通过耐酸性改造在昆虫中组装口蹄疫病毒空衣壳的方法

专利名称：通过耐酸性改造在昆虫中组装口蹄疫病毒空衣壳的方法
技术领域：
本发明涉及一种通过耐酸性改造在昆虫中组装口蹄疫病毒空衣壳的方法。
技术背景口蹄疫(Foot-and-mouth disease, FMD)是偶蹄动物的一种急性烈性传染病，位 于A类动物传染病之首，世界各国均投入了巨额经费用于该病的防治。传统疫苗在 口蹄疫的防治中存在着不足，主要表现在疫苗使用的不安全性和难于进行感染动物 和免疫动物的鉴别诊断；同时在灭活疫苗的生产过程中，大量增殖自然病毒，需要 严格的防范病毒扩散的设施，尽管如此，仍然存在病毒逃逸和病毒灭活不完全而散 毒的可能性。2007-2008年英国口蹄疫的爆发就是因为病毒逃逸所致。口蹄疫病毒(FMDV)空衣壳具有与完整病毒相同的免疫学特性，但不存在散毒的风险，因而利 用各种表达系统生产FMDV的空衣壳一直是国内外研究的热点。FMDV衣壳呈二十面体对称结构，由60个相同的原体组成，每个原体由四种非 共价连接的蛋白组成，即VP4、 VP2、 VP3、 VP1。它们由氨基端至羧基端依次连接形 成P1聚蛋白。2A蛋白是FMDV的一个非结构蛋白，它的氨基端与P1聚蛋白的羧基 端连接形成融合蛋白P12A。在小RNA病毒科的所有病毒中，FMDV是对低pH值最敏感的。完整的FMDV在 pH值低于7的环境下，衣壳会解离成五聚体，它是由五个原体对称组装而成。在解 离过程中，RNA被释放出来，四条链中最小的一条链VP4就脱离原体。有资料表明 FMDV的酸不稳定性可能和五聚体一五聚体接触面上排列的组氨酸残基有关(Acharya R, Fry E, Stuart D I, et al. The three-dimersional structure of foot and mouth disease virus at 2.9A. Nature, 1989， 337: 709-716. Warwicker J. Model for the differential stabilities of rhinovirus and poliovirus to mild acidic pH based on electrostatics calculations. J. Mol. Biol. 1992,223: 247-257.) 。 Acharya等通过对一株 0型FMDV的3D结构分析表明，沿着一个原体的c90-A边缘排列的7个组氨酸残基(VP2上H21、 H65、 H87和H157; VP3上H141、 144和H191)离五聚体—五聚体接 触面很近，以使其能与相邻的五聚体上带电残基发生相互作用。由于组氨酸残基在 pH值低于7时带正电荷，这就使7个组氨酸残基和对面接触面上的组氨酸、赖氨酸和精氨酸有可能产生静电推斥作用。但是在相同区域带负电荷的残基(谷氨酸、天门冬氨酸)会屏蔽这个效应。事实上，7个氨基酸中只有2个氨基酸(VP3上H141 和H144)所在位置上的组氨酸、赖氨酸和精氨酸残基的数目(5:2)大大超过了对 面五聚体一五聚体接触面10A范围内谷氨酸和天门冬氨酸的残基数。Twomey等人 对一株A型FMDV病毒分析发现，它也有7个组氨酸残基(其中有4个在0型上是 相同的)沿着五聚体一五聚体接触面以相同的位置排列(TwomeyT, France LL, Hassard S, et al. Characterization of an acid-resistant mutant of foot-and-mouth cisease virus. Virology, 1995， 206: 69-75.)。同样只有2个组氨酸残基(VP3上H141和H 144) 和其它位置上带正电荷的氨基酸的数目(6:2和6:3)大大超过了对面五聚体一五 聚体接触面IOA范围内带负电荷的氨基酸的数目。Curry和Twomey等确定了决定 酸不稳定性的五聚体间接触面上的氨基酸可能是H142和H145 (Twomey T, France L L, Hassard S, et al. Characterization of an acid-resistant mutant of foot-and-mouth cisease virus. Virology, 1995, 206: 69-75. Curry S, Fry E, Crowther J C， et al. Viral RNA modulates the acid sensitivity of foot-and-mouth disease virus capsids. J. Virol. 1995, 69: 430-438.)。在Asial型FMDV中，相对应的组氨酸在VP3上140位和143位。杆状病毒表达系统具有表达水平高、重组蛋白具有完整的生物学功能、能进行 翻译后的加工修饰和能同时表达多个基因等诸多优点，在重组蛋白的表达中广泛应 用。但是由于昆虫细胞的培养基pH值在6.3左右，因此很难应用杆状病毒表达系 统在昆虫细胞中组装稳定的FMDV空衣壳蛋白。Soo-JeongKye等用杆状病毒表达系 统在Sf9昆虫细胞中表达了 FMDV五聚体结构，电子显微镜下观察到的五聚体结构 比完整的FMDV粒子小得多(Jae-Ku Oema, Jong-Hyeon Park, Kwang-Nyeong Lee， et al. Characterization of recombinant foot-and-mouth disease virus pentamer-like structures expressed by baculovirus and their use as diagnostic antigens in a blocking ELISA. Vaccine, 2007， 25: 4112-4121.)，这种五聚体结构是FMDV空衣壳组装过程中产生的 中间体，之所以没能成功地组成完整的空衣壳，主要原因可能是昆虫细胞培养基的 pH值影响了空衣壳的组装。 发明内容本发明的目的是提供一种通过耐酸性改造在昆虫细胞中组装口蹄疫病毒空衣 壳的方法及空衣壳蛋白和该空衣壳蛋白的用途。本发明所提供的口蹄疫病毒空衣壳蛋白，是将P12A进行耐酸性改造得到的突变蛋白，所述耐酸性改造是将P12A中VP3的自氨基末端第140-145位中的组氨酸 残基均突变为酸性环境中不带正电荷的氨基酸；所述酸性环境中不带正电荷的氨基酸可为除精氨酸和赖氨酸外的其他17种氨基酸；优选亮氨酸、异亮氨酸、缬氨酸、 丙氨酸、天冬氨酸、甘氨酸、蛋氨酸或苯丙氨酸；更优选亮氨酸、异亮氨酸或缬氨 酸。所述P12A的VP4、 VP2、 VP3、 VP1和2A蛋白均可来自同一毒株，也可分别来 自不同的毒株。本发明也涉及改进口蹄疫病毒空衣壳的耐酸性稳定性。通过突变病毒衣壳五聚 体接触面的带正电荷的氨基酸为不带正电荷的氨基酸，有利地增加了空衣壳的酸性 稳定性。由现有的7个血清型(Asial、 0、 A、 C、 SAT1、 SAT2、 SAT3)的口蹄疫病毒P12A 蛋白进行耐酸性改造得到的耐酸性空衣壳蛋白mP12A，具体可为1) 其氨基酸序列为序列表中的序列2，它是由氨基酸序列是自GenBank Accession Number EF149009的氨基末端第217-950位的Asial型FMDV的P12A蛋 白进行耐酸性改造得到的突变蛋白，该耐酸性改造是将P12A中VP3的自氨基末端 第140和143位(自序列表中序列2的氨基末端第429和432位)的组氨酸残基均 突变为天门冬酰胺、半胱氨酸、谷氨酸、谷氨酰胺、脯氨酸、丝氨酸、苏氨酸、酪 氨酸、色氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、缬氨酸、丙氨酸、天冬氨酸、甘氨酸、蛋氨酸 或苯丙氨酸；2) 由氨基酸序列是自GenBank Accession Number AF511039的氨基末端第 217-953位的0型FMDV的P12A蛋白进行耐酸性改造得到的突变蛋白，该耐酸性改 造是将P12A中VP3的自氨基末端第141位和第144位的组氨酸残基突变为天门冬 酰胺、半胱氨酸、谷氨酸、谷氨酰胺、脯氨酸、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、色氨酸、 亮氨酸、异亮氨酸、缬氨酸、丙氨酸、天冬氨酸、甘氨酸、蛋氨酸或苯丙氨酸；3) 由氨基酸序列是自GenBank Accession Number EF494487的氨基末端第 219-956位的A型FMDV的P12A蛋白进行耐酸性改造得到的突变蛋白，该耐酸性改 造是将P12A中VP3的自氨基末端第142位和第145位的组氨酸残基突变为天门冬 酰胺、半胱氨酸、谷氨酸、谷氨酰胺、脯氨酸、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、色氨酸、 亮氨酸、异亮氨酸、缬氨酸、丙氨酸、天冬氨酸、甘氨酸、蛋氨酸或苯丙氨酸；4) 由氨基酸序列是自GenBank Accession Number AM409325的氨基末端第217-948位的C型FMDV的P12A蛋白进行耐酸性改造得到的突变蛋白，该耐酸性改 造是将P12A中VP3的自氨基末端第140位和第143位的组氨酸残基突变为天门冬 酰胺、半胱氨酸、谷氨酸、谷氨酰胺、脯氨酸、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、色氨酸、 亮氨酸、异亮氨酸、缬氨酸、丙氨酸、天冬氨酸、甘氨酸、蛋氨酸或苯丙氨酸；5) 由氨基酸序列是自GenBank Accession Number NC011451的氨基末端第 215-960位的SAT1型FMDV的P12A蛋白进行耐酸性改造得到的突变蛋白，该耐酸性 改造是将P12A中VP3的自氨基末端第142位和第145位的组氨酸残基突变为天门 冬酰胺、半胱氨酸、谷氨酸、谷氨酰胺、脯氨酸、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、色氨 酸、亮氨酸、异亮氨酸、缬氨酸、丙氨酸、天冬氨酸、甘氨酸、蛋氨酸或苯丙氨酸;6) 由氨基酸序列是自GenBank Accession Number NC003992的氨基末端第 215-956位的SAT2型FMDV的P12A蛋白进行耐酸性改造得到的突变蛋白，该耐酸性 改造是将P12A中VP3的自氨基末端第142位和第145位的组氨酸残基突变为天门 冬酰胺、半胱氨酸、谷氨酸、谷氨酰胺、脯氨酸、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、色氨 酸、亮氨酸、异亮氨酸、缬氨酸、丙氨酸、天冬氨酸、甘氨酸、蛋氨酸或苯丙氨酸；7) 由氨基酸序列是自GenBank Accession Number AY593852的氨基末端第 215-956位的SAT3型FMDV的P12A蛋白进行耐酸性改造得到的突变蛋白，该耐酸性 改造是将P12A中VP3的自氨基末端第142位和第145位的组氨酸残基突变为天门 冬酰胺、半胱氨酸、谷氨酸、谷氨酰胺、脯氨酸、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、色氨 酸、亮氨酸、异亮氨酸、缬氨酸、丙氨酸、天冬氨酸、甘氨酸、蛋氨酸或苯丙氨酸。上述蛋白的编码基因也属于本发明的保护范围。 含有上述基因的重组载体和转基因细胞系也属于本发明的保护范围。 本发明的另一个目的是提供一种通过耐酸性改造在昆虫细胞中组装口蹄疫病 毒空衣壳的方法。本发明所提供的在昆虫细胞中组装口蹄疫病毒空衣壳的方法，包括以下步骤1) 将所述mP12A的编码基因和口蹄疫病毒的非结构蛋白基因3C通过杆状病毒 载体导入细菌内进行重组，得到重组杆状病毒A;2) 用所述重组杆状病毒A的DNA转染昆虫细胞，获得口蹄疫病毒空衣壳。 上述方法中还包括将用所述重组杆状病毒A的DNA转染昆虫细胞得到的重组杆状病毒再感染昆虫细胞，获得口蹄疫病毒空衣壳的步骤。mP12A的编码基因和口蹄疫病毒的非结构蛋白基因JC可通过下述两种方法之一导入细菌内a) 将mP12A的编码基因和口蹄疫病毒的非结构蛋白基因^7通过同一个含有双 启动子的杆状病毒载体导入细菌内，mP12A的编码基因插入所述双启动子杆状病毒 载体的一个启动子下游，口蹄疫病毒的非结构蛋白基因JC插入所述双启动子杆状 病毒载体的另一个启动子下游；b) 将mP12A的编码基因和非结构蛋白基因JC通过只含有一个启动子的杆状病 毒载体导入细菌内。所述双启动子杆状病毒载体为能在细菌内发生转座重组的载体；所述双启动子 杆状病毒载体优选为pFastBacTMDual。pFastBacTMDual可以同时表达两种异源蛋白，且该载体为非融合载体，可以使 表达的蛋白保持天然蛋白的特性。同时，本发明应用Bac-Bac杆状病毒表达系统通 过在细菌内发生转座重组制备重组杆状病毒，比传统的应用同源重组产生的重组体 病毒更具优点不需要多轮噬斑纯化，仅需2周时间就可以得到重组体杆状病毒； 可以同时快速的分离多个重组体病毒。上述细菌均指大肠杆菌。上述昆虫细胞可为Sf9细胞系、Sf21细胞系、High Five细胞系或其它昆虫细 胞系，优选为Sf9细胞系或High Five细胞系，其中，Sf9细胞的贴壁效果好。将利用上述方法在昆虫细胞中表达的蛋白进行SDS-PAGE和Westemblot检测，结 果表明，历尸7i^基因和FMDV衣壳蛋白组装必需的非结构蛋白3C基因在昆虫细胞中均 获得表达，且衣壳蛋白被3C蛋白酶成功地加工裂解。双抗体夹心ELISA和免疫荧光 检测结果表明，表达的mP12A蛋白主要集中在细胞膜上，且具有很好的抗原性。通 过电镜观察到重组杆状病毒在昆虫细胞内产生了直径约为30nm的空衣壳结构。利用上述方法制备的口蹄疫病毒空衣壳也属于本发明的保护范围。利用上述方法制备的口蹄疫病毒空衣壳可以应用于制备口蹄疫病毒疫苗或制 备口蹄疫病毒诊断试剂。本发明首次在昆虫细胞中组装成了完整的FMDV空衣壳，为基因工程亚单位疫 苗和新型诊断试剂的研发奠定了基础。


图1为JC基因和7基因的琼脂糖凝胶电泳结果图2为重组杆状病毒Bac mP12A3C-l和Bac P12A3C-1的PCR检测结果图3为Sf9细胞转染Bac mP12A3C-l后的具体形态图4为重组杆状病毒Bac mP12A3C-l转染High FiveTM昆虫细胞后的SDS-PAGE 检测结果图5为重组杆状病毒Bac mP12A3C-l转染High FiveTM昆虫细胞后的Western blot检测结果图6为重组杆状病毒Bac mP12A3C-l和Bac P12A3C-1分别感染High FiveTM细 胞后的间接免疫荧光检测结果图7为重组杆状病毒BacmP12A3C-l和BacP12A3C-l在昆虫细胞中组装口蹄 疫病毒空衣壳蛋白的电镜检测结果图8为重组杆状病毒BacmP12A3C-2和Bac P12A3C-2在昆虫细胞中组装口蹄 疫病毒空衣壳蛋白的电镜检测结果图9为重组杆状病毒BacmP12A3C-3和BacP12A3C-3在昆虫细胞中组装口蹄 疫病毒空衣壳蛋白的电镜检测结果具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明进一步详细说明，这些实施例并不限制本发明的 保护范围，所有基于本发明基本思路的修改和变形均属于本发明的保护范围。以将氨基酸序列是自GenBank Accession Number EF149009的氨基末端第 217-950位的Asial型FMDV的P12A蛋白进行耐酸性改造得到的突变蛋白，该耐酸 性改造是将P12A中VP3的自氨基末端第140位和第143位的组氨酸残基突变为均 突变为亮氨酸；以将氨基酸序列是自GenBank Accession Number AF511039的氨基 末端第217-953位的0型FMDV的P12A蛋白进行耐酸性改造得到的突变蛋白，该耐 酸性改造是将P12A中VP3的自氨基末端第141位和第144位的组氨酸残基均突变 为缬氨酸；以将氨基酸序列是自GenBank Accession NumberEF494487的氨基末端第 219-956位的A型FMDV的P12A蛋白进行耐酸性改造得到的突变蛋白，该耐酸性改 造是将P12A中VP3的自氨基末端第142位和第145位的组氨酸残基突变为缬氨酸 和异亮氨酸为例，阐明完整的FMDV空衣壳的制备方法。实施例l、 口蹄疫病毒空衣壳在昆虫细胞中的组装一、目的基因的克隆1、 RNA的提取和反转录按照RNeasy Mini Kit的操作说明书，分别从Asia I /JS/05株(国家农业部指定的口蹄疫病毒保藏机构国家口蹄疫参考实验室，参考文献Arch Virol, 2007,152:1699-1708 Comparisons of the complete genomes of two Chinese isolates of a recent foot-and-mouth disease type Asia 1 virus。 GenBank序歹(J号 EF149009) 、 O/Akesu/58和A/XJ/KT/58株(国家农业部指定的口蹄疫病毒保藏 机构国家口蹄疫参考实验室，参考文献Arch Virol， 2007, 152: 2079-2085 The complete genome sequence of foot-and-mouth disease virus O/Akseu/58 strain and its some molecular characteristics, GenBank序歹!j号AF511039禾口 AJ131665) 的FMDV适应细胞毒中提取细胞的总RNA，将得到的总RNA用引物 5， -CTTACTCGTGGTGTGGTTCGGGGTCGATG-3，反转录得到FMDV的cDNA。实验过程中， 所有器皿和试剂均经0. 1%的DEPC(焦碳酸二乙酯)水溶液进行去RNase处理。 2、目的基因的克隆按照TaKaRa RNA PCRKit(AMV) Ver. 3.0操作说明书，分别以步骤l反转录得到 的Asia I /JS/05株的FMDV的cDNA、 0/Akesu/58株的FMDV的cDNA和A/XJ/KT/58株的 FMDV的cDNA为模板，以3CF: 5， -AGGCCATGGAGAGTGGTGCCCCACCGACTGA-3，和3CR: 5， -AGGGTACCTTACTCGTGGTGTGGTTCGGGGTCGATG-3，为引物，PCR扩增衣壳蛋白组装 必需的非结构蛋白基因JC。对PC財广增产物进行琼脂糖凝胶电泳检测，结果表明， 均得到大小为639bp的5遂因片段。以步骤l反转录得到的Asial/JS/05株的FMDV的cDNA为模板，以P1F: 5， AGGGGATTCCATGGGCAACACTGGAAGCATCATTAAC-3'和IP1R: 5'-GATTCTAGATTACCCAGGGTTGGACTCCACGTCTCCTG-3，为引物，PCR扩增FMDV衣壳蛋白基因尸7i^-7;以步骤1反转录得到的O/Akesu/58株的FMDV的cDNA为模板，以P1F:5， AGGGGATTCCATGGGCAACACTGGAAGCATCATTAAC-3'和0P1R: 5'-GATTCTAGATTATCCGGGGTTGGACTCAACGTCTCCTG-3'为引物，PCR扩增FMDV衣壳蛋白基因/^24-2;以步骤l反转录得到的A/XJ/KT/58株的FMDV的cDNA为模板，以P1F: 5' AGGGGATTCCATGGGCAACACTGGAAGCATCATTAAC-3'和AP1R: 5'-GATTCTAGATTACCCGGGGTTGGACTCAACGTCTCCTG-3 ，为引物，PCR扩增FMDV衣壳蛋白基因尸7a-J。分别对PCR扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳检测，结果表明，得到预期大小约为2200bp的/l 24-2基因片段、2基因片段和3基因片段。FMDV衣壳蛋白基因/724-厶/^i^-i^I/^^-溯突变改造用连接PCR进行。以步 骤l扩增得到的Asia I /JS/05株的FMDV的cDNA为模板，以P1F:5' -AGGGGATCCATGGGCAACACTGGAAGCATCATTAAC-3'和MP1R:5' -GAGTCCAGTGTCCCACTCAGACAAAATGCACAATGCAGCCCGCTCCGGGTCCGCTGG-3' 为弓I 物，扩增得到突变改造的,7i^-7基因的上游片段；以MP 1F: 5 ， -GACCCGGAGCGGGCTGCATTGTGCATTTTGTCTGAGTGGGACACTGGACTCAATTCTAA-3 ，和P1R: 5， -GATTCTAGATTACCCAGGGTTGGACTCCACGTCTCCTG-3，为引物，扩增得到 突变改造的尸7W^基因的下游片段；以步骤1扩增得到的0/Akesu/58株的FMDV的 cDNA为模板，以P1F: 5， -AGGGGATTCCATGGGCAACACTGGAAGCATCATTAAC-3，和M0P1R: 5' -CAACCCTGTGTCCCACTCAGCMCAATGCAAACTGCAGCCGCTTCAGGTGTTTTCGG-3'为引物， 扩增得到突变改造的尸724-邀因的上游片段；以M0P1F: 5 ， -GAAAACACCTGAAGCGGCTGCAGTTTGCATTGTTTGGCTGAGTGGGACACAGGGTTG-3' 和P1R: 5， -GATTCTAGATTACCCAGGGTTGGACTCCACGTCTCCTG-3，引物，扩增得到突变 改造的尸W力-邀因的下游片段；以步骤l扩增得到的A/XJ/KT/58株的FMDV的cDNA为 模板，以P1F: 5， -AGGGGATTCCATGGGCAACACTGGAAGCATCATTAAC-3，和MAP1R: 5， -CAACCCTGTGTCCCACTCAGCAACGATGATGCATTGCAGCTTTCTCAGGCGTGTCCGG-3 ，为引物， 扩增得到突变改造的尸724-堪因的上游片段；以MAP 1F: 5 ， -GGACACGCCTGAGAAAGCTGCAGTTTGCATCATCGCTGAGTGGGACACAGGGTTG-3'禾口 P1R: 5， -GATTCTAGATTACCCAGGGTTGGACTCCACGTCTCCTG-3，引物，扩增得到突变改 造的尸724-堪因的下游片段。对PCR扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳检测，结果表明，得到大小均为1360bp的 突变改造的尸/^-厶3卩/7^-堪因的上游片段和920bp的突变改造的/^24-7、 堪因的下游片段。再分别以上述扩增得到的1360bp的突变改造的 厶"24-3B尸724-邀因的上游片段和920bp的突变改造的尸/24-厶^口 堪因的下游片段为模板，以P1F和P1R为引物，扩增得到突变改造的/724-厶 W^I-i和/7^-堪因；对PC財广增产物进行琼脂糖凝胶电泳检测，结果表明，得到 大小均约为2200bp的突变改造的尸724-厶i和尸7iM-邀因，分别将其命名为3、目的基因的鉴定将上述步骤2扩增得到的JC基因、7基因、yz7/^a-2基因、/aWa-J基 因、尸UU基因、尸7W-2基因和3基因分别与pGEM-T载体(Promega公司) 4"C连接过夜，连接产物转化大肠杆菌DH5 a感受态细胞，将转化后的大肠杆菌感受态细胞均匀涂布于含有Amp的LB琼脂平板上，挑取单个菌落，以质粒快速提取 试剂盒分别小量提取质粒，进行酶切和PCR鉴定，将PCR鉴定结果为阳性的重组质 粒送上海生工生物工程技术有限公司进行测序，将测序正确的重组质粒分别命名为 pGEM-3C、 pGEM-mP12A-1、 pGEM-mP12A-2、 pGEM-mP12A-3、 pGEM-P12A-1、 pGEM-P12A-2 和pGEM-P12A-3。1的脱氧核糖核苷酸序列如序列表中序列1所示，其所编 码的氨基酸序列如序列表中序列2所示，其中，自其氨基末端第429位和432位为 亮氨酸(即VP3的自其氨基末端第140位和143位为亮氨酸)；2所编码的 氨基酸序列是将自GenBank Accession Number AF511039的自氨基末端第217-953 位的0型FMDV的P12A蛋白中VP3的自氨基末端第141位和第144位的组氨酸残基 均突变为缬氨酸所得；历尸7i^1-3所编码的氨基酸序列是将自GenBank Accession Number EF494487的自氨基末端第219-956位的A型FMDV的P12A蛋白中VP3的自 氨基末端第142位和第145位的组氨酸残基突变为异亮氨酸和缬氨酸所得；3C的脱 氧核糖核苷酸序列如序列表中序列4所示；尸7i^-7所编码的氨基酸序列如序列表中 序列3所示。二、重组转移载体的构建将实步骤一构建的重组质粒pGEM-3C经7Vco I和尺/w I酶切后，与经同样酶切 处理的pFastBacTMDual (Invitrogen公司)连接，连接产物转化大肠杆菌DH5 a感受 态细胞，将转化后的大肠杆菌感受态细胞均匀涂布于含有Amp的LB琼脂平板上， 挑取单个菌落，以质粒快速提取试剂盒小量制备质粒，进行PCR、酶切和电泳检测， 结果表明，获得大小为639bp的酶切片段，将PCR鉴定为结果为阳性的重组质粒命 名为pFastDual-3C。以重组质粒pFastDual-3C为模板，以3CR和3CF为引物，进行 PCR扩增，结果也获得639bp的片段，与预期大小相符，表明3C基因已经与转移载 体pFastBacTMDual (Invitrogen公司)正确连接，置于杆状病毒P,。启动子的控制之 下。将步骤一构建的重组质粒pGEM-P12A-1和pGEM-mP12A-l、 pGEM-P12A-2和 pGEM-mP12A-2、 pGEM-P12A-3和pGEM-mP12A-3分别用5^n/H和I酶切后，与 用同样酶切处理的重组质粒pFastDual-3C连接，连接产物转化大肠杆菌DH5 a感受 态细胞，将转化后的大肠杆菌感受态细胞均匀涂布于含有Amp的LB琼脂平板上， 挑取单个菌落，提取质粒，进行PCR、酶切和电泳检测。电泳结果如图l所示。其 中，M为DNA分子量标准，泳道1和2为JC基因的PCR扩增产物的琼脂糖凝胶电泳检测结果，泳道3为尸7^4基因的PCR扩增产物的琼脂糖凝胶电泳检测结果。将PCR鉴定为阳性的重组质粒分别命名为pFastDual-mP12A3C-l、 pFastDual-mP12A3C-2、 pFastDual-mP12A3C-3、 pFastDual-P12A3C-l、 pFastDual-P12A3C-2和pFastDual-P12A3C-3 。分别以重组质粒 pFastDual-mP12A3C-l、 pFastDual-mP12A3C-2、 pFastDual-mP12A3C-3为模板，以 P1F和P1R为引物，分别进行PCR扩增，结果均获得约2200bp的片段，与预期大小 相符，表明基因/z 尸^4-厶2和/m。"U已经与转移载体pFastBacTMDual (Invitrogen公司)正确连接，并置于杆状病毒&启动子的控制之下。 三、重组杆粒的获得将步骤二获得的重组质粒pFastDual-mP12A3C-l、 pFastDual-mP12A3C-2、 pFastDual-mP12A3C-3、 pFastDual-P12A3C-l、 pFastDual-P12A3C-2禾口 pFastDual-P12A3C-3分别转化大肠杆菌DHlOBac(Invitrogen公司)感受态细胞， 取lpL上述感受态细胞涂布于LB选择培养平板上(卡那霉素50|ig/mL、庆大霉素 7pg/mL、四环素10吗/mL、 IPTG 40|xg/mL、 Bluo-gal 100|ig/mL) ， 37。C培养48h后 挑选白色菌落，接种于液体LB培养基上，37°。振摇12 h，用S.N.A.P. MidiPrep Kit 试剂盒(Invitrogen公司)分别提取杆粒pFastDual-mP12A3C-l、 pFastDual-mP12A3C-2、 pFastDual-mP12A3C-3、 pFastDual-P12A3C-l、 pFastDual-P12A3C-2和pFastDual-P12A3C-3的DNA，具体操作按照试剂盒说明书进 行。分别以所得三种杆粒的DNA为模板，以M13 Forward(-40) 5， -GTTTTCCCAGTCACGAC-3，和M13 Reverse 5， -CAGGAAACAGCTATGAC-3，为引物， 进行PCR扩增。对PCR扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳检测，具体的检测结果如图2所示。其中， M为DNA分子量标准，1和2为野生型杆粒的PCR检测结果，3和4为重组杆粒 pFastDual-mP12A3C-l的PCR检测结果，5和6为重组杆粒pFastDual-P12A3C-l的 PCR检测结果。结果表明，野生型杆粒PCR扩增产物的大小为300bp，重组型杆粒PCR扩增 产物的大小为5401bp。将插入历尸7^-7基因和JC基因的重组杆粒命名为Bac mP12A3C-l，将插入历尸"U基因和^基因的重组杆粒命名为Bac mP12A3C-2， 将插入J基因和JC基因的重组杆粒命名为Bac mP12A3C-3，将插入尸7^-7 基因和3C基因的重组杆粒命名为BacP12A3C-l，将插入尸7i^-i"基因和JC基因的重组杆粒命名为Bac P12A3C-2，将插入尸"U基因和JC基因的重组杆粒命名为 BacP12A3C-3。四、 重组杆状病毒的获得用S.N.A.P.TMMidiPrep Kit试剂盒提取重组杆粒Bac mP12A3C-l 、 Bac mP12A3C-2、 Bac mP12A3C-3和Bac P12A3C-1、 BacP12A3C-2、 BacP12A3C-3的DNA，分别将提取得到的高纯度的杆粒DNA lpg用Cellfectin⑧转染试剂转染对数生长 期的Sf9细胞(Invitrogen公司)。转染Bac mP12A3C-l、 Bac mP12A3C-2、 Bac mP12A3C-3后Sf9细胞逐渐发生改变，倒置显微镜下观察到细胞发生典型病变后， 收获细胞培养上清，此为第一代病毒，4。C保存备用。Sf9细胞转染BacmP12A3C-l 后的具体形态如图3所示。其中，A为未转染重组杆状病毒的正常Sf9细胞的形态， B为转染重组杆状病毒Bac mP12A3C-l后Sf9细胞的形态，C为转染重组杆状病毒 BacP12A3C-l后Sf9细胞的形态。五、 重组蛋白的表达与检测1、 SDS-PAGE和Western blot检测将上述步骤四获得的第一代重组杆状病毒Bac mP12A3C-1、 Bac raP12A3C-2和 BacmP12A3C-3分别在Sf9细胞中进行扩增，用噬斑法确定滴度后，分别以10个感 染复数(Multiplicity of Infection, MOI)的上述两种重组病毒接种对数生长期的High Five 昆虫细胞(Invitrogen公司)，72h后收获细胞及培养上清。将收获的细胞用 细胞裂解液裂解后，进行SDS-PAGE检测，培养上清则直接用于SDS-PAGE检测，同 时以未接种重组病毒的High Five 昆虫细胞以及转染Bac P12A3C-1、 Bac P12A3C-2 和Bac P12A3C-3的High Five 昆虫细胞裂解液作为对照。将电泳蛋白带转印至硝 酸纤维素膜上，PBST洗涤硝酸纤维素膜后，用3。/。的BSA37X:封闭45niin，再用PBST 洗涤后分别加入Asia I型FMDV感染猪血清(Asia I /JS/05株免疫猪得到的血清)、 O型FMDV感染牛血清(0/Akesu/58株免疫牛得到的血清)和A型FMDV感染牛血清 (A/XJ/KT/58株免疫牛得到的血清)于37。C作用lh， PBST洗涤后加入1:20000稀 释的服P-兔抗猪IgG 37。C作用lh。充分洗涤，加入DAB-HA显色，观察特异性条 带。SDS-PAGE检测结果如图4所示，其中，M为14-116KDa的蛋白分子量标准，1 为重组杆状病毒Bac P12A3C-1转染High FiveTM昆虫细胞后培养上清的SDS-PAGE 检测结果，2和3为重组杆状病毒Bac mP12A3C-l转染High FiveTM昆虫细胞后培养上清的SDS-PAGE检测结果，4为未转染任何重组杆状病毒的正常High FiveTM昆虫 细胞裂解液的SDS-PAGE检测结果，5为转染野生型杆状病毒的High FiveTM昆虫细 胞裂解液的SDS-PAGE检测结果，6为转染野生型杆状病毒的High FiveTM昆虫细胞 培养上清的SDS-PAGE检测结果，7为重组杆状病毒Bac mP12A3C-l转染High Five 昆虫细胞后细胞裂解液的SDS-PAGE检测结果，8为重组杆状病毒Bac P12A3C-1转 染High FiveTM昆虫细胞后细胞裂解液的SDS-PAGE检测结果。SDS-PAGE检测结果表明，重组杆状病毒感染细胞的培养上清比作为对照的野生 型杆状病毒感染细胞的培养上清在80kDa (PI) 、 47kDa (VP31) 、 33kDa (VPO)、 24kDa (VP3)和23kDa (VP1)处多出条带，说明历尸/24-么3基因 和JC基因均在昆虫细胞中获得表达，且raP12A-l蛋白、mP12A-2蛋白和mP12A-3 蛋白均被3C蛋白酶成功地加工裂解。对上述表达产物进行Western blot分析，结果出现了 5条反应条带(Pl、 VP31、 VP0、 VP3和VP1) ， Western blot检测结果如图5所示。其中，1和2为重组杆状病 毒Bac mP12A3C-l转染High FiveTM昆虫细胞后的Western blot检测结果，3禾B 4为 重组杆状病毒BacP12A3C-l转染High Five 昆虫细胞后的Western blot检测结果。 结果表明，表达产物能与FMDV阳性血清发生反应，且具有很高的特异性。2、间接免疫荧光检测用重组杆状病毒BacmP12A3C-l、 Bac mP12A3C-2、 Bac mP12A3C-3、 Bac P12A3C-l、BacP12A3C-2和BacP12A3C-3分别感染HighFiveTM细胞，12h后，用3. 7% 的多聚甲醛固定细胞10min，用含有iy。BSA的PBS洗涤2次，再用50mraol/L NHX1淬灭 10min。分别加入Asia I型FMDV兔抗血清(Asia I/JS/05株免疫兔得到的血清)、O 型FMDV兔抗血清(0/Akesu/58株免疫兔得到的血清)和A型FMDV兔抗血清 (A/XJ/KT/58株免疫兔得到的血清)于37t:作用40min。用含有P/。BSA的PBS洗涤后 加入荧光素标记的羊抗兔抗血清于37。C作用15-30min。 PBS洗涤后用甘油封片，荧 光显微镜观察。间接免疫荧光检测结果如图6所示。其中，Al和A2分别为重组杆状病毒Bac mP12A3C-l和BacP12A3C-l感染HighFiveTM细胞后的间接免疫荧光检测结果，B为 野生型杆状病毒感染HighFiveTM细胞后的间接免疫荧光检测结果。间接免疫荧光检测结果表明，重组杆状病毒BacmP12A3C-l、 Bac mP12A3C-2、 BacmP12A3C-3、 BacP12A3C-l、 Bac P12A3C-2和Bac P12A3C-3感染的昆虫细胞显示强荧光信号，并且荧光主要集中在细胞膜上，而野生型杆状病毒感染的HighFiveTM昆虫细胞荧光信号为阴性，表明历尸724-厶么zz 尸^4-堪因和/724-厶 么堪因在High FiveTM昆虫细胞中均获得表达。 六、空衣壳结构电镜观察将上述步骤四获得的重组杆状病毒BacmP12A3C-l、 Bac mP12A3C-2、 Bac mP12A3C-3培养至第3代后分别感染HighFiveTM细胞，96h后细胞病变完全，离心 收集细胞，加细胞裂解液裂解后，离心取上清20uL，磷鸨酸负染色后置电子显微 镜下观察空衣壳结构。电镜观察结果如图7、图8和图9所示。其中，图7A、图8A和图9A分别为改 造后的/7^基因(即/ z/VZ4-7、 /w/^a-2和/a^i^-J基因)在昆虫细胞中表达后组装 为完整的空衣壳，图7B、图8B和图9B分别为未改造的尸7^基因卿尸^4-厶尸"力-2 和/V^-J基因)在昆虫细胞中表达后观察不到空衣壳。结果表明，通过耐酸性改造 的重组杆状病毒BacmP12A3C-l、 Bac mP12A3C-2、 BacmP12A3C-3在感染细胞中 产生了直径约为30nra的空衣壳结构，呈正六边形，大小和形状与FMDV 75S衣壳结 构相似，而重组杆状病毒BacP12A3C-l、 BacP12A3C-2、 Bac P12A3C-3在感染细 胞中不能得到FMDV空衣壳。序列表<160〉 4〈210〉 1〈211〉 2208<212> DNA <213〉人工序列<400> 1atgggcaaceictggaagcatcatteiEicaac tactacatgcgigc3gtaccagaactccatg60gacacgcaacttggagataatgctatcagc ggaggctcca3cgagggttccacggacacc120acstcc3C3Cacacaaacaacacccaaaac aatgattggttctcacgcttggccaactcg180gcctttagcgg3Ctgtttggtgctcttttg gctgacaagaa肌cggaggagacaactctg240cttgaagaccgcattctcaccaccagaaat ggccacacgacgtcgacgac3ceigtcgEigt300gttggcgtaacatatggttacgctgtggct ga卿cgcggtatctgggcctaacacctca360ggcctggagacccgcgtaacacaggctgaa cggttcttcaagaaacacctgtttgactgg420acgccggatttgtcatttggacactgtca_c tacttggaactcccctctga3C3C肌gggC480gtgtttggcagcctcatgagctcttatgct tacatgagga3CgggtgggElcgttgaggtg540accgctgttggaaatcagttcaatggtggt tgtctcctcgtcgcactcgtgccggeigctg600ataaagctcggC8CgCggC3gaagtatcag ttaaccctcttCCC3C8CC3gttcattaac660ccgcgcacta3C3tgacggctcacattaac gtgccgtacgtgggtgtcaacaggtacgac720C3gt3Cg3gCtccac肌accgtggacgctt gtggtgatggtggtggccccgcttaccgtc780aaaactggtggttctgaacag3tc33ggtc tacatgaMgcagcgccgacctacgtgcac840gtggcagg叫aactgccctcg朋卿gggg 8t3gttCCtgtggcgtgtgtggacggttac900ggC纖3tggtaaccacggacccgaagacg gctgaccccgtctacgggaaagtgtctaac960cccccca_gaacaagcttccctgggcgtttc acaaacttccttgatgtsgcggaggcgtgt1020ccgaccttcctccgcttcggagaagtacca tttgtgaagacggtgaactctggtgaccgc1080ttgcttgccaagtttgacgtgtccctcgct gcggggcacatgtccaacacctacttggca1140ggtttggcacagtactscac3C3gtax:3gc ggcactatgaatatccacttcatgttcacc1200ggacccacggatgccaaagcccgctacatggtggcttacatacctcctggtatgacaccg1260ccagcggacccggagcgggctgcattgtgcattttgtctgagtgggacactggactcaat1320tctaaattt3ccttttctatcccttacctttctgctgcagactatgcttacactgcttct1380gacgtggctgagaccacgagtgtgcagggatgggtgtgtatttaccagatcacccacggt1440gtgacgcgctggtcgtgtccgtcagcgctggcaaggactttgagtttcga1500ctaccggtggatgcccgccaacagactaxxaccaccggcg3gtccgc3ga_cccagtcacc1560accacggttg邓aactacggaggagaaacccagacggcccgacggcttcacactgatgtc1620gccttcgttctcgacaggttcgtgaaactcaccca_gccc3agagcacccaaacccttgat1680ctcEitgcag3tcccctcacacacactggtcggggcgcttctccggtctgcgacgtactac1740ttctcagatctggaggttgcgctcgtccacacaggaccggtC3Cgtgggtgcccaatggt1800gcgcctaagaccgccttgaaaacccgactgcct3ccagaagcagcctatc1860acccgcttggcactcccctacaccgctccccaccgtgtgctgtcaacagtgt3C38Cggg1920atcctcgcggcgtgatgatcttgccgccctCgC3CgC8gEl1980gtg3gC犯CCggctgcccacttccttcaactacggcgctgtgaaggccgacaccatcacg2040gagctgttgatCCgC3tg犯gcgtgcggaaacatactgccccaggcccttgctggctctt2100g3ca_cc3C3caagaccgccgtaaacaggagatcattgc3cctgagaaacagactttgaac2160tttgacctactcaagttggcaggagacgtggagtccaaccctgggtaa2208〈210〉 2<211〉 735<212〉 PRT 〈213〉人工序列<220〉〈221> MISC一FEATURE<222〉 (429)〈223〉 Xaa=Leu或lie或Val或Ala或Asp或Gly或Met或Phe或Asn或Cys或 Glu或Gin或Pro或Ser或Thr或Tyr或Trp〈220〉<221〉 MISC—FEATURE <222> (432)<223> Xaa=Leu或lie或Val或Ala或Asp或Gly或Met或Phe或Asn或Cys或 Glu或Gin或Pro或Ser或Thr或Tyr或Trp<400〉 2Met Gly Asn Thr Gly Ser lie lie Asn Asn Tyr Tyr Met Gin Gin Tyr15 10 15Gin Asn Ser Met Asp Thr Gin Leu Gly Asp Asn Ala lie Ser Gly Gly20 25 30Ser Asn Glu Gly Ser Thr Asp Thr Thr Ser Thr His Thr Asn Asn Thr35 40 45Gin Asn Asn Asp Trp Phe Ser Arg Leu Ala Asn Ser Ala Phe Ser Gly50 55 60Leu Phe Gly Ala Leu Leu Ala Asp Lys Lys Thr Glu Glu Thr Thr Leu 65 70 75 80Leu Glu Asp Arg lie Leu Thr Thr Arg Asn Gly His Thr Thr Ser Thr85 90 95Thr Gin Ser Ser Val Gly Val Thr Tyr Gly Tyr Ala Val Ala Glu Asp100 105 110Ala Val Ser Gly Pro Asn Thr Ser Gly Leu Glu Thr Arg Val Thr Gin115 120 125Ala Glu Arg Phe Phe Lys Lys His Leu Phe Asp Trp Thr Pro Asp Leu130 135 140Ser Phe Gly His Cys His Tyr Leu Glu Leu Pro Ser Glu His Lys Gly 145 150 155 160Val Phe Gly Ser Leu Met Ser Ser Tyr Ala Tyr Met Arg Asn Gly Trp165 170 175Asp Val Glu Val Thr Ala Val Gly Asn Gin Phe Asn Gly Gly Cys Leu 180 185 190Leu Val Ala Leu Val Pro Glu Leu lie Lys Leu Gly 195 200 Leu Thr Leu Phe Pro HisTyr Gin 210Met Thr Ala His lie Asn 225 230 Gin Tyr Glu Leu His Lys 245Pro Leu Thr Val Lys Thr 260Asn Ala Ala Pro Thr Tyr 275Glu Gly lie Val Pro Val290 Thr Thr 305Pro ProPro 215Val Pro Tyr ValGin Phe lie Asn 220 ValThr 205 ProAsnPro Trp ThrAsp Pro Lys ArgThrThr 310 PheGlyValAla 295 AlaTrp GlyGly 235Val Val Met ValArg Gin Lys Arg Thr Asn ArgLeu 250Glu Gin lie LysSer 265Val Ala Gly GluTyr Asp 240 Val Ala 255Tyr MetPro Gly ArgSer 325Pro Thr Phe LeuHis 280Cys Val Asp Asp Pro Vsl GlyGlyGlyTyr 315 ThrVal 270Pro Ser LysTyr 300 GlyAsnLeu 285Gly Asn Met ValLys PheAla Glu Ala Cys 340Asn Ser Gly AspPhe 330Phe Gly Glu ValLys Thr Val 355Ala Gly His MetArg 345Leu Leu Ala LysLeu Ala 370Tyr Tyr Thr Gin Tyr 385Gly Pro Thr AspArg 360Asn Thr Tyr LeuVal Ser Asn 320Leu Asp Val335 Pro Phe Val 350Asp Val SerSer 375Gly Thr Met AsnPhe 365Gly Leu Ala GinSer 390Lys Ala Arg TyrAla 380His Phe MetGly Met Thr Pro 420Ala 405Pro Ala Asp Prolie 395Val Ala Tyr lieGlu 425Met 410Arg Ala Ala XaaCys 430Phe Thr 400 Pro Pro 415lie XaaSer Glu Trp Asp Thr Gly Leu Asn Ser 435Ser Ala AlaTyr Leu 450Thr Thr Ser Val Gin 465Lys Ala Glu GlyGly AspTyr 455 TrpAsn 440 AlaValTyr CysGly 470Ala Leu Val ValPhe Glu Phe Arg 500 AlaAsp 485Leu Pro Val AspGly Glu Ser 515 GinGlu Thr 530 Asp Arg 545Leu Met Gin lieAsp Pro Val AlaPhe Val LysAla 505 ThrLys Phe "Thr Phe 445Thr Ala Ser Asp 460lie Tyr Gin lie 475Ser Val Ser Ala 490Arg Gin Gin ThrThr Ala ArgLeu 550SerPro 565Phe Ser Asp LeuAla Thr Tyr Tyr Phe Ser Asp Leu Glu 580 585 Trp Val Pro Asn Gly AlaThr Thr Thr Val Glu Asn 520 525 Leu His Thr Asp Val Ala 540Gin Pro Lys Ser Thr Gin 555His Thr Leu Val Gly Ala Leu 570Val Ala Leu ValArg 535 ThrPro Val Thr 595His Thr Asn Pro Thr Ala 610Leu Pro Tyr Thr Ala Pro 625 630 Lys Thr Thr Tyr Gly GluLeu Ala Arg Arg 660Gly 645Val Ser Asn ArgGly Ala Pro Lys Thr Ala 600 605 Tyr Gin Lys Gin Pro lie Thr 615 620 His Arg Val JLeu Ser Thr Val 635Glu Ser Ser Arg Arg Asp Asp 650Pro Thr Ser PheLeu 665Ser lie ProVal Ala GluThrGlyThrLeuHis Gly ■ Lys Asp 495Thr ThrThr 510Tyr Gly Gly Phe Val LeuLeu Asp 560 Arg Ser 575Thr GlyHis 590Leu Asn AsnArg Leu AlaTyr Asn Gly 640Leu Alei Ala655 Asn Tyr Gly 670Ala Val Lys Ala Asp Thr lie Thr Glu Leu Leu lie Arg Met Lys Arg675 680 685Ala Glu Thr Tyr Cys Pro Arg Pro Leu Leu Ala Leu Asp Thr Thr Gin690 695 700Asp Arg Arg Lys Gin Glu lie lie Ala Pro Glu Lys Gin Thr Leu Asn 705 710 715 720Phe Asp Leu Leu Lys Leu Ala Gly Asp Val Glu Ser Asn Pro Gly 725 730 735〈210〉 3〈211〉 735<212> PRT 〈213>人工序列<400> 3Met Gly Asn Thr Gly Ser lie lie Asn Asn Tyr Tyr Met Gin Gin Tyr15 10 15Gin Asn Ser Met Asp Thr Gin Leu Gly Asp Asn Ala lie Ser Gly Gly20 25 30Ser Asn Glu Gly Ser Thr Asp Thr Thr Ser Thr His Thr Asn Asn Thr35 40 45Gin Asn Asn Asp Trp Phe Ser Arg Leu Ala Asn Ser Ala Phe Ser Gly50 55 60Leu Phe Gly Ala Leu Leu Ala Asp Lys Lys Thr Glu Glu Thr Thr Leu 65 70 75 80Leu Glu Asp Arg lie Leu Thr Thr Arg Asn Gly His Thr Thr Ser Thr85 90 95Thr Gin Ser Ser Val Gly Val Thr Tyr Gly Tyr Ala Val Ala Glu Asp100 105 110Ala Val Ser Gly Pro Asn Thr Ser Gly Leu Glu Thr Arg Val Thr GinAlaSer 145 ValTyrGluThr 305 ProGlu 130 PhePhe115Arg Phe Phe Lys120His Leu Phe AspGly His Cys GlyLys 135Tyr Leu Glu LeuSerHis 150Met Ser Ser TyrLeu 165Thr Ala Val GlyPro 155 Tyr125 Trp Thr Pro 140Ser Glu HisMetAsp Val Glu Val 180Leu Val Pro GluAla 170Gin Phe AsnLeu Val Ala 195Leu Thr Leu PheAsn 185lie Lys Leu GlyGin 210Thr Ala His lieLeu 200His Gin Phe lieMet 225Gin Tyr Glu LeuPro Leu Thr Vsl 260 ProAsn 230 LysPro 215Val Pro Tyr ValAsn 220 ValArgGlyThr 205 ProAsnProHis 245Lys Thr GlyTrp GlyThr Leu 250Glu Gin lie LysThrAsn Ala Ala 275lie Val ProGly 290 ThrProAsp Pro Lys ArgThrTyrValThr 310 PheValAla 295 AlaProSer 265Val Ala Gly GluSer 325Pro Thr Phe LeuHis 280Cys Val Asp Asp Pro Val GlyGly GlyAsnGly 235Val Val Met ValVal 270 ProArgTyr 315Thr Asn Phe LeuPhe 330Phe Gly Glu ValAspLysGly 175 CysLeuGly 160 TrpLeuGly 190Arg Gin Lys Arg Thr Asn ArgTyrVal 255 TyrSerLeu 285Gly Asn MetTyr 300Gly Lys Val SerAsp 335 PheAsp 240 AlaMetLysValAsn 320 ValValAla Glu Ala Cys Pro Thr Phe Leu Arg Phe Gly Glu Val Pro 340 345 350Lys Thr Val Asn Ser Gly Asp Arg Leu Leu Ala Lys Phe Asp Val Ser24355Ala Gly His MetLeu Ala 370Tyr Tyr Thr Gin Tyr 385Gly Pro Thr Asp360Asn Thr Tyr LeuSer 375Gly Thr Met Asn365Gly Leu Ala GinSer 390Lys Ala Arg TyrAla 380His Phe MetGly Met Thr Pro 420 AspAla 405Pro Ala Asp Prolie 395Val Ala Tyr lieMet 410Arg Ala Ala HisThrSer Glu Trp 435Tyr Leu Ser Ala Ala 450Thr Thr Ser Val Gin 465Lys Ala Glu GlyGly AspLeuTyr 455 TrpAsn 440 AlaValGlu 425Ser Lys Phe ThrGly 470Ala Leu Val ValTyr Thr Ala CyslieSer 460 GinAsp 485Leu Pro Val AspPhe Glu Phe Arg 500Ala Asp Pro ValSer 490Arg Gin Gin ThrGly Glu Ser 515Gin Thr Ala ArgAla 505Thr Thr Val GluGlu Thr 530Asp Arg Phe Val Lys 545Leu Met Gin lieThr 520Leu His Thr AspArg 535Thr Gin Pro LysLeu 550Ser His Thr LeuPro 565Phe Ser Asp LeuAla Thr Tyr Tyr 580Pro Val Thr Trp Val Pro Asn Gly Ala Pro Lys Thr Ala Leu Asn AsnGlu 585 AlaVal 570Val Ala Leu ValCys 楊 SerPhe Thr 400 Pro Pro 415lie His lie ProPhe 445Asp Val Ala GluTyr 475Val Ser Ala Glylie Thr His Gly 480 Lys Asp 495Thr ThrThr 510Tyr Gly GlyAsn 525Ala Phe Val LeuVal 540Thr Gin ThrSer 555Gly Ala Leu LeuHis 590 LeuLeu Asp 560 Arg Ser 575Thr Gly595Asn Pro Thr AlaHis Thr 610Leu Pro Tyr Thr Ala 625Lys Thr Thr600Gin Lys Gin ProTyr 615His Arg Val LeuPro 630Glu Glu Ser SerTyr Gly 645Leu Ala Arg Arg Val Ser Asn Arg 660Ala Asp Thr lieArg 650 ProSer 635 ArgThrAla ValAla Glu 690 Asp Arg 705Phe AspLys 675 ThrArgLeuTyr CysLys GinLeu Lys 725ProArg 695 lieThr 680Pro Leu Leu Alalie 620 ThrLeu 665Glu Leu Leu lie605 ThrValArg Leu Ala TyrAsp Asp Leu SerPheAsn 670 MetAsnAla 655 TyrGlu 710Leu Ala Gly AspLeu 700Lys Gin Thr Leulie Ala Pro Glu 715Glu Ser Asn ProVal 730Gly 640 AlaGlyArg 685Asp Thr Thr GinAsn 720Gly 735〈210〉 4<211> 642<212> DNA <213>人工序列<400〉 4agtggtgccccaccgactgacttgcaaaagatggtcatgggcaacaccaagcctgttgag60ctcatcctcg3CggC33g3Cggt3gCC3tCtgctgcgctaccggagtctttggtactgcc120tacctcgagcctcgtcaccttttcgcagagaagtacgacaagatcatgctggacggcaga180gccatgacagacagtgactacagagtgtttgagtttgagattaeiagta^aaggacaggac240atgctctcagacgccgcactcatggtgctcc織gtgggaatcgcgtgcgtgacatcacg300aagcacttccgtgatgtagcc肌g3tga3gaaaggaacccccgtcgttggtgtga/ttaac360aacgccgacg ttgggagact gattttctct ggtgaggccc taacctacaa agacattgta 420gtgtgcatgg acggagacac catgcctggg ctttttgcct acaaggccgt caccagggcg 480ggctactgtg gaggagccgt tctcgcgaag gacggagccg agactttcat cgtcggcact 540cactccgcag gcggcaacgg agttggatac tgctcgtgcg tttccaggtc catgctgctc 600aagatgaaigg ctcaceitcgs ccccgeiacca caccacga_gt犯 64权利要求
1. 一种空衣壳蛋白，是将口蹄疫病毒的P12A进行耐酸性改造得到的突变蛋白；所述耐酸性改造是将口蹄疫病毒的P12A中VP3的自氨基末端第140-145位中的组氨酸残基突变为酸性环境中不带正电荷的氨基酸；所述酸性环境中不带正电荷的氨基酸为天门冬酰胺、半胱氨酸、谷氨酸、谷氨酰胺、脯氨酸、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、色氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、缬氨酸、丙氨酸、天冬氨酸、甘氨酸、蛋氨酸或苯丙氨酸；优选为亮氨酸、异亮氨酸、缬氨酸、丙氨酸、天冬氨酸、甘氨酸、蛋氨酸或苯丙氨酸；更优选为亮氨酸、异亮氨酸或缬氨酸；所述P12A的VP4、VP2、VP3、VP1和2A蛋白均来自口蹄疫病毒的同一毒株，或分别来自口蹄疫病毒的不同毒株。
2、 根据权利要求l所述的蛋白，其特征在于所述空衣壳蛋白为下述七种蛋白之一1) 其氨基酸序列为序列表中的序列2;2) 由氨基酸序列是自GenBank Accession Number AF511039的氨基末端第 217-953位的0型FMDV的P12A蛋白进行耐酸性改造得到的突变蛋白，该耐酸性改 造是将P12A中VP3的自氨基末端第141位和第144位的组氨酸残基突变为天门冬 酰胺、半胱氨酸、谷氨酸、谷氨酰胺、脯氨酸、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、色氨酸、 亮氨酸、异亮氨酸、缬氨酸、丙氨酸、天冬氨酸、甘氨酸、蛋氨酸或苯丙氨酸；3 )由氨基酸序列是自GenBank Accession Number EF494487的氨基末端第 219-956位的A型FMDV的P12A蛋白进行耐酸性改造得到的突变蛋白，该耐酸性改 造是将P12A中VP3的自氨基末端第142位和第145位的组氨酸残基突变为天门冬 酰胺、半胱氨酸、谷氨酸、谷氨酰胺、脯氨酸、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、色氨酸、 亮氨酸、异亮氨酸、缬氨酸、丙氨酸、天冬氨酸、甘氨酸、蛋氨酸或苯丙氨酸；4)由氨基酸序列是自GenBank Accession Number AM409325的氨基末端第 217-948位的C型FMDV的P12A蛋白进行耐酸性改造得到的突变蛋白，该耐酸性改 造是将P12A中VP3的自氨基末端第140位和第143位的组氨酸残基突变为天门冬 酰胺、半胱氨酸、谷氨酸、谷氨酰胺、脯氨酸、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、色氨酸、 亮氨酸、异亮氨酸、缬氨酸、丙氨酸、天冬氨酸、甘氨酸、蛋氨酸或苯丙氨酸；5) 由氨基酸序列是自GenBank Accession Number NC011451的氨基末端第 215-960位的SAT1型FMDV的P12A蛋白进行耐酸性改造得到的突变蛋白，该耐酸性 改造是将P12A中VP3的自氨基末端第142位和第145位的组氨酸残基突变为天门 冬酰胺、半胱氨酸、谷氨酸、谷氨酰胺、脯氨酸、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、色氨 酸、亮氨酸、异亮氨酸、缬氨酸、丙氨酸、天冬氨酸、甘氨酸、蛋氨酸或苯丙氨酸；6) 由氨基酸序列是自GenBank Accession Number NC003992的氨基末端第 215-956位的SAT2型FMDV的P12A蛋白进行耐酸性改造得到的突变蛋白，该耐酸性 改造是将P12A中VP3的自氨基末端第142位和第145位的组氨酸残基突变为天门 冬酰胺、半胱氨酸、谷氨酸、谷氨酰胺、脯氨酸、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、色氨 酸、亮氨酸、异亮氨酸、缬氨酸、丙氨酸、天冬氨酸、甘氨酸、蛋氨酸或苯丙氨酸；7) 由氨基酸序列是自GenBank Accession Number AY593852的氨基末端第 215-956位的SAT3型FMDV的P12A蛋白进行耐酸性改造得到的突变蛋白，该耐酸性 改造是将P12A中VP3的自氨基末端第142位和第145位的组氨酸残基突变为天门 冬酰胺、半胱氨酸、谷氨酸、谷氨酰胺、脯氨酸、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、色氨 酸、亮氨酸、异亮氨酸、缬氨酸、丙氨酸、天冬氨酸、甘氨酸、蛋氨酸或苯丙氨酸。
3、 权利要求1或2所述蛋白的编码基因。
4、 含有权利要求3所述基因的重组载体和转基因细胞系。
5、 一种在昆虫细胞中表达口蹄疫病毒空衣壳的方法，包括以下步骤1) 将权利要求3所述的基因和口蹄疫病毒的非结构蛋白基因JC通过杆状病毒 载体导入细菌内进行重组，得到重组杆状病毒A;2) 用所述重组杆状病毒A的DNA转染昆虫细胞，获得口蹄疫病毒空衣壳。
6、 根据权利要求5所述的方法，其特征在于所述方法中还包括将用所述重 组杆状病毒A的DNA转染昆虫细胞得到的重组杆状病毒再感染昆虫细胞，获得口蹄 疫病毒空衣壳的步骤。所述昆虫细胞为Sf9细胞系、sf21细胞系或High Five细胞系； 所述权利要求5中的细胞系优选为Sf9细胞系； 所述权利要求6中的细胞系优选为High Five细胞系。
7、 根据权利要求5或6所述的方法，其特征在于所述权利要求3所述的基 因和口蹄疫病毒的非结构蛋白基因^C可通过同一个含有双启动子的杆状病毒载体 导入细菌内，权利要求3所述的基因插入所述双启动子杆状病毒载体的一个启动子下游，所述口蹄疫病毒的非结构蛋白基因JC插入所述双启动子杆状病毒载体的另 一个启动子下游；所述细菌优选为大肠杆菌。
8、 根据权利要求7所述的方法，其特征在于所述双启动子杆状病毒载体为 能在细菌内发生转座重组的载体；所述双启动子杆状病毒载体优选为 pFastBacTMDual。
9、 利用权利要求8所述方法制备的口蹄疫病毒空衣壳。
10、 权利要求9所述的口蹄疫病毒空衣壳在制备口蹄疫病毒疫苗或制备口蹄疫 病毒诊断试剂中的应用。
全文摘要
本发明公开了一种通过耐酸性改造在昆虫细胞中组装口蹄疫病毒空衣壳的方法。本发明的在昆虫细胞中组装口蹄疫病毒空衣壳的方法，包括以下步骤1)将改造后的P12A基因和口蹄疫病毒的非结构蛋白基因3C通过杆状病毒载体导入细菌内进行重组，得到重组杆状病毒A；用重组杆状病毒A的DNA转染昆虫细胞，获得口蹄疫病毒空衣壳。本发明首次在昆虫细胞中组装成了完整的FMDV空衣壳，为基因工程亚单位疫苗和新型诊断试剂的研发奠定了基础。
文档编号C12N15/63GK101270155SQ20081010595
公开日2008年9月24日 申请日期2008年5月6日 优先权日2008年5月6日
发明者刘在新, 卢曾军, 普 孙, 曹轶梅, 李平花, 谢庆阁, 郭建宏 申请人:中国农业科学院兰州兽医研究所