一种核转录因子-κB抑制剂的筛选方法

专利名称：：一种核转录因子-κB抑制剂的筛选方法
技术领域：
：本发明涉及一种活性物质的筛选，尤其涉及一种核转录因子-KB(NF-icB)抑制剂的筛选方法。
背景技术：
：结肠癌是发病率和死亡率较高的恶性肿瘤，结肠癌的耐药现象是影响其化疗疗效和预后的主要原因之一。为克服肿瘤耐药，多年来人们对肿瘤的耐药机制进行了大量的研究。已证实多种肿瘤组织均有NF-KB的高表达，而多种抗癌药物均可激活NF-kB，NF-kb高表达的肿瘤细胞表现为对化疗、射线等介导凋亡的抵抗作用。目前，大量研究已表明NF-kB在炎症、免疫反应、肿瘤等方面发挥重要作用。在大多数细胞，当细胞未受刺激时，异二聚体NF-KB以非活性形式存在于细胞质，并与抑制蛋白IkB形成貧合物。一旦接受刺激信号，lKBa在lKB激酶(IKK)作用下，其氨基末端Ser32/36磷酸化，随后该区Lys21/22泛素化，在蛋白酶体作用下降解，并释放出NF-KB，后者向核内转移，与靶基因的顺式调节元件KB位点结合，调节这些基因的转录[22]。基于上述的活化过程，目前抑制NF-kB活化的方法有1.将突变型lKBa基因转移到肿瘤细胞内，使NF-KB释放障碍。Sumitomo等构建了lKBa基因N端截短突变的腺病毒重组体(AxlKBaAN)，并将它转入一个分泌多种细胞因子的膀胱癌细胞系KU-19-19细胞中。发现AxlKBaAN能有效感染该细胞系并持续表达对NF-KB的抑制作用，且不会被磷酸化及水解，并能抑制KU-19-19细胞的生长及其细胞因子的产生(SumitomoM，TachibanaM,OzuC，etal.Inductionofapoptosisofcytokine—roducingbladdercancercellsbyadenovirus—mediatedIkappaBalphaoverexpression.HumGeneTher，1999,10(1):37-47.)。2.采用封闭NF-KB亚基的反义寡核苷酸，直接抑制其转录。封闭顺式元件上的KB位点，可形成三股螺旋的寡核苷酸(TFO)，能够特异性地识别双股螺旋DNA的序列，TFO靶向定位于特定基因的NF-KB的KB位点，可以阻止NF-kB与之結合，从而抑制NF-kB的活性。3.蛋白酶和蛋白酶体抑制剂化学药物，如蛋白酶抑制剂、钙调节蛋白酶抑制剂等。抑制26S等蛋白酶小体的功能可以減少IkB的降解，从而阻止NF-kB通路的激活。这类抑制剂以多聚乙醛类为代表，包括MG-101、MG-132和MG-115，它们是通过抑制蛋白酶小体的蛋白酶活性来实现的。4.圈套寡核苷酸即合成与靶基因的形式调控元件一致的圈套双链寡聚脱氧核糖核苷酸或圈套单链寡聚核苷酸或肽核酸，将其转入细胞，它们能在NF-KB转位入核前或入核后与NF-KB竞争性结合，干扰NF-KB靶基因启动子顺式调控元件的结合，故而抑制靶基因的转录活性。显然，就目前而言，直接将突变型lKBa基因转移到肿瘤患者体内还存在着许多技术难题尚未克服；反义寡核苷酸治疗有可能导致机体一些重要基因功能的丧失；正常情况下，由于蛋白酶体和钙调节蛋白酶等是细胞周期和细胞功能的重要调节剂，所以其抑制剂的临床应用还存在很大问题；而圈套寡核苷酸无论从技术和经济上目前也很难在临床广泛应用。因此，如何选择高效、安全的NF-kB抑制剤，仍是目前临床医学中有待解决的问题。进一步发掘靶点特异、高效、低毒的药物,寻找天然NF-kB活性抑制剤，将为拮抗NF-kb功能开辟更加广阔的前景。结肠癌是发病率和死亡率较高的恶性肿瘤，治疗主要是手术、放疗和化疗等的有机结合，而作为具有全身性治疗潜能的化疗日益受到重视，在结肠癌的治疗中占据着不可替代的地位。但普遍存在的肿瘤细胞对化疗药物的耐药现象严重影响了结肠癌的治疗效果，结肠癌的耐药现象是影响其化疗疗效和预后的主要原因之一。为克服肿瘤耐药，多年来人们对肿瘤的耐药机制进行了大量研究，并在细胞乃至分子水平有了诸多进展，其中包括某些耐药基因(MDR)和细胞表面蛋白(P-糖蛋白和多药耐药相关蛋白)介导的多药耐药。然而针对这些耐药机制所设计的治疗方法，尽管在体外研究中效果显著，但在临床上却难以奏效，特别是对实体瘤的治疗更是令人失望。NF-KB信号通路的活化无论在获得性耐药或内在性耐药中均起着重要作用，近年有作者甚至认为，NF-kB活化可能代表一个比多药耐药基因更为重要的耐药机制。合理设计与NF-xB活化抑制剂联合的化疗方案，将有助于降低肿瘤细胞的抗凋亡阈值，成为逆转肿瘤耐药和化疗增敏新的策略和有效方法。而针对NF-KB活化抑制剂的研究就目前而言，直接将突变型lKBa基因转移到肿瘤患者体内还存在着许多技术难题尚未克服；反义寡核苷酸治疗有可能导致机体一些重要基因功能的丧失；正常情况下，由于蛋白酶体和钙调节蛋白酶等是细胞周期和细胞功能的重要调节剂，所以其抑制剂的临床应用还存在很大问题；而圈套寡核苷酸无论从技术和经济上目前也很难在临床广泛应用。因此，以上各种NF-KB活化抑制剂与化疗药物联合应用以逆转肿瘤耐药和化疗增敏在临床上应用较困难。中医中药是我国的传统医药，临床上，许多中药或中药方剂应用于肿瘤的治疗。中药以其独特的优势及毒副作用相对较小等特点，在对肿瘤的治疗中的作用正逐渐受到人们的重视。青蒿作为传统清热药，在临床上广泛应用，其青蒿素用于治疗多型疟疾，疗效很显著，并得到了世界的公认。青蒿在药理上、化学成分的提取分离，临床应用都取得很大的进展，近年来的研究也发现青蒿及其相关的有效成分可以抑制NF-KB的活化，也具有一定的抗肿瘤作用。作为传统的中药，青蒿在抗肿瘤方面的作用正逐渐受到重视，人们对其抗肿瘤机制的研究也在逐步深入。由于中药组成成分复杂，如能采用有效手段，确定与NF-KB作用的物质基础，分离制备出抑制NF-kB活化的有效单体，将对NF-kB抑制剂的开发具有重要意义。光学生物传感器技术是利用光学原理，在生物传感器的样品池表面包被固定受体，当受体与其配结合体时，以共振角度进入光线衰竭区的激光就会发生共振角度的改变，这一变化通过计算机处理后就可以检测到传感器表面受体与其配体分子之间的相互作用及亲和力。通过特异性的洗脱及回收，即可得到纯度极高的配体分子。
发明内容本发明在既往研究工作的基础上，以青蒿为研究对象，利用生物传感器技术，制备出青蒿中与NF-kB特异性结合的活性物质，继而对该物质的理化性质及抑制NF-kB活化的能力进行测定；在体外采用肿瘤细胞三维立体培养模型，观察其抑制NF-kB活性及其对凋亡相关蛋白、细胞凋亡和对药物敏感性的影响；同时进一步观察其对动物肿瘤模型化疗增敏和逆转耐药的效果，研究其作为NF-kB抑制剂的药物活性。本发明所述的核转录因子-kb抑制剂的筛选方法，其主要包括以下步骤1)制备待筛选的提取物；2)在样品池中包被核转录因子-kb蛋白的，制得包被的核转录因子-kb蛋白；3)将步骤l)中得到的提取物与步骤2)得到的包被的核转录因子-KB蛋白结合，通过生物传感器进行结合洗脱，得洗脱液；4)分析步骤3)中得到的洗脱液，筛选出所述的核转录因子-KB抑制剂。本发明的优选实施例中，步骤2)中可以包括将生物素用作阻断样品池中的生物素结合位点。本发明的优选实施例中，步骤3)中可以包括以下步骤1)样品池中加入HBSTE缓冲液冲洗，至平衡后吸出以平衡基线；2)分别加入提取物溶液，至平衡后吸出，使提取物溶液与核转录因子-KB蛋白能够充分结合；3)加入HBSTE缓冲液冲洗，对未结合部分进行充分非特异性洗脱，平衡后吸出洗脱液。4)加入盐酸冲洗，对结合部分进行特异性洗脱，充分平衡后吸出洗脱液。本发明还涉及使用上述的筛选方法从青蒿中制备核转录因子-kB抑制剂的方法，其主要包括以下步骤1)处理青蒿，制得提取物；2)在样品池中包被核转录因子-KB蛋白的，制得包被的核转录因子-KB蛋白；3)将步骤l)中得到的提取物与步骤2)得到的包被的核转录因子-KB蛋白结合，通过生物传感器进行结合洗脱，得洗脱液；4)分析步骤3)中得到的洗脱液，筛选出所述的核转录因子-KB抑制剂。本发明的优选实施例中，步骤l)中可以包括萃取处理，其中萃取剂为石油醚。本发明的优选实施例中，步骤l)中可以包括层析处理，其中显色剂为硫酸乙醇。本发明的优选实施例中，步骤l)中可以包括色谱法处理，其中洗脱系统为氯仿甲醇洗脱系统，或石油醚乙酸乙酯洗脱系统。本发明的优选实施例中，上述的从青蒿中制备核转录因子-KB抑制剂的方法可以包括使用如SEQIDNO:l-SEQIDNO:2所示的核转录因子-KB寡聚核苷酸探针序列检测所述的核转录因子-KB抑制剂的活性。本发明还涉及一种核转录因子-KB抑制剂，其通过上述的从青蒿中制备核转录因子-KB抑制剂的方法制备，具体理化性质为淡黄色粉针状，略溶于水，溶于乙醇，易溶于氯仿、乙酸乙酯，熔点在202-203。C;红外光谱检测结果显示在:3334.7、1701.1、1566.1、1290.3附近有明显振幅波峰；核磁共振波谱结果为1H-NMR(CDC13)Sppm:3.959(3H，s，OCH3)，6.207(1H，s，OH)，6.276(1H，d，J=9.2，H-3)，6.852(1H，s，H-8)，6.923(1H，s，H画5)，7扁(1H，d，J=10，H-4);13C-NMR(CDC13)Sppm:161.383(C國2)，113.433(C-3)，143.236(C國4)，107.542(C-5),149.733(C-6)，150.301(C誦7),103.213(C-8)，144.029(C-9)，111.509(010)，56.434(國OCH3)。本发明所述的核转录因子-KB抑制剂可用于制备核转录因子-KB抑制剂药物。本发明所述的核转录因子-KB抑制剂还可用于制备抗肿瘤药物。本发明采用光学生物传感器技术，创新地从中药分离具有抑制NF-KB活性的中药活性物质。明确发现东莨菪素可以与NF-KB特异性结合，筛选出青蒿中的有效单体成分东莨菪素即为NF-KB的特异性抑制剂，从NF-KB抑制剂这一新的方向研究东莨菪素这一中药的有效单体成分，为东莨菪素的药理作用研究提供了新的思路和方向，同时也为选择有效的NF-KB抑制剂提供了新的方法，为肿瘤的治疗、逆转肿瘤耐药和化疗增敏提供了新的策略。而本发明中筛选出的青蒿中NF-kB抑制剂一东莨菪素，为天然中药的有效单体成分，其毒副作用小，安全性高、作用靶点特异，为一种有效可行的能与化疗药物联合应用于结肠癌治疗的NF-kB活化抑制剂，从而逆转肿瘤耐药和化疗增敏。而东莨菪素作为NF-kB抑制剂的药物活性，为首次研究发现的东莨菪素的又一新的药物活性。为让本发明的上述和其它目的、特征和优点能更明显易懂，下文特举较佳实施例，并配合附图，作详细说明如下。图1为NF-kb蛋白生物传感器包被图；图2为东莨菪素与5-FU联合应用对结肠癌HT-29细胞球NF-KB活性的抑制作用结果；图3为东莨菪素与5-FU联合应用对结肠癌HT-29细胞球细胞周期分布的影响结果；图4为东莨菪素与5-FU联合应用对结肠癌HT-29细胞球细胞凋亡率影响结果；郞为东莨菪素与5-FU联合应用对结肠癌HT-29细胞球抗凋亡蛋白Bcl-2与促凋亡蛋白FAS、FAS-L的表达的影响结果；图6为东莨菪素不同处理组裸鼠肿瘤组织NF-KB活性的变化情况结果；图7为东莨菪素与5-FU联合应用对裸鼠移植瘤肿瘤组织抗凋亡蛋白Bcl-2与促凋亡蛋白FAS、FAS-L的表达的影响结果；图8为TLC法中计算Rf值的示意图。具体实施方式一.方法(一)实验所需材料实验材料青蒿全草药物重庆地产，由重庆市中药研究所鉴定明确。硅胶(柱色谱用)100—200目，安徽良臣硅源材料有限公司提供。硅胶G薄层层析板安徽良臣硅源材料有限公司提供。结肠癌细胞株HT-29细胞为本室保存人结肠癌传代细胞系，用DMEM高糖培养基培养，含10%新生牛血清，各100U/mL的青、链霉素，用0.25%胰酶消化传代。实验动物46周龄BALB/Cnu/nu裸鼠，体重1822g，雄性，由中国人民解放军第三军医大学动物实验中心提供，生产许可证号SCXK-(军)2007015，饲养于SPF级无菌层流室中。主要仪器设备和试剂1.主要仪器设备生物传感器Thermo公司美国生物传感器样品池Thermo公司美国Q-TRAP2000质谱仪ABI公司美国Varian400MHz核磁共振波谱仪Varian公司美国FTIR8000红外线光谱仪岛津公司美国Agilent1200高效液相色谱仪'Agilent公司美国R1002旋转蒸发器(10L)上海申顺生物科技公司中国BUCHI回旋减压蒸发仪(1L)BUCffl德国烘干机上海精密实验设备公司中国台式离心机Sigma美国电子天平上海安亭中国DK-8B型电热恒温水槽上海精密实验设备公司中国纯水机Millipore法国显微熔点测定仪(XRC-1型)四川大学科学仪器厂中国pH计(828型)Orion美国恒温振荡器江苏太仓实验设备厂中国超净工作台安泰公司中国C02培养箱ThermoForma美国倒置显微镜Olympus曰本台式离心机Sigma美国台式低温高速离心机BiofUge22R，德国培养板(6、12、24、96孔板)Costar美国照相显微镜Olympus曰本流式细胞仪BectonDickinson美国电子天平上海安亭中国超低温冰箱ThermoForma美国垂直电泳槽Bio國Rad美国紫外分光光度计Bio画Rad美国pH计(828型)Orion美国纯水机Millipore法国恒温振荡器江苏太仓实验设备厂中国长风水浴箱北京长风中国Model550酶标仪Bio-Rad美国2、主要试剂NF-kBP65蛋白Sigma美国<table>tableseeoriginaldocumentpage12</column></row><table>FBSTBD中国新生牛血清成都哈里中国TEMEDSigma美国5-FUSigma美国显影液天津成信医用辅料厂中国定影液天津成信医用辅料厂中国Tris碱BoehringerMannheim美国丙烯酰胺鼎国生物中国MTTBD公司美国核因子-kB寡聚核苷酸探针的探针序列如下SEQIDNO:l-SEQIDNO:2NF-kB:PI:5'國AGCTTAGAGGGGACTTTCCGAGAGGA-3，NF-kB:P2:5'-TCCTCTCGGAAAGTCCCCTCTAAGCT-3，抗体稀释液博士德中国中性树胶中杉生物中国SP-9000免疫组化染色试剂盒中杉生物中国DAB试剂盒中杉生物中国HBSTE缓冲液(二)应用生物传感器方法对青蒿水煎液中NF-kB特异性抑制剂的筛选及其结构鉴定1.青蒿水煎液浓縮液的制备及萃取(1)青蒿全草干药材1公斤，用4升清水浸泡30分钟，高火煮至沸腾后改低火煎40分钟，滤去残渣，滤渣再用4升清水同法煎40分钟，合并两次水煎液。(2)水煎液800gx30分钟离心，收集上清液，旋转蒸发仪回旋浓縮至1升。(3)将浓縮液加入分液漏斗中，加入石油醚500ml，充分混合均匀后静置，待分层明确后，打开活塞，收集位于下层的青蒿浓縮液，从分液漏斗上端收集石油醚层。重复前述步骤再进行石油醚萃取3次，收集石油醚萃取液。(4)分液漏斗中保留经石油醚萃取后的青蒿浓縮液，加入氯仿500ml，充分混合均匀后静置，待分层明确后，打开活塞，收集位于下层的氯仿层，保留水煎液。重复前述步骤再进行氯仿萃取3次，收集氯仿萃取液。(5)分液漏斗中保留经氯仿萃取后的青蒿浓縮液，加入乙酸乙酯500ml，充分混合均匀后静置，待分层明确后，打开活塞，收集位于下层的青蒿浓縮液，从分液漏斗上端收集乙酸乙酯层。重复前述步骤再进行乙酸乙酯萃取3次，收集乙酸乙酯萃取液。(6)分液漏斗中保留经乙酸乙酯萃取后的青蒿浓縮液，加入正丁醇500ml，充分混合均匀后静置，待分层明确后，打开活塞，收集位于下层的青蒿浓縮液，从分液漏斗上端收集正丁醇层。重复前述步骤再进行正丁醇萃取3次，收集正丁醇萃取液。(7)将收集得到的各相萃取液及萃取后的青蒿浓縮液经减压旋转蒸发仪回旋浓縮成浸膏备用。2.硅胶G薄层层析(TLC)(1)点样提取物用最少量氯仿溶解，浓度12%，用毛细管蘸取试样溶液逐次在硅胶G薄层层析板上点样，总量约15pg，点样孔距离>0.511，点样孔与底边距离1.5cm，室温下挥干溶剂，在样点上轻轻画出一条平行于玻璃板底边的细线。(2)展开剂选择不同比例石油醚乙酸乙酯展开系统(O:1010:O)和氯仿甲醇展开系统(氯仿15%甲醇)(3)展开将已点好样挥干溶剂的硅胶G薄层层析板竖直放入盛有展开剂的有盖展开瓶中，展开剂要接触到吸附剂下沿，但不能接触到样点，盖上盖子，展开。展开距离达到3/4处停止展开，再画出展开剂的前沿线。分别应用不同比例的石油醚乙酸乙酯展开系统和氯仿甲醇展开系统进行展开。(4)取出硅胶G薄层层析板，室温下挥干展开溶剂。(5)硫酸乙醇显色剂显色薄层层析板上用硫酸乙醇显色剂喷雾后，ll(TC烤箱烘烤30分钟，观察显色情况。(6)碘蒸气显色将挥干溶剂的薄层层析板放入碘蒸气饱和的显色缸内，观察显色情况。(7)Rf值计算Rf^展开点样线至斑点中心距离/展开后点样线至溶剂前沿距离。请参照图8，计算公式为R产RA(/RAB。3.硅胶柱色谱(1)装柱将溶剂装入层析柱中，打开活塞，使溶剂缓慢滴出。称取柱色谱用硅胶(100200目，量约为上样量的40倍)，用溶剂溶解湿润后搅拌缓慢加入，边沉降边添加，直至加完为止，继续加入45倍柱体积的溶剂缓慢冲洗柱床。当硅胶充分沉降后，放出多余的溶剂至液面与柱床顶端表面一致时关闭活塞。(2)拌样提取物用少量氯仿溶解，称取样品量的11.5倍的100200目柱色谱用硅胶加入溶液中，充分混匀，挥干溶剂。(3)上样将挥干溶剂的己吸附提取物的硅胶缓慢加入已装好柱的层析柱中，使表面成平面。(4)梯度洗脱过柱用不同比例氯仿甲醇洗脱系统(氯仿15%甲醇)和石油醚乙酸乙酯洗脱系统(O:1010:O)进行梯度洗脱柱色谱，洗脱液洗脱速度lml/min，每个比例洗脱系统约5倍柱体积容量。(5)洗脱液收集分段收集过柱后的洗脱液，2050ml/瓶，硅胶G薄层层析后合并洗脱液。(6)收集的洗脱液减压回旋蒸发仪浓縮旋干保存。4.重结晶(1)提取物中加入少量热丙酮，至刚好溶解。(2)加入少量石油醚至澄清溶液出现少量浑浊。(3)再加入少量热丙酮至溶液重新澄清。(4)室温放置冷却，使溶剂缓慢挥发，结晶析出。(5)将混有结晶的饱和溶液过滤，石油醚冲洗，收集结晶并重复结晶过程。5.生物传感器NF-KB蛋白的包被(图1)(1)样品池中加入HBSTE缓冲液后，加入2(^1亲和素后结合反应2分钟，HBSTE缓冲液洗3次，每次50pl。(2)HBSTE缓冲液洗3次，使基线稳定2分钟。(3)加入5^生物素阻断样品池中的生物素结合位点1分钟。(4)用100mMHCL洗3次洗掉亲和素，再用HBSTE缓冲液洗3次。(5)加入20plSPDP反应10分钟。(6)50plHBSTE缓冲液洗3次，平衡基线1分钟。(7)用5mMDTT40)al/次洗3次。(8)用HBSTE缓冲液洗3次，平衡基线2分钟。(9)再加入SPDP20pl反应10分钟(10)HBSTE缓冲液洗3次，平衡2分钟。(11)50pl亮丙瑞林酸3次，平衡基线2分钟肪加入5pgNF-KB蛋白入样品池中，见到有结合发生的静电吸收峰，反应约15分钟(13)HBSTE缓冲液洗3次，平衡基线2分钟。(14)50pill00mMHCL洗3次洗去过剩的蛋白，HBSTE缓冲液洗3次，平衡基线2分钟。(15)50pllM乙醇胺洗3次以除去剩余的巯基酯类。(16)HBSTE缓冲液洗3次，平衡1分钟。(m抗体结合实验证明蛋白已包被入样品池中。6.生物传感器对各提取物进行特异性结合洗脱(1)样品池中加入50plHBSTE缓冲液冲洗3次，至平衡后吸出以平衡基线。(2)分别加入lpl提取物溶液，至平衡后吸出，使提取物溶液与NF-kB蛋白能够充分结合。(3)加入5(HUHBSTE缓冲液冲洗3次，对未结合部分进行充分非特异性洗脱，平衡后吸出洗脱液。(4)加入100mMHCL冲洗1次，对结合部分进行特异性洗脱，充分平衡后吸出洗脱液。7.溶解度测定(1)称取研成细粉的提取物，置于25士2"C，10ml的溶剂中。(2)每隔5分钟强力振摇30秒钟；观察30分钟内的溶解情况，看不见溶质颗粒即为完全溶解。(3)判定标准据药典2000版二部凡例的标准判定近似溶解度极易溶解系指溶质lg(ml)能在溶剂不到lml中溶解。易溶系指溶质lg(ml)能在溶剂1不到10ml中溶解。溶解系指溶质lg(ml)能在溶剂10不到30ml中溶解。略溶系指溶质lg(ml)能在溶剂30不到100ml中溶解。微溶系指溶质lg(ml)能在溶剂100不到1000ml中溶解。极微溶解系指溶质lg(ml)能在溶剂1000不到10000ml中溶解。几乎不溶或不溶系指溶质lg(ml)在溶剂10000ml中不能完全溶解。8.熔点测定(1)熔点仪接通电源，开关打到加热位置，从显微镜中观察热台中心光孔是否处于视场中，若左右偏，左右调节显微镜。前后不居中，松动热台两旁的两只螺钉，然后前后推动热台上下居中，锁紧两只螺钉。(2)进行升温速率调整，使其升温速率为rC/min。(3)把测温仪的传感器插入热台孔到底。(4)先用熔点标准物质进行测量标定，求出修正值。(修正值=标准值-所测熔点值)，作为测量时的修正依据。(5)将待测样品放入干燥器内进行干燥处理，研细粉末。(6)将盖玻片放在热台上，放上待测物质药粉，再放上载波片测量。9.将所得物质分别进行红外线光谱仪、核磁共振波谱仪、质谱仪检测，分析得到的各光谱、波谱数据。(三)体外实验中药青蒿中NF-kb特异性抑制剂Scopoletin对体外培养的结肠癌细胞群集耐药作用的影响1、实验分组(1)取等量对数期生长的HT-29细胞分瓶行3D培养5d。(2)空白对照组换液后继续培养24h。(S)单独Scopoletin组加入含Scopoletin的培养液使终浓度达200^ig/ml继续培养24h。(4)单独5-FU组加入含5-FU的培养液使终浓度达100^ig/ml继续培养24h。(5)5-FU+50ixg/ml组加入含5-FU100^ig/ml和Scopoletin50^ig/ml的培养液继续培养24h。(6)5-FU+100pg/ml组加入含5-FU100pg/ml和Scopoletinl00ng/ml的培养液继续培养24h。()5-FU+200ng/ml组加入含5-FU100pg/ml和Scopoletin20(^g/ml的培养液继续培养24h。2、Scopoletin对结肠癌细胞NF-kB活性的影响2.1细胞核蛋白的提取(按照试剂盒说明进行如下操作)(1)收集已经按实验分组处理好的细胞，1000xg，3min，弃去培养基，加入含0.02%EDTA的0.01MPBS将多细胞球吹打成单细胞。(2)离心500xg，3min，4""C预冷的PBS洗细胞两次，离心500xg，3min后收集细胞。(3)用lml预冷的PBS将细胞转移至预冷的1.5ml微量离心管中，加入10plPMSF，混匀。(4)4。C离心，500xg，3min收集细胞，用移液枪尽可能取去上清。(5)每20|iL细胞压积中，加入20(^1预冷的BufferA(使用前每lml加入l^ilDTT,5plPMSF，10nl蛋白酶抑制剂)，最大转速涡旋剧烈振荡15s，放置冰上10-15min。(6)加入11pl冷BufferB，最大转速涡旋剧烈振荡5s，放置冰上lmin，再次最大转速涡旋剧烈振荡5s后，4'C离心，16000xg，5min;将上清转入另一预冷的洁净微量离心管，置于冰上，得胞质蛋白。(7)在离心沉淀物(细胞核)中加入100^1预冷的BufferC(使用前每lml加入lplDTT,5plPMSF，10pl蛋白酶抑制剂)，最大转速涡旋剧烈振荡15s，放置冰上40min，每间隔10min涡旋剧烈振荡15s。(8)4-C离心，16000x，10min，尽快将上清转入一预冷的洁净微量离心管，得核蛋白。(9)将核蛋白进行定量(Bradford比色法)，调整蛋白浓度为lmg/ml分装，-70°0保存，避免反复冻融。2.2NF-kB寡核苷酸探针的标记(1)在消毒的一次性Ep管中依次加入NF-kB寡核苷酸探针2.(^1[Y-32p〗ATPl.OplT4多聚寡核苷酸激酶10xbuffer1.0^1ddH205単T4多聚寡核苷酸激酶(2)充分混匀上述液体，离心10s，使液体流入管底;(3)于37。C温育反应10min;(4)加入1^10.5M的EDTA终止反应；(5)加入89^1TEbuffer混匀，-20。C保存。2.3凝胶迁移阻滞分析(EMSA)法测定NF-kB的DNA结合活性(1)配制5%非变性聚丙烯酰胺凝胶，加入按厂家说明安装好的电泳槽的胶槽中，凝固后去掉梳子，用0.5xTBE冲洗加样孔，将凝胶固定在电泳槽中，加满电泳缓冲液(0.5xTBE缓冲液)。(2)预电泳100V电压电泳30min。(3)在200jal5x结合缓冲液中加入0.5nllMDTT(4)EP管内分别加入以下反应体系，室温下放置lOmin:5x结合缓冲液2.0pl核提取物2.(^1双蒸水5.0|il总体积9.0^1(S海管分别加入[y-"P]ATP标记的NF-KB寡核苷酸探针1^11，混匀后，于室温中反应20min。(6海管中加入1^1的上样缓冲液。(7)电泳加样至上样孔中，于100-120V电泳2h。(8)取下玻璃板，0.5xTBE轻轻漂洗凝胶，洗净游离探针。剪取合适大小的滤纸，使之恰好贴在凝胶的正面，将其从玻璃板上取下，保鲜膜覆盖凝胶，尽量不产生气泡。(9)将凝胶移至干燥滤纸上，吸干水分，小心将胶移至保鲜膜。保鲜膜封口。(鹏謝自显影在暗室内糊^$方从暗盒，压X光显影胶片，将Bf^密封，-70。C曝光过夜。ai)暗室内取出胶片，显影5min,自来水冲洗胶片，定影5min，自来水充分冲洗，晾千。3、流式细胞仪检测Scopoletin对结肠癌细胞细胞周期的影响(1)细胞培养及实验分组同前述。(2)收集已经按实验分组处理好的细胞，1000xg，3min，弃去培养基，加入含0.02%EDTA的0.01MPBS将多细胞球吹打成单细胞。(3)离心500xg，3min，4。C预冷的PBS洗细胞两次，离心500xg，3min后收集细胞。(4)将收集的细胞加入70%冷乙醇中，4°C,固定24h。(5)离心弃去固定液，3mlPBS重悬5min,弃去PBS。(6)加入RNA酶，37-C孵育30min。(7)加入PI染液，4。C避光30min。(8)流式细胞仪上机检测。4、流式细胞仪AnnexinV-FITC/PI双标法检测Scopoletin对结肠癌多细胞球细胞凋亡率的影响a)细胞培养及实验分组同前述。(2)收集已经按实验分组处理好的细胞，1000xg，3min，弃去培养基，加入含0.02%EDTA的0.01MPBS将多细胞球吹打成单细胞。(3)离心500xg，3min，4t预冷的PBS洗细胞两次，离心500xg，3min后收集细胞。(4)用去离子水按1:4稀释结合缓冲液。(5)用25(^1结合缓冲液重新悬浮细胞，调细胞浓度为lxl06/ml。(6)取100^1的细胞悬液于5ml流式管中，加入5(xlAnnexinV-FITC和10^120pg/ml的PI溶液。(7)混匀后于室温避光孵育15min。(8)在反应管中加入400^1PBS，流式细胞仪上机检测分析。5、流式细胞仪检测Scopoletin对结肠癌多细胞球Bcl-2、FAS、FAS-L表达的影响(1)细胞培养及实验分组同前述分组。(2)收集已经按实验分组处理好的细胞，1000xg，3min，弃去培养基，加入含0.02%EDTA的0.01MPBS将多细胞球吹打成单细胞。(3)离心500xg，3min，4'C预冷的PBS洗细胞两次，离心500xg，3min后收集细胞。(4)弃上清，各管分别加入Bcl國2、FAS、FAS-L—抗抗体，混匀，37。C孵育lh。(5)PBS离心洗涤2次，各管分别加入50^tlFITC标记的二抗，37。C避光孵育30min。(6)PBS离心洗涤2次，加入500^ilPBS，混匀，流式上机检测。6、Scopoletin对结肠癌多细胞球药物敏感性的影响(1)0.25M胰蛋白酶消化收集对数期HT-29细胞，DMEM细胞培养液调浓度3xl0"ml，分于已用2%琼脂糖铺底的96孔板，100^1/孔。(2)置37-C、5。/oC02温箱内振荡器振荡摇动2h，静置培养72h。(S)各孔中分别加入含不同浓度Scopoletin(0,50，100,20(Hig/ml)和5-FU100jal(0.01，0.1，1.0，10，100，1000pg/ml)的培养基200pl，设3个复孔，设只加培养基和PBS的调零孔和不加5-FU的空白对照孔，继续培养48h。(4)小心吸去培养液，每孔加入含0.2%￡0丁八的无酶消化液10|11，反复吹打使其尽量成单细胞。(5)将各孔转入未用琼脂糖铺底的96孔板，每孔加入170^il新鲜DMEM培养液，再加入20plMTT溶液，继续培养6h。(6)小心吸去孔内培养液。每孔加入150^il二甲基亚砜，置摇床上低速振荡IOmin，使结晶物充分溶解。在酶联免疫检测仪490nm处测量各孔的吸光值。(7)抑制率(％)=(l-实验组平均OD/对照组平均OD)xl00%，半数抑制浓度(IC50)计算软件计算IC50。(四)体内实验中药青蒿中NF-KB特异性抑制剂Scopoletin对结肠癌裸鼠移植瘤化疗作用的影响1、裸鼠移植瘤的建立人结肠癌HT-29细胞DMEM培养基培养至对数生长期，0.25%胰蛋白酶消化后，离心，用不含血清的培养液调整细胞浓度为lxl08/1111。取裸鼠30只在鼠右侧腋下皮下接种瘤细胞液0.21111,饲养于SPF净化室内。2、实验分组及药物待肿瘤长至0.5cmx0.5cm，将动物随机分组，每组5只，开始应用药物。具体分组及应用方法为，对照组腹腔内注射生理盐水lmlx5天；单独5-FU组腹腔内注射5-FU溶液20mg/Kgx5天；单独Scopoletin200^ig/ml组腹腔内注射SP溶液200昭/mlx5天；5-FU+Scopoletin50ng/ml组腹腔内注射5-FU溶液20mg/Kg+80(^016^50^1^11^5天；5-FU+ScopoletinlOO^ig/ml组腹腔内注射5-FU溶液20mg/Kg+Scopoletinl00ixg/mlx5天；5画FU+Scopoletin200[ig/ml组腹腔内注射5-FU溶液20mg/Kg+Scopoletin200^ig/mlx5天。停药后16天全部裸鼠处死取材。3、肿瘤组织测量及抑瘤率计算实验期间动态观察肿瘤生长情况,每3天用游标卡尺测量肿瘤长径(a)和短径(b)，用药结束后第16天，处死荷瘤鼠,剥离瘤体,将剥出的肿瘤去除血污、脂肪等非瘤组织，测量瘤重。根据公式计算肿瘤体积和肿瘤体积抑制率:平均瘤体积(cv)-1/2ab2;肿瘤体积抑制率(TIR)气l-实验组平均瘤体积/阴性对照组平均瘤体积)x100%，瘤重抑制率=(1-实验组平均瘤重/阴性对照组平均瘤重^100%。4、提取物对裸鼠移植瘤组织NF-KB活性的影响4.1组织细胞核蛋白的提取(按照试剂盒说明进行如下操作)(l)匀浆的制备取得的肿瘤组织约0.5g放入平皿，用含EDTA的冷PBS缓冲液洗涤，加入少量PBS,用眼科剪将组织剪至匀浆状，加入10mlPBS，用吸管吸取组织匀浆，用200目尼龙网过滤到试管内。离心沉淀1500xg，3min，弃上层。再用PBS洗3次，每次以500xg短时低速离心除去细胞碎片，以300目尼龙网过滤去细胞团，作细胞计数并调整细胞浓度。(2)离心500xg，3min，4"C预冷的PBS洗细胞两次，离心500xg，3min后收集细胞。(3)用lml预冷的PBS将细胞转移至预冷的1.5ml微量离心管中，加入10plPMSF，混匀。(4)4。C离心，500xg，3min收集细胞，用移液枪尽可能取去上清。(5)每2(^1细胞压积中，加入200^1预冷的BufferA(使用前每lml加入lplDTT，5ulPMSF，10pl蛋白酶抑制剂)，最大转速涡旋剧烈振荡15s,放置冰上10-15min。(6)加入llpl冷BufferB,最大转速涡旋剧烈振荡5s，放置冰上lmin,再次最大转速涡旋剧烈振荡5s后，4'C离心，16000xg，5min;将上清转入另一预冷的洁净微量离心管，置于冰上，得胞质蛋白。(7)在离心沉淀物(细胞核)中加入10(^1预冷的BufferC(使用前每lml加入llilDTT，5ulPMSF,10pl蛋白酶抑制剂)，最大转速涡旋剧烈振荡15s，放置冰上40min，每间隔10min涡旋剧烈振荡15s。(8)4°。离心，16000xg，，10min，尽快将上清转入一预冷的洁净微量离心管，得核蛋白。(9)将核蛋白进行定量，调整蛋白浓度为lmg/ml分装，々(TC保存，避免反复冻融。.4.2、NF-kB寡核苷酸探针的标记(1)在消毒的一次性Ep管中依次加入NF-kB寡核苷酸探针2.0^1[y-32p]ATP1.0|ilT4多聚寡核苷酸激酶10xbuffer1.0^1ddH205単T4多聚寡核苷酸激酶1.(^1(2)充分混匀上述液体，离心10s，使液体流入管底;'(3)于37""C温育反应10min;(4)加入lpl0.5mol/L的EDTA终止反应；(5)加入89^1TEbuffer混匀，-20匸保存。4.3凝胶迁移法(EMSA)测定NF-kB的DNA结合活性(1)配制5%非变性聚丙烯酰胺凝胶，加入按厂家说明安装好的电泳槽的胶槽中，凝固后去掉梳子，用0.5xTBE冲洗加样孔，将凝胶固定在电泳槽中，加满电泳缓冲液(0.5xTBE缓冲液)。(2)预电泳100V电压电泳30min。(3)在200(xl5x结合缓冲液中加入O.5|_illmol/LDTT(4)EP管内分别加入以下反应体系，室温下放置10min:5x结合缓冲液2.0^1核提取物2.0^1双蒸水5.(^1总体积9.0pl(5)每管分别加入[，"P]ATP标记的NF-KB寡核苷酸探针lpl，混匀后，于室温中反应20min。(6海管中加入1^1的上样缓冲液。(7)电泳加样至上样孔中，于100-120V电泳2h。(8)取下玻璃板，0.5xTBE轻轻漂洗凝胶，洗净游离探针。剪取合适大小的滤纸，使之恰好贴在凝胶的正面，将其从玻璃板上取下，保鲜膜覆盖凝胶，尽量不产生气泡。(9)将凝胶移至干燥滤纸上，吸干水分，小心将胶移至保鲜膜。保鲜膜封口。卿方鄉自显影在暗室内^^^A日體，压X腿影胶片，将Hf^密封，-70°C曝舰夜。(ll)暗室内取出胶片，显影5min,自来水冲洗胶片，定影5min，自来水充分冲洗，晾干。5、免疫组织化学检测不同处理组肿瘤组织Bd-2、FAS、FAS-L的表达情况5.1、操作步骤(1)组织石蜡切片置于6(TC烤箱60分钟。(2)组织切片依次浸泡在二甲苯(15minx2次)，100。/。乙醇(2minx2次)，95%乙醇(5minx2次)，85%乙醇5min，75%乙醇5min，蒸馏水3min。(3)切片置于機酸缓冲液中，微波法抗原修复10min，自然冷却后PBS漂洗5minx3次。(4)滴加3%过氧化氢，37""C孵育15min，PBS漂洗5minx3次。(5)滴加封闭用血清A液,37i:孵育15min，滴加适当比例稀释的一抗(Bcl-2、FAS、FSA-L)，4-C过夜。PBS漂洗5minx3次。(6)滴加工作液B，37。C孵育30min，PBS漂洗5minx3次。(7)滴加工作液C，37"C孵育30min，PBS漂洗5minx3次。(8)滴加DAB显色液，显微镜下观察显色，以阳性显色充分而背景无杂色干扰为标准，及时终止反应，自来水充分冲洗。(9)滴加苏木素复染5min，自来水冲洗。用1%盐酸酒精调整复染程度。采用与(2)相反顺序浸泡切片进行脱水透明。卿中性树脂封片。4.2、结果判定显微镜下观察Bcl-2、FAS、FAS-L肿瘤组织中的表达，结果判断标准:Bcl-2阳性细胞为胞质棕色，FAS、FAS-L阳性细胞为胞膜胞质棕色表现。各组随机选取细胞分布均匀的5个高倍视野(x400),计数Bcl-2、FAS、FAS-L阳性表达的细胞数。阳性表达率=阳性的细胞数/肿瘤细胞数xlOOM。二、.结果1.成功分离提取制备得到青蒿中能与NF-kB特异性结合的有效活性物质，并测定其理化性质为淡黄色粉针状，略溶于水，溶于乙醇，易溶于氯仿、乙酸乙酯，熔点在202-203°C。2.红外光谱检测结果，提取得到的化合物IRvKaxcm"在:3334.7、1701.1、1566.1、1290.3附近有明显振幅波峰。提取物核磁共振波谱结果^-NMR(CDCl3)Sppm:3.959(3H，s,OCH3)，6.207(1H，s，OH)，6.276(1H，d,J=9.2，H-3)，6.852(1H，s，H-8)，6.923(1H，s,H-5)，7.608(1H，d，J=10，H-4)。13C-NMR(CDCl3)Sppm:161.383(C-2),113.433(C國3)，143.236(C-4)，107.542(C-5)，149.733(C國6)，150.301(C-7)，103.213(C-8)，144.029(C國9)，U1.509(C-10)，56.434(-OCH3)。东莨菪素标准品核磁共振结果'H-NMR(CDCl3)5ppm:3.957(3H，OCH3)，6.230(1H，s，OH)6.270(d，J=9.2，H-3)，6.851(1H,s，H-8)，6.918(1H，s，H-5)，7.605(1H，d，J=9.2，H-4)。13C-NMR(CDCl3)5ppm:161.367(C-2)，113.441(C-3)，143.221(C-4)，107.565(C陽5)，149.756(C-6)，150.324(07),103.221(C-8)，144.044(C-9)，111.517(C-10),56.442(-OCH3)发明人分析所得到的提取物质的理化性质、红外线光谱、核磁共振波谱、质谱等结果后，发现提取得到的物质的理化性质、基本结构与青蒿中的有效单体成分东莨菪素相似。经与东莨菪素标准品的核磁共振波谱、质谱进行比较后，发现各波谱结果与东莨菪素标准品符合。将提取物与东莨菪素标准品混合后测定熔点，混合熔点不下降，同时参照文献中东莨菪素的各波谱数据，可以确定分离得到的青蒿中的NF-kB的特异性抑制剂为已知的青蒿中有效单体成分一东莨菪素(Scopoletin)。3.Scopoletin应用后，结肠癌HT-29细胞球NF-kB的活性受到抑制，Scopoletin与5-FU联合应用对细胞球NF-kB活性的抑制作用更强。证实Scopoletin对肿瘤细胞NF-KB活性有抑制作用，请参照图2，其中1:对照组；2:Scp200Mg/ml组；3:5-FU组；4:FU+Scp50Mg/ml组；5:FU+Scp100Hg/ml组；6:FU+Scp200Mg/ml组)。4.单独Scopoletin应用后，与对照组比较，结肠癌HT-29细胞球细胞周期的变化不明显，大部分细胞位于G1期；而Scopdetin与5-FU联合应用后，结肠癌HT-29细胞球细胞周期明显受到影响，Gl期细胞明显减少，细胞向S期转化，且Scopoletin应用剂量越大效应越明显，请参照图3。5.Scopoletin与5-FU联合应用后，结肠癌HT-29细胞球细胞凋亡率与单独化疗组比较明显增加，且随着Scopoletin应用剂量的增力卩，细胞球细胞凋亡率增加越明显，存在剂量依赖效应，请参照图4。6.Scopoletin与5-FU联合应用后，结肠癌HT-29细胞球抗凋亡蛋白Bcl-2的表达与单独化疗组比较有所减少，而促凋亡蛋白FAS、FAS-L的表达较单独化疗组明显增多，且都具有剂量依赖效应，请参照图5。7.体内裸鼠移植瘤模型，Scopoletin与5-FU联合应用后肿瘤的瘤体积与单独化疗组比较有所减小，肿瘤的瘤重与单独化疗组比较也有所减轻，瘤体积抑制率、瘤重抑制率与单独5-FU组比较均明显增加，肿瘤生长受到抑制。各组平均瘤体积及平均瘤体积抑制率组别平均瘤体积(cm3)平均瘤体积抑制率(％)对照组1.91±0.27单独Scp200jxg/ml组1.78±0.096.81单独5-FU组1.40±0.17a26.705-FU+Scp50pg/ml组1.16±0.11b39.275-FU+Scpl00pg/ml组0.95±0.12e50.265國FU+Scp200pg/ml组0.72±0.12d62.30各组平均瘤重及平均瘤重抑制率<table>tableseeoriginaldocumentpage29</column></row><table>8.体内裸鼠移植瘤模型应用Scopoletin后，肿瘤组织NF-KB活性受到抑制，且Scopoletin与5-FU联合应用组肿瘤组织的NF-kB活性的抑制较单独化疗组更明显，且同样具有剂量依赖效应。Scopoletin不同处理组裸鼠肿瘤组织NF-KB活性的变化情况(EMSA图片)，请参照图6。9.Scopoletin与5-FU联合应用后，裸鼠移植瘤肿瘤组织中抗凋亡蛋白Bcl-2表达减少，促凋亡蛋白FAS、FAS-L的表达增加，且与Scopoletin的应用剂量有关，Scopoletin应用剂量越大，抗凋亡蛋白Bcl-2表达减少及促凋亡蛋白FAS、FAS-L的表达增加更明显，都具有剂量依赖效应，请参照图7。虽然本发明已以较佳实施例披露如上，然其并非用以限定本发明，任何所属
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的技术人员，在不脱离本发明之精神和范围内，当可作些许之更动与改进，因此本发明之保护范围当视权利要求所界定者为准。序列表<110>中国人民解放军第三军医大学；<120>—种核转录因子-kB抑制剂的筛选方法「'<130>〈160>2<170>Patentlnversion3.2〈210〉1<211>26〈212〉DNA〈213〉核因子-kB寡聚核苷酸探针序列<400>1agctt卿ggggsctttccgagagg326〈210>2〈211>26〈212>腿<213>核因子-kB寡聚核苷酸探针序列〈400〉2tcctctcggaaagtcccctctaagct2权利要求1.一种核转录因子-κB抑制剂的筛选方法，其特征在于包括以下步骤1)制备待筛选的提取物；2)在样品池中包被核转录因子-κB蛋白的，制得包被的核转录因子-κB蛋白；3)将步骤1)中得到的提取物与步骤2)得到的包被的核转录因子-κB蛋白结合，通过生物传感器进行结合洗脱，得洗脱液；4)分析步骤3)中得到的洗脱液，筛选出所述的核转录因子-κB抑制剂。2.根据权利要求1所述的核转录因子-KB抑制剂的筛选方法，其特征在于步骤2)中包括将生物素用作阻断样品池中的生物素结合位点。3.根据权利要求1所述的核转录因子-KB抑制剂的筛选方法，其特征在于步骤3)中包括以下步骤1)样品池中加入HBSTE缓冲液冲洗，至平衡后吸出以平衡基线；2)分别加入提取物溶液，至平衡后吸出，使提取物溶液与核转录因子-KB蛋白能够充分结合；3)加入HBSTE缓冲液冲洗，对未结合部分进行充分非特异性洗脱，平衡后吸出洗脱液。4)加入盐酸冲洗，对结合部分进行特异性洗脱，充分平衡后吸出洗脱液。4.一种使用权利要求1所述的筛选方法从青蒿中制备核转录因子-KB抑制剂的方法，其特征在于包括以下步骤1)处理青蒿，制得提取物；2)在样品池中包被核转录因子-KB蛋白的，制得包被的核转录因子-KB蛋白；3)将步骤1)中得到的提取物与步骤2)得到的包被的核转录因子-KB蛋白结合，通过生物传感器进行结合洗脱，得洗脱液；4)分析步骤3)中得到的洗脱液，筛选出所述的核转录因子-KB抑制剂。5.根据权利要求4所述的从青蒿中制备核转录因子-KB抑制剂的方法，其特征在于步骤l)中包括萃取处理，其中萃取剂为石油醚。6.根据权利要求4所述的从青蒿中制备核转录因子-KB抑制剂的方法，其特征在于步骤l)中包括层析处理，其中显色剂为硫酸乙醇。7.根据权利要求4所述的从青蒿中制备核转录因子-KB抑制剂的方法，其特征在于步骤l)中包括色谱法处理，其中洗脱系统为氯仿甲醇洗脱系统，或石油醚乙酸乙酯洗脱系统。8.根据权利要求4所述的从青蒿中制备核转录因子-KB抑制剂的方法，其特征在于包括使用如SEQIDNO:l-SEQIDNO:2所示的核转录因子-KB寡聚核苷酸探针序列检测所述的核转录因子-KB抑制剂的活性。全文摘要本发明涉及一种核转录因子-κB抑制剂的筛选方法，主要包括以下步骤1)制备待筛选的提取物；2)在样品池中包被核转录因子-κB蛋白的，制得包被的核转录因子-κB蛋白；3)将步骤1)中得到的提取物与步骤2)得到的包被的核转录因子-κB蛋白结合，通过生物传感器进行结合洗脱，得洗脱液；4)分析步骤3)中得到的洗脱液，筛选出所述的核转录因子-κB抑制剂。本发明中制得的核转录因子-κB抑制剂为天然中药的有效单体成分，其毒副作用小，安全性高、作用靶点特异，可用于制备核转录因子-κB抑制剂药物或抗肿瘤药物。文档编号C12Q1/68GK101403744SQ20081007028公开日2009年4月8日申请日期2008年9月11日优先权日2008年9月11日发明者张艳玲,彭亦良,李建军,梁后杰,凤潘,胡绍毅,边志衡,岚邹申请人:中国人民解放军第三军医大学