9，14-17)和Taq低保真聚合酶(条带6-7，10-13，18)。
第四步RT-PCR。
反应条件为普通RT-PCR的反应条件94℃预变性3分钟，94℃变性30秒，52℃或60℃退火30秒，72℃延伸45秒，循环36次。
第五步琼脂糖凝胶电泳。
按常规方法进行，凝胶浓度2.0％。
结果图1中显示，Pfu聚合酶结合引物3’末端硫代修饰，配对引物的延伸产物呈现单一条带(条带1、2、16、17)，末见非特异性条带；而不配对引物不出现任何条带(条带4-5，8-9)，呈现高度特异性。在Taq酶介导的延伸反应中，无论引物是否配对(条带10-13与6-7，18)或引物是否硫代修饰(条带6-7，10-11与12-13，18)均可见非特异性条带。
权利要求
1.一种可消除非特异性条带的PCR方法，具有常规PCR基本步骤，其特征是在目的基因的引物设计时，引物3’末端一个或多个碱基采用硫代磷酸化修饰；延伸反应所用的聚合酶为具有最强的3’-5’外切酶活性的Pfu高保真DNA聚合酶。
2.一种利用权利要求1所述方法制备的RT-PCR芯片，其特征是引物下游为PolyA18-20个+3’末端碱基硫代修饰的A/G/C/T共4组；引物上游根据各种基因终止编码区设计，其每孔反应中加入荧光或其它可检测的标记物进行引物延伸反应产物实行适时、定量检测，以产物的有无或多少指示基因表达与否及基因表达丰度。
全文摘要
本发明公开了一种可消除非特异性条带、一步法精确获得目的基因的PCR方法以及利用这种方法制备的RT－PCR芯片。具体是指在PCR(RT－PCR、PCR)目的基因的引物设计时，引物3’末端一个或多个碱基采用硫代磷酸化修饰；延伸反应所用的聚合酶为具有Pfu高保真DNA聚合酶。由于具有最强的3’－5’外切酶活性的Pfu高保真DNA聚合酶可以识别并关闭引物3’末端8bp内任一个或多个碱基不匹配的延伸反应。因此在各种PCR反应中，只允许与引物3’末端8bp内完全匹配的模板得以延伸，并在延伸中保持与模板的高度忠实性。本发明构建了一个多用途、高精度、高通量、适用于芯片技术获得特异基因表达(包括编码区、转录组、表达谱比较)和诊断的技术平台。
文档编号C12Q1/68GK1718737SQ20041004503
公开日2006年1月11日 申请日期2004年7月9日 优先权日2004年7月9日
发明者杨惠龄, 廖端芳, 徐阳炎, 罗迪贤, 李凯 申请人:南华大学