专利名称：一种制备开环式洛伐他汀的方法
技术领域：
本发明涉及一种制备洛伐他汀的方法，特别涉及一种用红曲霉菌制备开环洛伐他汀的方法。
背景技术：
洛伐他汀(LOVASTATIN )，化学名称为(S)-2_甲基丁酸-(1S， 3S， 7S， 8S， 8aR)-l， 2， 3, 7， 8， 8a-六氢-3， 7-二甲基_8-{2-[ (2R， 4R)-4-羟基-6氧代-2-四氢吡喃基]-乙基}-1-萘酯；分子式为C24H3605，分子量404. 55。
洛伐他汀是红曲霉菌和土曲霉菌酵解产物，是一种3 -羟-3 -甲基戊二酯辅酶A (HMGCoA)还原酶抑制剂，有非常明显的降血脂作用，近年来被广泛地用于临床和保健品中。洛伐他汀有开环和闭环两种结构形式，因闭环型结构比较稳定从而将它作为化学药产品的结构形式用于临床。1987年，默克公司的降血脂药物洛伐他订(lovastatin， Mevacor)获FDA批准上市后，立即引起了医学界的关注，该药的成功开创了降血脂药物的崭新阶段。该药通过抑制该酶的活性，以减少肝胆固醇的合成，，刺激低密度脂蛋白(LDL)受体产生，并加强血浆中低密度脂蛋白的清除，极低密度脂蛋白水平也降低，是全球第一个批准上市的HMG—CoA还原酶抑制剂。洛伐他汀闭环型结构本身无生物活性，在体内被水解成开环形结构，洛伐他汀开环形结构上5'位羧酸结构部分与3 -羟-3 -甲基戊二酯辅酶A (HMGCoA)还原酶结构类似，因而对它具有竞争性的抑制作用，从而降低胆固醇的合成，起到降血脂的作用；所以
洛伐他汀闭环形结构比洛伐他汀开环型结构生物活性小。洛伐他汀开环形结构分子量为422. 57，洛伐他汀闭环形结构分子量为404. 55。结构如下所示本发明是利用红曲霉产酶水解闭环洛伐他汀为开环洛伐他汀的生物转化方法。闭环洛伐他汀转化为开环洛伐他汀的方法一般采用化学法，闭环洛伐他汀在碱性条件下一定时间内会转化为开环洛伐他汀；目前尚没有利用微生物生物转化闭环洛伐他汀为开环洛伐他汀的报道。
发明内容
本发明目的在于公开一种用红曲霉菌制备开环洛伐他汀的方法。本发明目的是通过如下技术方案实现的
本发明利用红曲霉产酶水解闭环洛伐他汀为开环洛伐他汀的生物转化方法，其制备方法为-
A、 选红曲菌株CGMCC N0.0272进行培养，接入发酵培养基进行发酵；斜面菌种培养将浓度为4度的麦芽汁，白糖，琼脂加入水中制成Ph是
6-8的培养基，使得每体积份培养基含白糖0.01 0.3重量份，含琼脂0.02-0.1重量份；在100-12(TC条件下灭菌，灭菌后冷却，制成斜面、接种，在20。C一40。C条件下培养3—7天，作为斜面菌种；
种子培养和发酵将葡萄糖，牛肉膏，蛋白胨，硝酸铵，硫酸镁加入水中制成pH为6-8的培养基，使得每体积份培养基含葡萄糖O. 01-0. l重量份，牛肉膏O. 01-0. l重量份，蛋白胨O. 01-0. 06重量份，硝酸铵O. 01-0. 05重量份，硫酸镁O. 01-0. 08重量份；在250体积份的三脚瓶中装入20-IOO体积份的培养基，在100-12(TC条件下，灭菌20-40分钟，灭菌后冷却，接入斜面菌种，使得斜面菌种体积占培养基的5-10%，在20-4(TC，摇瓶转速100-250r/min条件下进行摇瓶发酵，培养l-5天，作为发酵培养液；
B、 酶的制备盐析法制备粗酶液；
将上述发酵培养液中加入硫酸铵至饱和，搅拌均匀至完全溶解，在4'C
6条件下放置过夜，离心取沉淀，透析，离心取上清液作为粗酶液；
C、 底物的制备用水或5-30%乙醇溶液溶解闭环洛伐他汀，制得的溶液每体积份含闭环洛伐他汀O. 03-0. 2重量份，经微孔滤膜无菌过滤后作为底物，避光保藏待用；
D、 酶转化反应用如下方法之一
将粗酶液与底物以体积比为1:1.5—8混合，在转化温度为20-4(TC,转化反应时间为12-48小时条件下，得开环式洛伐他汀，其中开环式洛伐他汀重量占产物重量的10%-30%;
或用发酵培养液作为酶源，以水或5-30%乙醇溶液溶解闭环洛伐他汀，制成每体积份溶液含闭环洛伐他汀0.03-0.2重量份作为底物，将底物添加到发酵培养液中，至每体积份发酵培养液中含底物O. 00003-0. OOOl重量份，在转化温度为20-4(TC,转化时间为5-48小时条件下，得开环式洛伐他汀，其中开环洛伐他汀重量占产物重量的10-20%。
本发明利用红曲霉产酶水解闭环洛伐他汀为开环洛伐他汀的生物转化方法，其制备方法优选为
A、 选红曲菌株CGMCC N0.0272进行培养，接入发酵培养基进行发酵；斜面菌种培养将浓度为4度的麦芽汁，白糖，琼脂加入水中制成Ph是7
的培养基，使得每体积份溶液含白糖O. 15重量份，琼脂0.06重量份；在IIO'C条件下灭菌，灭菌后冷却，制成斜面、接种，在30'C条件下培养5天，作为斜面菌种；
种子培养和发酵将葡萄糖，牛肉膏，蛋白胨，硝酸铵，硫酸镁加入水中制成pH为7的培养基，使得每体积份培养基含葡萄糖O. 05重量份，牛肉膏0.05重量份，蛋白胨0.03重量份，硝酸铵0.03重量份，硫酸镁0.04重量份；在250体积份的三脚瓶中装入60体积份的培养基，在11(TC条件下，灭菌30分钟，灭菌后冷却，接入斜面菌种，使得斜面菌种体积占培养基的7%，在3(TC，摇瓶转速180r/min条件下进行摇瓶发酵，培养3天，作为发酵培养液；
B、 酶的制备盐析法制备粗酶液；
将上述发酵培养液中加入硫酸铵至饱和，搅拌均匀至完全溶解，在4t条件下放置过夜，离心取沉淀，透析，离心取上清液作为粗酶液；
7C、 底物的制备用水或18%乙醇溶液溶解闭环洛伐他汀，制得的溶液每 体积份含闭环洛伐他汀O. 12重量份，经微孔滤膜无菌过滤后作为底物，避光 保藏待用；
D、 酶转化反应用如下方法之一
将粗酶液与底物以体积比为1:5混合，在转化温度为3(TC，转化反应时 间为30小时条件下，得开环式洛伐他汀，其中开环式洛伐他汀重量占产物比 例的20%;
或用发酵培养液作为酶源，以水或18%乙醇溶液溶解闭环洛伐他汀制成 每体积份溶液含O. 12闭环洛伐他汀重量份作为底物，将底物添加到发酵培养 液中，至每体积份发酵培养液含底物0.00006重量份，在转化温度为30'C，转 化时间为26小时条件下，得开环式洛伐他汀，其中开环洛伐他汀重量占产物 重量的15%。
上述重量体积份的关系为克每毫升的关系，即g/ml。
应用微生物酶或微生物细胞进行的合成技术被称为微生物转化，它们在 迅猛发展的化合物的合成和转化方面扮演着越来越重要的角色，而且微生物 酶转化技术普遍具有环境友好，作用条件温和等优势；此外，生物催化剂具 有高度的选择性，包括化学选择性，区域选择性，对映体选择性和非对映体 选择性；微生物转化较化学手段转化有以下优点条件温和，设备简单，公 害少，反应速率较快，比较环保。
图l:薄层层析图谱
其中l、 lov碱化(开环)浓度2.5mg/ml; 2、同1; 3、 1+红曲酶反应产 物；4、 1ov(标品)+红曲酶反应产物；5、 lov碱化(开环)浓度5mg/ml; 6、 5+红曲酶 反应产物；7、红曲酶；8、同5; 9、同3
图2:产物液质连用检测结构
图3:洛伐乙酯结构图
下面实验例和实施例用于进一步说明但不限于本发明。 实验例l高压液相色谱分析和薄层层析测定实验。
将浓度分别为2.5mg/ml和5mg/ml的闭环洛伐他汀加入0. l摩尔/升NaOH至ra为ii，使部分闭环洛伐他汀转化为开环洛伐他汀(见附图i图谱样品i，
2和5)，将红曲粗酶液与开环洛伐他汀(附图l样品l)以1:1.5—8的比例混 合，转化温度20-40'C，转化反应时间12-48小时薄层层析检测转化产物(附 图1图谱样品3);将红曲粗酶液与闭环洛伐他汀以1:1.5—8的比例混合，转 化温度20-4(TC，转化反应时间12-48小时，薄层层析检测转化产物(图l图 谱样品4);将红曲粗酶液与开环洛伐他汀(图1图谱样品5)以1:1.5—8的比 例混合，转化温度20-40'C，转化反应时间12-48小时薄层层析检测转化产物 (图1图谱样品6)对照为红曲霉(图1图谱样品7)。 由图1可知，红曲酶对洛伐他汀有转化作用。 实验例2开环洛伐他汀的结构检测实验
洛伐他汀的HPL检测条件以乙腈一O. 1%磷酸=65: 35为流动相，以 4. 6咖X150咖，5um， Symmetry Shield的C8柱，流速l. 5mL/min，柱温30。C， 检测波长238nm;
洛伐他汀薄层层析TLC条件硅胶G254层析板，毛细管点样，薄层板放 到层析缸中层析，以氯仿甲醇=2: l为展开剂；碘蒸气显色，呈现黄色色 斑；
液质连用测其结构agilent离子阱Trap-Q，雾化器压力50psi，干燥 器10L/min,干燥温度350。C， compound stability 10-100%, trap-driver level: 100%,扫描范围200-800，如图2。
由上推出产物结构为洛伐乙酯结构，如图3;这是因为被酶水解开环
的洛伐他汀和反应液中的乙醇发生酯化反应，变成了洛伐乙酯。
以下实施例均能实现上述实验例的效果。
具体实施例方式
实施例l:
A、选红曲菌株CGMCC N0.0272进行培养，接入发酵培养基进行发酵； 斜面菌种培养将浓度为4度的麦芽汁，白糖，琼脂加入水中制成Ph是7 的培养基，使得每ml培养基中含白糖O. 15g，琼脂0.06g;在11(TC条件下灭 菌，灭菌后冷却，制成斜面、接种，在3(TC条件下培养5天，作为斜面菌种； 种子培养和发酵将葡萄糖，牛肉膏，蛋白胨，硝酸铵，硫酸镁加入水中制成pH为7的培养基，使得每毫升培养基含葡萄糖O. 05g，牛肉膏0.05g， 蛋白胨0.03g，硝酸铵0.03g，硫酸镁0.04g; 250ml的三脚瓶中装入60ml的培 养基，在11(TC条件下，灭菌30分钟，灭菌后冷却，接入斜面菌种，使得斜 面菌种体积占培养基的7%，在3(TC，摇瓶转速180r/min条件下进行摇瓶发酵， 培养3天，作为发酵培养液；
B、 酶的制备盐析法制备粗酶液；
将上述发酵培养液中加入硫酸铵至饱和，搅拌均匀至完全溶解，在4'C 条件下放置过夜，离心取沉淀，透析，离心取上清液作为粗酶液；
C、 底物的制备用水溶解闭环洛伐他汀，制得的溶液每毫升含O. 12g闭 环洛伐他汀的溶液，经微孔滤膜无菌过滤后作为底物，避光保藏待用；
D、 酶转化反应
将粗酶液与底物以体积比为1:5混合，在转化温度为3(TC,转化反应时 间为30小时条件下，得开环式洛伐他汀，其中开环式洛伐他汀重量占产物重 量的20%。 实施例2:
A、 选红曲菌株CGMCC N0.0272进行培养，接入发酵培养基进行发酵； 斜面菌种培养将浓度为4度的麦芽汁，白糖，琼脂加入水中制成Ph是7
的培养基，使得每ml培养基中含白糖O. 15g，琼脂0.06g;在11(TC条件下灭 菌，灭菌后冷却，制成斜面、接种，在3(TC条件下培养5天，作为斜面菌种； 种子培养和发酵将葡萄糖，牛肉膏，蛋白胨，硝酸铵，硫酸镁加入水 中制成pH为7的培养基，使得每毫升培养基中含葡萄糖O. 05g，牛肉膏0.05g， 蛋白胨0.03g，硝酸铵0.03g，硫酸镁0.04g;在250ml的三脚瓶中装入60ml的 培养基，在11(TC条件下，灭菌30分钟，灭菌后冷却，接入斜面菌种，使得 斜面菌种体积占培养基的7%，在3(TC,摇瓶转速180r/min条件下进行摇瓶发 酵，培养3天，作为发酵培养液；
B、 酶的制备盐析法制备粗酶液；
将上述发酵培养液中加入硫酸铵至饱和，搅拌均匀至完全溶解，在4'C 条件下放置过夜，离心取沉淀，透析，离心取上清液作为粗酶液；
C、 底物的制备用18%乙醇溶液溶解闭环洛伐他汀，制得的溶液每毫升含O. 12g闭环洛伐他汀的溶液，经微孔滤膜无菌过滤后作为底物，避光保藏
待用；
D、酶转化反应
用发酵培养液作为酶源，以18%乙醇溶液溶解闭环洛伐他汀制成每毫升 含O. 12g闭环洛伐他汀的溶液作为底物，将底物添加到发酵培养液中，至每毫 升发酵培养液中含底物O. 00006g，在转化温度为3(TC，转化时间为26小时条 件下，得开环式洛伐他汀，其中开环洛伐他汀重量占产物重量的15%。 实施例3:
A、 选红曲菌株CGMCC N0.0272进行培养，接入发酵培养基进行发酵； 斜面菌种培养将浓度为4度的麦芽汁，白糖，琼脂加入水中制成Ph是8
的培养基，使得每毫升培养基中含白糖0.1g，琼脂0.08g;在100'C条件下灭 菌，灭菌后冷却，制成斜面、接种，在20'C条件下培养6天，作为斜面菌种； 种子培养和发酵将葡萄糖，牛肉膏，蛋白胨，硝酸铵，硫酸镁加入水
中制成pH为6的培养基，使得每毫升培养基中含葡萄糖O. 08g，牛肉膏0.03g， 蛋白胨0.02g，硝酸铵0.04g，硫酸镁0.06g;在250ml的三脚瓶中装入40ml的 培养基，在11(TC条件下，灭菌20分钟，灭菌后冷却，接入斜面菌种，使得 斜面菌种体积占培养基的9%，在2(TC，摇瓶转速220r/min条件下进行摇瓶发 酵，培养2天，作为发酵培养液；
B、 酶的制备盐析法制备粗酶液；
将上述发酵培养液中加入硫酸铵至饱和，搅拌均匀至完全溶解，在4'C 条件下放置过夜，离心取沉淀，透析，离心取上清液作为粗酶液；
C、 底物的制备用10%乙醇溶液溶解闭环洛伐他汀，制得的溶液每毫升 含闭环洛伐他汀O. 18g，经微孔滤膜无菌过滤后作为底物，避光保藏待用；
D、 酶转化反应用
将粗酶液与底物以体积比为1:6混合，在转化温度为35X:，转化反应时 间为15小时条件下，得开环式洛伐他汀，其中开环式洛伐他汀重量占产物重 量的28%。 实施例4:
A、选红曲菌株CGMCC N0.0272进行培养，接入发酵培 基进行发酵；斜面菌种培养将浓度为4度的麦芽汁，白糖，琼脂加入水中制成Ph是6 的培养基，使得每毫升培养基中含白糖0.2g，琼脂0.04g;在120'C条件下灭 菌，灭菌后冷却，制成斜面、接种，在2(TC条件下培养4天，作为斜面菌种;
种子培养和发酵将葡萄糖，牛肉膏，蛋白胨，硝酸铵，硫酸镁加入水 中制成pH为8的培养基，使得每毫升培养基中含葡萄糖O. 03g，牛肉膏0.08g， 蛋白胨0.04g，硝酸铵0.02g，硫酸镁0.02g;在250ml的三脚瓶中装入80ml的 培养基，在10(TC条件下，灭菌40分钟，灭菌后冷却，接入斜面菌种，使得 斜面菌种体积占培养基的6%,在40'C，摇瓶转速120r/min条件下进行摇瓶发 酵，培养4天，作为发酵培养液；
B、 酶的制备盐析法制备粗酶液；
将上述发酵培养液中加入硫酸铵至饱和，搅拌均匀至完全溶解，在4°〇 条件下放置过夜，离心取沉淀，透析，离心取上清液作为粗酶液；
C、 底物的制备用水溶解闭环洛伐他汀，制成每毫升溶液含闭环洛伐 他汀0.06g，经微孔滤膜无菌过滤后作为底物，避光保藏待用；
D、 酶转化反应用
用发酵培养液作为酶源，用水溶解闭环洛伐他汀制成每毫升溶液含闭环 洛伐他汀0.06g作为底物，将底物添加到发酵液中，至每毫升发酵培养液含 底物0.00008g,在转化温度为22'C，转化时间为40小时条件下，得开环式洛 伐他汀，其中开环洛伐他汀重量占产物重量的13%。
1权利要求
1、一种红曲霉菌株，其特征在于该菌株保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心，保藏号为CGMCC NO.0272。
2、 如权利要求1所述的红曲霉菌株在制备开环式洛伐他汀中的应用。
3、 一种制备开环式洛伐他汀的方法，其特征在于该方法为A、 选红曲菌株CGMCC N0.0272进行培养，接入发酵培养基进行发酵； 斜面菌种培养将浓度为4度的麦芽汁，白糖，琼脂加入水中制成Ph是6-8的培养基，使得每体积份培养基含白糖0.01 0.3重量份，含琼脂 0.02-0. l重量份；在IOO-12(TC条件下灭菌，灭菌后冷却，制成斜面、接种， 在2(TC--4(TC条件下培养3—7天，作为斜面菌种；种子培养和发酵将葡萄糖，牛肉膏，蛋白胨，硝酸铵，硫酸镁加入水 中制成pH为6-8的培养基，使得每体积份培养基含葡萄糖O. 01-0. l重量份， 牛肉膏O. 01-0. l重量份，蛋白胨O. 01-0. 06重量份，硝酸铵O. 01-0. 05重量份， 硫酸镁O. 01-0. 08重量份；在250体积份的三脚瓶中装入20-100体积份的培养 基，在100-12(TC条件下，灭菌20-40分钟，灭菌后冷却，接入斜面菌种，使 得斜面菌种体积占培养基的5-10%，在20-40。C，摇瓶转速100-250r/min条件 下进行摇瓶发酵，培养l-5天，作为发酵培养液；B、 酶的制备盐析法制备粗酶液；将上述发酵培养液中加入硫酸铵至饱和，搅拌均匀至完全溶解，在4'C 条件下放置过夜，离心取沉淀，透析，离心取上清液作为粗酶液；C、 底物的制备用水或5-30%乙醇溶液溶解闭环洛伐他汀，制得的溶液 每体积份含闭环洛伐他汀O. 03-0. 2重量份，经微孔滤膜无菌过滤后作为底 物，避光保藏待用；D、 酶转化反应用如下方法之一将粗酶液与底物以体积比为1:1.5—8混合，在转化温度为20-40°C，转 化反应时间为12-48小时条件下，得开环式洛伐他汀，其中开环式洛伐他汀重量占产物重量的10%-30%;或用发酵培养液作为酶源，以水或5-30%乙醇溶液溶解闭环洛伐他 汀，制成每体积份溶液含闭环洛伐他汀O. 03-0. 2重量份作为底物，将底物添 加到发酵培养液中，至每体积份发酵培养液中含底物O. 00003-0. OOOl重量 份，在转化温度为20-40'C，转化时间为5-48小时条件下，得开环式洛伐他 汀，其中开环洛法他汀重量占产物重量的10-20%。
4、如权利要求3所述的制备开环式洛伐他汀的方法，其特征在于该方 法为A、 选红曲菌株CGMCC N0.0272进行培养，接入发酵培养基进行发酵； 斜面菌种培养将浓度为4度的麦芽汁，白糖，琼脂加入水中制成Ph是7的培养基，使得每体积份溶液含白糖0.15重量份，琼脂0.06重量份；在IIO 'C条件下灭菌，灭菌后冷却，制成斜面、接种，在3(TC条件下培养5天，作 为斜面菌种；种子培养和发酵将葡萄糖，牛肉膏，蛋白胨，硝酸铵，硫酸镁加入水 中制成pH为7的培养基，使得每体积份培养基含葡萄糖O. 05重量份，牛肉膏 0.05重量份，蛋白胨0.03重量份，硝酸铵0.03重量份，硫酸镁0.04重量份； 在250体积份的三脚瓶中装入60体积份的培养基，在11(TC条件下，灭菌30分 钟，灭菌后冷却，接入斜面菌种，使得斜面菌种体积占培养基的7%，在30'C， 摇瓶转速180r/min条件下进行摇瓶发酵，培养3天，作为发酵培养液；B、 酶的制备盐析法制备粗酶液；将上述发酵培养液中加入硫酸铵至饱和，搅拌均匀至完全溶解，在4'C 条件下放置过夜，离心取沉淀，透析，离心取上清液作为粗酶液；C、 底物的制备用水或18%乙醇溶液溶解闭环洛伐他汀，制得的溶液每 体积份含闭环洛伐他汀O. 12重量份，经微孔滤膜无菌过滤后作为底物，避光 保藏待用；D、 酶转化反应用如下方法之一将粗酶液与底物以体积比为1:5混合，在转化温度为3(TC，转化反应时 间为30小时条件下，得开环式洛伐他汀，其中开环式洛伐他汀重量占产物比例的20%;或用发酵培养液作为酶源，以水或18%乙醇溶液溶解闭环洛伐他汀制成 每体积份溶液含O. 12闭环洛伐他汀重量份作为底物，将底物添加到发酵培养 液中，至每体积份发酵培养液含底物O. 00006重量份，在转化温度为30。C，转 化时间为26小时条件下，得开环式洛伐他汀，其中开环洛法他汀重量占产物 重量的15%。
全文摘要
本发明公开了一种用红曲霉菌制备开环洛伐他汀的方法，是利用红曲霉产酶水解闭环洛伐他汀为开环洛伐他汀的生物转化方法，该方法为选红曲菌株CGMCC NO.0272进行培养、接入发酵培养基进行发酵、用盐析法制备粗酶液、底物制备和酶转化反应等步骤，本发明采用微生物转化较化学手段转化有以下优点条件温和，设备简单，公害少，反应速率较快，比较环保。
文档编号C12N1/14GK101659923SQ200810118908
公开日2010年3月3日 申请日期2008年8月26日 优先权日2008年8月26日
发明者何大林, 巩金妹, 段震文, 郭树仁 申请人:北京北大维信生物科技有限公司