专利名称：一种快捷构建amiRNA干扰载体的方法
技术领域：
本发明所涉及的技术领域为基础分子生物学领域，具体涉及到小干扰RNA载体的构建，其应用涉及到动物、植物、微生物。
背景技术：
体内的miRNA是基因表达调控的重要手段之一，在基因功能分析中，RNA干扰技术是实现基因转录后沉默(PTGS)的重要方式，而人工miRNA的构建与应用是成熟利用miRNA技术实现基因沉默的标志，具有较高的效率和特异性。关于人工miRNA构建方法最初采用了多轮PCR的方法，全部采用PCR方法进行构建人工miRNAI，此技术容易产生非特异性条带，需要设计多对引物，多次PCR整体思路复杂。后来发现了酶切连接法，但是用到了稀有的限制性内切酶，酶切位点不可选择，其使用受到了一定的限制，而且价格昂贵2;2009年报道了通过PCR反向扩增供给载体然后重组的方法，此方法操作步骤复杂而且无法避免将供给载体的部分序列构建到转基因载体中3。针对这些已有的方法存在的问题和不足，本方法采用typeIIS型限制性内切酶(此类内切酶识别位点与酶切位点不在同一位点)作为粘末端产生酶，直接将退火得到的miRNA中间部分与骨架侧翼部分进行连接，而且酶切连接一步法实现，无需凝胶回收酶切片段，简单、方便、快捷地将整个构建过程合并在一个体系中，只需1_2个小时即可完成。I
Schwab， R., et al., Highly specific gene silencing by artificialmicroRNAs in Arabidopsis.Plant Cell, 2006.18(5): p.1121—32Wang，X.， et al., A highly efficient method for construction of riceartificial MicroRNA vectors.Mol Biotechnol，2010.46(3): p.211—8
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发明内容
针对这些已有的方法存在的问题和不足，本发明提供了一种快捷构建人工小RNA载体的方法。本方法用于构建人工miRNA干扰载体，其特点是基于能够实现无缝连接的技术原理，将靶标序列与骨架序列进行连接，从而产生与天然miRNA前体在结构上一致的amiRNA前体。具体地，该方法采用了含有amiRNA前体骨架的载体以及含有正向靶标-环部骨架-反向靶标的DNA片段，所述载体上的两侧翼序列之间有一对相同但方向相反的typells型内切酶酶切序列，所述DNA片段两端含有预设的typeIIS内切酶酶切序列，并且载体上酶切产生的粘末端和合成的DNA上酶切产生的粘末端可以完全互补，通过此typeIIS酶切并连接酶切产物，即可完成载体构建。上述DNA片段可同通过将三条单链DNA退火并延伸得到，这三条分别为A序列:含有正向靶标和typells型内切酶酶切正向序列的单链DNA，B序列:中间骨架序列，C序列:含有反向靶标和typells型内切酶酶切反向序列的单链DNA，B序列的两端分别和A序列以及C序列的一端部分重叠。所述DNA片段的两个内切酶识别序列的排列方向为“正向-反向”的排列，所述载体上的两侧翼序列之间有一对分别为“反向-正向”排列的typells型内切酶识别序列。可以通过typells型内切酶和T4连接酶同时酶切和连接含有amiRNA前体骨架(侧翼部分)的载体和此DNA，以完成载体构建。含祀标干扰序列的DNA片段可从WMD3网站(http://wmd3.weigelworld.0rg/cg1-bin/webapp.cgi page= Designer;project=stdwmd)上得到对所干扰的基因的革巴序列，为此特异性的21bp的靶干扰序列设计引物两条，还有一条可重复使用的骨架环引物，用此三条引物进行退火，可得到长116bp的DNA片段。DNA片段克隆到载体骨架的方法可以是:将含有amiRNA前体骨架的载体和含靶标干扰序列的DNA片段按照合适(1:10到10:1之间)的摩尔比同时进行酶切和连接，在内切酶的作用下载体和片段的两端产生相同的黏末端，再在连接酶的作用下可以相互连接，因此可以形成最终的针对所选基因的特异性amiRNA干扰载体。本方法采用typeIIS型限制性内切酶(此类内切酶识别位点与酶切位点不在同一位点)作为粘末端产生酶，直接将退火得到的miRNA中间部分与骨架侧翼部分进行连接，而且酶切连接一步法实现，无需凝胶回收酶切片段，简单、方便、快捷地将整个构建过程合并在一个体系中，只需1-2个小时即可完成。
图1是pAS干扰表达载体的图谱。图2显示的是在烟草中验证此方法产生的载体对⑶S基因的干扰。左侧为对照组，为含质粒PCAMBIA1301的农杆菌(可表达⑶S基因)，右侧为含质粒pCAMBIA1301的农杆菌和含质粒pAS-gus的农杆菌的混合实验`组，由此可见干扰载体对于⑶S基因的干扰效果十分显著。图3显示的是定量PCR结果验证烟草叶片中⑶S基因的表达量。柱状图表示对照组(图2左侧叶片)和实验组(图2右侧叶片)⑶S基因的相对表达量，图上的短横线表示所得数据的标准差，由此可得干扰载体对靶基因GUS所表达的蛋白可抑制56%左右。图4是amiRNA的骨架示意图。
具体实施例方式以下实施例用于进一步说明本发明，但不应理解为对本发明的限制。实施例1:PAS(pre - amiRNA on typeIIS)系统的建立 针对植物转基因系统设计了 PAS干扰表达载体，其图谱如图1。此载体是将pCAMBIA1300用QuikChange突变试剂盒消除了 typeIIS (BsaI)后加了一段 cassette,此 cassette 包括 CaMV35s-pre528-ccdB-pre528_Nos ter 全序列通过人工合成得到。CaMV35s表示花椰菜花叶病毒35s启动子；pre528_l表示水稻内源干扰miRNA(0sMIR528)的一部分骨架，序列为 CAGCAGCAGCCACAGCAAAAITTGGITTGGGATAGGTAGGTGTTATGTT AGGTCTGGTTTTTTGGCTGTAGCAGCAGCAGT ;ccdB表示大肠杆菌致死基因，但它对DB3.1菌株不会致毒，虽然图谱中未标出，但其中含有其自身的启动子及终止子，序列为:
AGAGACCAATTCTCGACTAAGTTGGCAGCATCACCCGACGCACTTTGCGCCGAATAAATACCTGTGACGGAAGATCACTTCGCAGAATAAATAAATCCTGGTGTCCCTGTTGATACCGGGAAGCCCTGGGCCAACTTTTGGCGAAAATGAGACGTTGATCGGCACGTAAGAGGTTCCAACTTTCACCATAATGAAATAAGATCACTACCGGGCGTATTTTTTGAGTTATCGAGATTTTCAGGAGCTAAGGAAGCTAAACTTTTGCTGACGAGAACAGGGACTGGTGAAATGCAGTTTAAGGTTTACACCTATAAAAGAGAGAGCCGTTATCGTCTGTTTGTGGATGTACAGAGTGATATTATTGACACGCCTGGGCGACGGATGGTGATCCCCCTGGCCAGTGCACGTCTGCTGTCAGATAAAGTCTCCCGTGAACTTTACCCGGTGGTGCATATCGGGGATGAAAGCTGGCGCATGATGACCACCGATATGGCCAGTGTGCCGGTATCCGTTATCGGGGAAGAAGTGGCTGATCTCAGCCACCGCGAAAATGACATCAAAAACGCCATTAACCTGATGTTCTGGGGAATATAAATGTCAGGCTCCCTTATACACAGGTCGACGGTCTCAACGAGCCCTTGGTCTCA ;pre528_2 表示水稻内源干扰 miRNA (OsMIR528)的另一部分骨架，序列为 GTTCCTGCTGCTAGGCTGTTCTGTGGAAGITTGCAGAGITTATATTATGGGITTAATCGTCCATGGCATCAGCATCAGCAGC ；Nos ter 表示终止子。实施例2:用PAS系统干扰基因⑶S
选靶基因⑶S ( ￠-葡萄糖苷酸酶基因)进行干扰实验(GenBank注册编号AY292368)。(I)通过WMD3在线软件筛选出⑶S基因的特异靶位点为TAATAACATACGGCGTGACAT
(2)针对此靶位点设计引物:
pam1-F:caggagg tctcaggaaTAATAACATACGGCGTGACATcaggagattcagttpam1-R:gtcctggtctcagcagTAATAACATACCGCGAGACATagagaggcaaaagpami—M:caggagattcagtttgaagctggacttcacttttgcctctct
(3)将此三条单链引物退火延伸，可得到一条116bp的DNA片段，即为caggaggtctcaggaaTAATAACATACGGCGTGACATcaggagattcagtttgaagctggacttcacttttgcctctctATGTCTCGCGGTATGTTATTActgctgagaccaggac。(4)将3得到的DNA片段和pAS-amiRNA用BsaI和T4 DNA Iigase同时反应一段时间(0.5-5h)后，转化入大肠杆菌感受态中，若此片段未能克隆入载体中，此载体在大肠杆菌中不能生长，能长出来的菌斑表示此片段已成功克隆到pAS-amiRNA中，一般情况下都是正确的重组子并命名为pAS-gus。(5)将载体pAS-gus转入农杆菌EHA105中，侵染烟草植株以验证干扰效果，如图2所示。在烟草中验证此方法产生的载体对⑶S基因的干扰。左侧为对照组，为含质粒PCAMBIA1301的农杆菌(可表达⑶S基因)，右侧为含质粒pCAMBIA1301的农杆菌和含质粒pAS-gus的农杆菌的混合实验组，由此可见干扰载体对于GUS基因的干扰效果十分显著。(6)qRT-PCR结果定量分析干扰效果，如图3所示。定量PCR结果验证烟草叶片中⑶S基因的表达量。柱状图表示对照组(图2左侧叶片)和实验组(图2右侧叶片)⑶S基因的相对表达量，图上的短横线表示所得数据的标准差，由此可得干扰载体对靶基因GUS所表达的蛋白可抑制56%左右。
权利要求
1.一种构建miRNA干扰载体的方法，该方法采用了含有amiRNA前体骨架的载体以及含有正向靶标-环部骨架-反向靶标的DNA片段，所述载体上的两侧翼序列之间有一对相同但方向相反的typells型内切酶酶切序列，所述DNA片段两端含有预设的typeIIS内切酶酶切序列，并且载体上酶切产生的粘末端和合成的DNA上酶切产生的粘末端可以完全互补,通过此typeIIS酶切并连接酶切产物，即可完成载体构建。
2.根据权利要求I所述的方法，其特征在于，所述DNA片段的构建方法是通过将三条单链DNA退火并延伸得到，这三条分别为A序列含有正向靶标和typells型内切酶酶切正向序列的单链DNA，B序列中间骨架序列，C序列含有反向靶标和typells型内切酶酶切反向序列的单链DNA，B序列的两端分别和A序列以及C序列的一端部分重叠。
3.权利要求I方法构建得到的miRNA干扰载体。
全文摘要
本发明公开了一种构建人工小RNA(amiRNA)表达载体的方法，其通过人工合成含有正向靶标-环部骨架-反向靶标的DNA，且此DNA片段两端含有预设的typeIIS内切酶酶切位点，将其克隆到含有此typeIIS限制性内切酶的含有amiRNA前体骨架的载体中得到小RNA(amiRNA)表达载体。该方法具有高效率、高通量的优点，而且操作简单，用此方法构建一个干扰载体只需要设计一对50bp左右的引物，1-2小时即可完成构建。
文档编号C12N15/63GK103255158SQ20131020516
公开日2013年8月21日 申请日期2013年5月28日 优先权日2013年5月28日
发明者李阳, 李阳生, 卢楠, 李杨 申请人:武汉大学