生产脂质的方法

专利名称：生产脂质的方法
生产脂质的方法本发明涉及根据权利要求1的前序部分(preamble)从有机原料生产脂质或脂质 混合物的方法。本发明同样涉及通过所述方法所生产的脂质或脂质混合物用作根据权利要 求17的生物燃料以及根据权利要求18的生物燃料的用途。本发明同样涉及根据权利要求 19净化城市下水道的方法。
背景技术：
公知的是，从化石原料制造的交通燃料的用途是非常大规模的，并且消耗正在持 续增长。因此，关于化石能源资源的充足、环境效应和可持续发展方面已经相当正当地涌现 为重要的全球挑战。在该参考系中，交通燃料的可再生替代原料已经涌现为渐增兴趣的目 标。朝向基于可再生自然资源的燃料生产的一个步骤是尝试，至少部分地，用有机材 料代替化石原料。即使采用这种方法，我们仍然可以想象非常难以解决的问题。与化石原料 目前的消耗成比例，所要求的有机原料的量是非常大的，即使只有一部分化石原料被代替。 在几种连接中，已经观察到有机自然资源的单向的和大规模的消耗或者用于该目的的栽培 面积的再生可能导致自然生物多样性的后果以及粮食初级生产量平衡的后果，这些将是难 以解决的。有机材料以能量有效的方式转化成可用于生产交通燃料的形式同样提出了技术 挑战。对交通燃料而言，特别有利的原料来源将是有机脂肪，特别是作为其能含量的三 酰基甘油相当大地更高于相应的例如碳水化合物或醇类的三酰基甘油。此外，它是已知最 好的，并且它可经由相当有效的化学方法被转化为交通燃料的组分，诸如柴油、生化柴油或 可再生柴油。然而，天然脂肪原料储量的缺乏提出了限制因素。基于目前的脂肪资源，不多 于边际工业产量的生物燃料是可行的，至多。因此，增加脂肪储量要求油脂植物栽培相当可 观的增加。油脂植物栽培的生产量扇区的这种大的变化，反过来，对全球市场粮食经济的平 衡具有强烈的影响。这种需要，仍然处在推测水平，已经将自身显现为粮食和饲料原料价格 的大量上升。天然可再生的有机物质的总量是相当大的；以碳量计算，相当大地更大于作为交 通燃料的化石碳的每年用量。然而，这些可再生物质的较大部分，大约60%，是由化合物组 成的，还含有大量的氧，因此它们的燃烧值是相当低的。在先前已知的技术基础上，已知在理论上已经可以利用相对低能含量的碳水化 合物转变成含有更多可还原烃链的更高能量化合物，特别是作为已知的化学应用，诸如气 化技术(gasification technique)，一种能量极端密集的方法(R. Agrawal, N.R.Singh， F. H.Ribeiro 禾口 W. N. Delgass2007. “Sustainahle fuel for the transportation sector”，PNAS 104 :4828_4833，和WO 2006/117317)，其中进料和输出之间的总效率依然 是低的。相应的基础问题同样是与依照已知技术的生物技术方法相关的，利用这些生物技 术方法将包含于碳水化合物中的己糖转化成更高能量的化合物。这的实例是醇类的生产， 特别是乙醇，这在其他说明书US2002/0185447、US 5637502和WO 03/038067中进行了描述。专利说明书US 2004/0231661也描述了通过水和酸提取并通过水解来处理含木 质纤维素的材料，以便形成可被用于乙醇制备的木糖和葡萄糖。专利说明书US 5，221，357 描述了通过酸水解来处理含半纤维素和纤维素的材料，以及机械地并通过酸水解来处理固 相以生产可被用于乙醇制备的单糖，诸如戊糖和己糖。专利说明书US 4，752，579描述了通 过酸和/或碱以及酶水解来处理谷物种子的外壳以分离单糖。一些说明书描述了通过微生物发酵从不同有机材料进行的脂质生产。专利说明 书US 4，368，056建议在丁醇发酵中使用碳水化合物，它在工业废弃物中以低的含量存 在；并建议在生化柴油的生产中使用微生物甘油酯，它是在发酵中生成的。出版物Dai等 人(Dai, C. Tao, J. , Xie, F. , Dai, Y.禾口 Zhao, Μ. Biodiesel generation from oleagenous yeast Rhodotorula glutinis with xylose assimiating capacity. Afr. J. Biotechnol. Vol 6(18), pp. 2130-2134,19 September 2007)描述了存在于植物材料的稻草诸如玉米 茎、树叶和稻谷中的碳水化合物的提取，通过磨碎和酸处理，并利用从所述处理获得的滤 液和洗涤水作为通过红酵母属酵母生产脂质的原料。从微生物获得的脂质被用于生化 柴油的生产。Angerbauer 等人(Angerbauser, C. , Sierbenhofer, M. Mittelbach, M.禾口 Guebtz,G. M. Conversion of sludge into lipids by Lipomyces starkeyi for biodiesel production. Bioresource Technology 99 (2008) 3051-3056)，反过来,描述了通过碱和酸 对废水淤泥进行处理，以及它在通过油脂酵母属酵母进行的脂质生产中用作生化柴油的原 料。上述方法所遇到的问题包括这样的事实，即可被微生物利用的糖的产率依然是低 的，或者对大规模生产的需要而言具有较小重要性的方法适用于使用生物材料作为源材 料。明显的是，生物燃料制造的定量目标集不能通过在此所描述的方法和所用的源材料来 达到。因此，仍然非常需要新的技术方案，特别是这样的技术方案，即可用于较之前更广 泛地将地球的可再生有机碳水化合物储量转化成具有更高能含量的化合物的方案，不论它 的化学的或结构的组合物。它对解决如何可将存在于各种有机材料中的碳水化合物有效地 转化成具有更高能量的化合物(诸如脂肪)而言将是特别重要的，它将更加能适应于交通 燃料用途或适应于该用途的原料。发明概述本发明的目的是提供针对如何将有机生物材料转化为具有更高能量化合物的问 题的新方案。具体而言，本发明的目的是提供针对如何将从有机生物材料可获得的碳水化合物 组分转化为适用于生产生化柴油的脂质的问题的方案。更准确而言，根据本发明的方法其特征在于，在权利要求1的特征部分陈述了什 么。反过来，根据本发明的用途其特征在于，在权利要求17中陈述了什么，以及权利 要求18中所陈述的生物燃料。根据本发明的净化城市下水道的方法其特征在于，权利要求19中所陈述的。本发明是基于这样的观察的，即当以不同的方法处理生物物质以便回收纤维素和半纤维素级分时，纤维素和半纤维素级分被更进一步地降解，则微生物种群在所述级分中 更快地出现。令人惊讶地，发现在上述碳水化合物级分中，含ATP柠檬酸裂解酶的微生物也 在生长(EC 2. 3. 3.8，以前EC 4. 1. 3. 8)，借此微生物将脂质，特别是三酰基甘油，收集于细 胞中。基于这些观察，本发明开发了处理生物材料以便其中所含的纤维素和半纤维素与其 余生物材料分开，然后被水解以便水解产物适合于收集脂质的微生物生长，并适合于脂质 的生产，以及适合利用如此形成的脂质作为制造生化柴油的原料。根据本发明的说明书，可从源于多种来源的有机原料生产适合被合成脂质的微生 物利用的碳水化合物，和/或可从通过微生物生产的脂质来生产碳水化合物级分。根据本 发明，特别地，可从含半纤维素、纤维素、淀粉或非淀粉多糖的生物材料来生产所述碳水化 合物。适合被微生物利用的碳水化合物特别是单糖和寡糖，这包括己糖和戊糖两类。所述 碳水化合物也可以聚合的形式，如果已经选择了生产脂质的微生物以便它能够利用碳水化 合物聚合物。木材，以其多种形式，包括目前可被回收的最大储量的可再生生物物质。木材的用 途，特别是它的机械的或热机械的处理或来自木材的机械物质的制造或生产，是大规模的， 并且作为一种方法，生产许多含碳水化合物的较小流。对木材精制工业的这些切边而言，已 经发现了非常小的经济附加值；并且在许多情况中，它们招致花费，因为必须消除由它们造 成的环境荷载。作为技术挑战，像这些的侧流是特别有问题的。所述侧流在体积上是大的， 但它们的碳水化合物含量通常是低的。作为稀的基于水的碳水化合物溶液，它们不太适用 于旨在通过化学方式利用溶液中的碳水化合物的工艺中。相应地，本发明的目的也是提供针对如何利用含生物材料的大规模工业侧流的问 题的方案，它目前要求昂贵的净化操作或依然不能被目前的方法完全利用，但它仍然具有 作为能量来源的可能性。在根据本发明的方法中，将有机源材料进行处理，所述有机源材料含有纤维素、半 纤维素、淀粉、所有的这些，其一些混合物或其降解产物，或备选地，淀粉或非淀粉碳水化合 物原样或连接于纤维素或半纤维素材料。可将所述源材料进行机械地、热机械地、物理地、 化学地、生物学地预处理，或通过这些处理的组合进行预处理，或者它可能适合原样使用。 当含有聚合形式的碳水化合物时，优选采用水或酸或碱或其组合对其进行处理。在根据本 说明书的这些预处理之后，将混合物分成滤液和固体物质，即沉淀(

图1)，回收滤液或两种 级分。优选将采用水或酸或碱或它们的组合进行的源材料的处理再生，并将分离沉淀之后 的滤液相互合并。优选将在含碱处理中获得的滤液，原样或上述重复利用之后，运送至混合 物，在其中进行源材料的酸处理以增加可溶单糖的量。将在这些处理中产生的滤液或沉淀 中的任何一种或者源材料原样，或者源材料和滤液或沉淀或多种滤液或多种沉淀的组合， 在可能的预处理诸如中和、脱色和过滤之后，用于生产单细胞脂质。也可将这些滤液合并、 稀释或浓缩以达到适宜的单糖含量和组合物用于生产单细胞脂质的微生物。从源材料的每一种备选处理，产生了不同组合物的沉淀，取决于处理是否是采用 水或者在酸或碱的存在下进行的。为了增加糖产率，优选将沉淀运送至机械磨碎，原样或者 在水、酸或碱的存在下，从这种处理中再次获得了滤液和沉淀。将滤液或沉淀或其一些组合 物用于生产单细胞脂质，或需要时优选将沉淀用强酸处理。作为酸处理的结果，再次产生了 滤液和沉淀，从中可将滤液或沉淀或这些的组合运送至单细胞脂质的生产。通过将磨碎与处理结合，可将沉淀在甚至更高的酸浓度中处理。可将作为这种处理的结果而产生的滤液 或沉淀或其组合物用于单细胞脂质的生产。也可将沉淀除去并燃烧或用于生物燃料的生产 或其经由其他方法的前体。可将每一种滤液级分或沉淀或源材料原样或作为多种组合物使 用用于单细胞脂质的生产。可将从上述工艺步骤中获得的沉淀通过本说明书中提供的在前 的或在后的工艺步骤进行再次处理。为了增加糖产率，因此优选采用较之前的处理更强的 酸或碱来处理沉淀。此外，在不同的工艺步骤之间可进行酶处理或微生物发酵。本发明同样涉及一种方法，其中所用的碱和酸在工艺中被再次循环。本发明同样涉及一种方法，其中用于本方法的单细胞生物质被作为本发明所预期 的生物材料而再循环，当已经回收了所生产的脂质时。可从根据本方法进行的处理所获得的沉淀中回收经济上可开发的组分。反过来， 也可将滤液用于其它除脂质生产外的微生物工艺。根据本说明书的方法提供了针对问题的方案，所述问题为如何将包含于生物质碳 水化合物中的己糖和戊糖单糖逐渐地分成含较大量单体糖单元的较小级分，合成脂质的微 生物可更有效地利用这些级分以生产脂质。在与任何工艺步骤结合时，从中将不溶性物质 即沉淀与可溶性物质分离，从中因此产生了滤液，可将包含于滤液中的己糖和戊糖原样或 在必要的预处理之后作为用于单细胞脂质生产的滤液混合物而用于单细胞脂质的生产。除 滤液外，也可将沉淀或滤液与沉淀的组合物用于单细胞脂质的生产。本发明的综合优点是，它可被用于应用简单的工艺和单元操作，这些已经在工业 中使用了，以能量有效的和环境的方式用于生产富含能量的化学化合物，脂质，从含较少能 量的生物来源的化合物，诸如己糖和戊糖单糖或由这些形成的低聚物，以及这些的混合物。在根据本发明的方法中，特别优选的是，通过机械的或热机械的磨碎，新的表面通 常暴露于有机材料中，这可再次采用水、或者不同强度的酸或碱进行处理，并因此可提供溶 液和沉淀分布，从中，特别是采用溶液，可获得更多可用于微生物脂质生产的糖。当合并溶液和沉淀的复数种离析物时，与单相水解法相比，对机械的或热机械的 磨碎而言，获得了相当大提高了的己糖和戊糖的产率。在根据本发明的方法中，通过合并从酸和碱处理中获得的滤液，或通过合并滤液 和沉淀，从多种处理中获得的流相互中和。因此，滤液或沉淀或其组合物是原样可用的，在 不调节酸度的情况下，或至少调节酸度的需求较小。将复数种不同的生物质和来自不同来 源的生物质相互合并的可能性也是有利的。本方法的可开发性变得特别着重，以便其中所形成的可用于脂质生产的糖可自然 地用于微生物学，原样或部分地，以便还产生其他化合物，诸如醇类。本发明的特殊优点是，除了中和木材的机械和热机械处理的侧流或主流外，它同 样适用于中和释放用于生产脂质的碳水化合物的其他生物材料。本发明进一步涉及根据本方法从通过纤维的再次循环利用产生的混合物形成脂 质或脂质混合物的方法，所述纤维是在热机械处理、在采用碱或酸的处理中产生的。难以大规模中和的其他有机原料，根据本说明书，可被处理成为己糖和戊糖或成 为由这些形成的低聚物，并通过微生物从这些形成脂质，这些有机原料是例如从报纸、从甜 菜获得的甜菜浆以及谷物诸如燕麦的壳和稻草的循环利用获得的再循环纤维；以及田野栽培植物、锯屑、精制的磨木浆、稻草和泥炭(特别是轻微分解的泥炭)的其他相似的贬值部 分。到目前为止几乎不被利用的其他有机材料是沼泽的或水下的(submerged)生物质，来 自纤维素工厂的集水区域的生物质，以及成为来自城市下水道的活性污泥植物的生物质， 或成为倾卸区域或焚化的其他有机城市废物。也可通过交替使用本方法的多种实施方式处 理这些有机材料，以便使得包含于这些材料中的碳水化合物可用于微生物以生产单细胞生 物质和脂质。例如，可通过目前的方法处理城市废物水，借此，在其他优点之中将存在这样 的优点，即有害微生物在处理中死去。本发明的基本点是，将含碳水化合物的生物材料，不管它来源于什么有机材料，进 行处理以便从碳水化合物中获得适合于单细胞脂质生产的单体己糖和/或戊糖或它们的 低聚物。优选通过两种或更多处理的组合进行处理。使用根据本发明的方法，适合于生物燃料的大规模生产需要的尺度，可从复数种 不同的生物质同时生产源材料，这些源材料可用于生产脂质的微生物的细胞群的生产以及 脂质的生产。可生产适合于微生物脂质生产的组分，而不论生物质的组成、可用性和结构。 本发明的重要优点也是，通过根据本发明的方法，可高产率地生产可用的糖类，并且可降低 调节酸度所需要的化学品消耗。与现有技术的存在状态相比，在此描述的发明提供突破技术，它结合了含有纤维 素和半纤维素二者的生物材料成为己糖和戊糖的转化。通过相同的实施方式，本发明也使 得可以利用包含于这些生物材料的淀粉和非淀粉多糖的单糖单元成为单细胞脂质的生产 可用的糖类。本发明是特别可实施的，以便它能应用于材料的工业规模，所述材料来源于由 工业或社区产生的可再生的自然资源或它们的贬值的侧流。可使用根据本发明的方法以受 控的方式处理含纤维素和半纤维素的材料，以便从中形成单细胞脂质的前体，所述前体可 被安全的微生物在单细胞脂质的生产中利用。在下面，通过附图和详细的描述更加严密地描述了本发明。附图简述图1显示实现根据本发明的方法的主要步骤。图2显示己糖和戊糖原样或组合用于细胞物质和脂质的生产。图3显示培养基中酵母的生长和脂质的产生，已经向培养基中添加了混合物作为 碳源并用于脂质的生产，所述混合物是从谷壳通过碱处理并通过从中获得的滤液的10%酸 水解产生的。图4显示酵母在培养基中的生长，已经向培养基中添加了商购的戊糖作为碳源。方法详述“碳水化合物”是指包括醛、酸或酮基团以及，另外，复数个羟基的有机分子。因此， 碳水化合物的范围包括由术语单糖、寡糖、多糖、糖类、纤维素、半纤维素、淀粉和非淀粉碳 水化合物所描述的化合物。“纤维素”是长链多糖，其主要结构由通过葡萄糖的β -1-4形成的聚合物组成。“淀粉”是主要由α-1-4和α _1_6葡萄糖单元组成的长链多糖。“可用的糖”在此是指糖类，利用所述糖类微生物能够繁殖，并且从所述糖类中生 成脂质和生成醇类的微生物能够生成脂质或醇类。“半纤维素”是指由复数种不同的己糖和戊糖诸如半乳糖、甘露糖、葡萄糖、木糖和阿拉伯糖组成的一组化合物。“单糖”是碳水化合物的单体单元，(C-H2O)n,通常由3-9个碳原子组成，并且在一 个或更多碳原子上具有立体化学差异。这些包括己糖，诸如葡萄糖、半乳糖、甘露糖、果糖， 它们含有6个碳原子，以及戊糖，诸如木糖、核糖和阿拉伯糖，它们含5个碳原子。“寡糖”是指已经从两个或更多单糖通过0-糖苷键形成的碳水化合物。“戊糖”是指含五个碳原子的单糖。“己糖”是指含六个碳原子的单糖。“水解”是指碳-碳、碳-氧、碳-氮或碳_硫键在水、酸或碱影响下的断裂，而不论 水是否参与反应。在酶法水解中，相应的反应是由酶催化的。例如，水解是一种反应，其中 单糖和碳水化合物之间的0-糖苷键或蛋白质的氨基酸之间的肽键断裂。“采用水_酸或碱处理”在该连接中意味着将有机材料原样或来源于它的产物进 行萃取、机械地或热机械地处理，或这些处理的组合是在水、酸或碱存在下进行的。根据 Bransted-L0wry酸碱理论，酸是指能够提供氢离子(质子)的化学物质、分子或离子， 碱是指能够接受氢离子(质子)的物质、分子或离子。酸同样是指能够接受电子对的所谓 Lewis酸；Lewis碱是指能够提供碱基对的所谓Lewis碱。根据这些定义，物质作为酸或碱 的活性不局限于水溶液。根据这些定义，在本说明书中，术语“酸”和“碱”同样是指酸和碱 催化剂。在本说明书中，酸同样是指任何酸相，在其中它能充当酸，诸如以气体、固体或液体 形式；例如，作为水溶液。相应地，碱是指任何碱相，在其中它充当碱，诸如以气体、固体或液 体形式；例如，作为水溶液。本说明书中的“有机源材料”是指由活的生物产生的任何有机物质。本说明书中 的有机源材料也称为生物材料。特别是，有机源材料是指包括多糖的有机材料。“多糖”是指从单糖形成的碳水化 合物聚合物，它也能含有除单糖外的化合物。多糖是，例如，纤维素、半纤维素和淀粉。多糖 同样包括，在其他之中，藻酸盐、葡萄聚糖(glucane)、菊糖和阿拉伯胶。在其他多糖之外，甘 露聚糖(marmane)也应被提及。源材料可包括多糖原样或作为混合物，或者它可包括它们 的降解产物。“非淀粉多糖”是指碳水化合物，它们的分子结构缺乏淀粉典型的α -1-4键，或 α-1-4键是罕见的。非淀粉多糖是，例如，葡萄聚糖、藻酸盐、菊糖和阿拉伯胶。非淀粉多糖 也包括半纤维素和纤维素。其他非淀粉多糖是，例如，在藻类中存在的碳水化合物聚合物。“栽培植物”是指植物，将其在为其准备的土壤中种植或播种是为了有益的目的。术语“脂质”是指脂肪物质，它的分子通常含有，作为一部分，脂肪族烃链，它溶解 于有机溶剂但在水中溶解性差。在本发明中，在微生物中形成的脂质主要是三_、二-或单-乙酰甘油，或留醇酯， 但其他脂质，诸如磷脂、游离脂肪酸、留醇、多萜醇、鞘脂(sfingolipids)、糖脂和双磷脂酰 甘油也可在细胞中形成。本发明也可用于生化柴油或可再生柴油的生产。根据EU指示2003/30/ΕΥ，“生化柴油”是指从植物油或动物油生产的甲基酯，具有 可被用作生物燃料的柴油品质。可再生柴油是指动物、植物或微生物来源的氢化处理的脂质，借此，微生物脂质可来源于细菌、酵母、霉菌、海藻或另外的微生物。根据本发明的方法的源材料可为纤维素、半纤维素和生物质，优选为木浆，可能含 有粘合剂，它已经通过机械的或热机械的方法或其他物理方法，或化学的、酶的或微生物学 的方法或者通过这些方法的组合而产生了。在不修改本方法的情况下，含有淀粉的植物材 料，诸如土豆、它的部分、可栽培作物的种子、玉蜀黍和水稻rise，分别地，以及甜菜，此外， 包括含于其中的非淀粉多糖的甜菜浆，同样可为根据本发明的方法的源材料。含有非淀粉 多糖诸如葡聚糖的植物的部分也适宜用作源材料。该方法也适合使用碳水化合物作为 源材料，所述碳水化合物诸如藻酸盐，它来源于单细胞生物。上述源材料的组合物也可包括 变化量的蛋白质和脂质，它们同样充当源材料用于合成脂质的微生物的生长并用于脂质生 产。根据本发明的方法的源材料也可为，例如，从报纸循环利用获得的再循环纤维，甜 菜浆和谷物的壳，诸如燕麦，锯屑、精制的磨木浆、泥炭和稻草。其他在根据本发明的方法中 有用的源材料是，例如，微生物物质，诸如单细胞生物质，沼泽的或水下的生物质，包括藻类 和微藻类，来自纤维素工厂的集水区域的生物质，以及成为来自城市下水道的活性污泥植 物的生物质，或含有生物组分并且目前用于焚化、堆肥或用于一些其他方法的其他城市废 物，这导致包含于废物的碳作为二氧化碳而广泛释放。根据本发明的优选实施方式的方法包括至少一个步骤，其中将从根据本发明的有 机材料获得的滤液或滤液的组合物，沉淀或沉淀的组合物，有机材料原样或这些中任何的 组合物，运送至混合物，在其中发生脂质生产。基于在用于微生物生长并产生脂质的滤液 或滤液的组合物、或沉淀、沉淀的组合物、或者滤液或沉淀的组合物中优选的单糖组合物类 型，可选择该方法的替代实施方式。因此，滤液或沉淀选自通过处理生物材料而产生的群 组，其中所述生物材料优选被选自下列的物质处理i)水，ii)酸，和iii)碱，并且此后将含纤维的沉淀与不含纤维的滤液分离。任选地，将沉淀再次进行(i)、(ii)或(iii)条中任何条的处理一次或更多次，优 选将所得沉淀进行机械的或热机械的磨碎，并分离沉淀和滤液。取决于使用了什么生物材料以及想得到什么单糖，将生物材料用水、酸或碱处理； 优选酸或碱；通常，通过酸或碱的水溶液。需要时，可将处理进行几次。可采用复数种不同 的溶液将相同的生物材料进行连续地处理，并且可将增强碳水化合物的分离和水解产物的 化合物加入到水中。可将在下面的清单组I中所列的源材料在第一步骤中采用水处理，或如果需要增 强处理结果时，采用水和酸的混合物处理。组II中的生物材料在第一步骤中优选采用酸处理。组III中的生物材料在第一步骤中优选采用碱处理。当已经回收了沉淀和滤液 时，可将滤液采用酸再次处理。组I来源于木材的机械的、热机械的、酶的或微生物学处理或者来自这些处理组合、或来自栽培植物的生物材料。组II再循环纤维、甜菜浆、谷壳、稻草、麦麸、谷物颗粒、完整栽培植物、栽培植物、TMP 浆、MDF浆或含淀粉或非淀粉多糖的源材料。组III锯屑、精制的磨木浆、谷壳、稻草和木本植物部分、TMP浆、MDF浆、甜菜浆、栽培植 物，它们可能含有变化量的淀粉。可通过将例如一种或更多种酶加入到处理溶液中，优选加入到使用水制成的处理 溶液中，来增强处理。也可在多种工艺步骤之间加入酶处理或微生物发酵。在接着的步骤中，使产生脂质的微生物与滤液或沉淀或它们的组合物中的任何在 培养基中接触，使微生物细胞生产脂质并回收脂质。也优选将从上述生物材料处理步骤中获得的含纤维的沉淀使用这样的方法处理， 其中将含纤维的沉淀机械地磨碎，并分离含纤维的沉淀和不含纤维的滤液。此外，可采用强酸处理从机械磨碎获得的含纤维的沉淀，并可分离含纤维的沉淀 和不含纤维的滤液。酸处理后，也可将沉淀再次反向循环进行机械磨碎，或，如上所述，可将 沉淀用于利用微生物的脂质生产中。此外，可将生物材料酸化并机械地或热机械地磨碎，并分离含纤维的沉淀和不含 纤维的滤液。可将从任何上述处理获得的滤液或沉淀或它们的组合物加入到产生脂质的微生 物的培养基中。通常，滤液中糖类的总量为0.5-10%重量。在这些当中，可用于生物质和脂质生产 的糖类通常包括至少0. 5 %重量，优选至少3 %重量，更优选4-5 %重量。例如，通过将生物 材料磨碎和再提取，可从生物材料中分离出更多的糖类，这样，可将糖类的量增加至更加有 利的水平。然而，滤液中糖类的量优选低于30%重量，更优选低于20%重量。能够产生脂质的微生物生长以便它们首先产生生物质，然后产生脂质，或同时产 生生物质和脂质二者。取决于生物材料的来源和将其所进行的处理方法(采用水、酸或碱处理)，可获得 己糖单糖、戊糖单糖或以多种比率的二者，如图2所示。从一些生物材料中，主要可获得己 糖，然而从其他生物材料中，主要是戊糖。随着能够产生脂质的微生物的适宜选择，可将主 要含己糖的滤液或沉淀或它们的组合物用于细胞物质的生产，在此之后，可将主要含戊糖 的滤液或沉淀或它们的组合物用于深入细胞物质之中的脂质的生产。备选地，脂质可在细 胞物质中从己糖生产。细胞物质和脂质可从己糖生产。相应地，通过能够产生脂质的微生物 的适宜选择，可将主要含戊糖的滤液或沉淀或它们的组合物用于细胞物质的生产，在此之 后，可将主要含己糖的滤液或沉淀或它们的组合物用于深入细胞物质之中的脂质的生产。 备选地，脂质可深入细胞物质之中从戊糖生产，或细胞物质和脂质可从戊糖生产。细胞物质 和脂质二者也可从戊糖和己糖的混合物生产。生物材料的处理在下面，描述了根据本发明的优选实施方式的生物材料的处理。通常，处理是以两 种或更多处理的组合进行的。
优选将源材料在90-100°C的温度下提取。酸提取的有利实施方式是使用5-10% 的矿物酸，诸如硫酸，或有机酸，诸如柠檬酸或醋酸，以及在碱提取中，优选0. 5-2. OM的 NaOH0处理时间范围广泛；优选为1-10小时，通常为2-8小时，最合适地为2_4小时。也可 优选将其他处理，诸如采用酶、微生物、氧化或还原化学品的处理，或这些处理的组合，与水 提取组合。根据本方法，可优选将在提取中产生的沉淀在100-210°C通常为150-200°C的温 度下进行机械地磨碎，优选进行2-20分钟，通常为5-11分钟。压力优选为6-8bar。将所产 生的物质过滤，使用上述方法处理滤液以便其适合于单细胞脂质的生产。可将沉淀运送至 采用强酸的酸处理，优选所述处理是采用40-72%硫酸、合适地65-70%硫酸的处理。正常 地，处理时间是2-8小时，优选2-4小时。该方法可采用任何酸实现，借此提供质子催化的 水解。适宜的酸是，例如，强矿物酸，磷酸、硫酸，或硫、氮、氯、溴和碘的含氧酸。可将水解的结果分成滤液和沉淀，将滤液进行处理以便适合于单细胞脂质的生 产，可将沉淀运送至稀酸溶液，优选5-10 %的硫酸溶液，并且可在170-200°C的温度和 6-10bar的压力下进行10-20分钟的磨碎。将混合物分成滤液和沉淀，其中将前者进行处理 以便适合于单细胞脂质的生产，并且可除去沉淀。本方法的上述实施方式以完全利用源材料中存在的碳水化合物用于单细胞脂质 的生产为目标。然而，从提取源材料的方式开始，也可只对所选择的部分实现本方法，例如， 当沉淀的纤维材料也将被用于其它目的时。根据本发明的方法，其特征在于，优选在它们的 整体中包括上述步骤，但自进行本方法的部分起不受限制至偏离基本方法的程度，或者以 单元操作顺序，并且在单细胞脂质的生产中使用通过这些操作产生的单糖级分。根据本说 明书，也可将工艺步骤加入到本方法中，其中将从源材料获得的含单糖的级分用于单细胞 生物质或乙醇的生产中，除脂质外。在下面的说明书中，描述了根据本发明的优选实施方式的一些方法。可将相同的 方法应用于除本说明书中给出的原材料之外的原材料。I.根据本发明的优选实施方式，将包括磨碎的木材、TMP浆、锯屑或磨木浆的木纤维 根据下列组成步骤进行处理A.将IOOg木纤维在1升水中在90_100°C提取2_4小时，优选2小时。通过过滤 分离沉淀与溶液，并回收溶液。溶液中碳水化合物产率的范围为2%至5%，取决于木纤维 的制造方法，对高处理温度(超过170°C )的TMP纤维而言通常为4-5%。B.为了增加碳水化合物产率，将纤维级分在1升的5-10%酸(优选5% )、pH约 1 (例如，矿物酸)中，在90-100°C的温度下水解2-4小时，优选2小时。分离剩余的沉淀与 溶液；回收溶液。C.优选从沉淀中倾倒出过量的酸，将沉淀在热磨机(例如，翼状或盘状精磨机)中 再次磨碎。优选通过预汽蒸一分钟将沉淀的温度增加并将浓缩物保持在混合物中。将温度 升高至150-200°C，优选170°C，压力为6-8bar (翼状精磨机)。根据木材，在2至15分钟的 范围内选择磨碎时间。通过过滤分离沉淀与溶液，并回收溶液。D.将40-72% (硫酸)的强酸加入到沉淀级分中，使其在室温吸附2_4小时，优选2 小时。倾倒出过量的酸，并将沉淀在精磨机(例如，翼状或盘状精磨机)中再次磨碎。优选通过预汽蒸一分钟将沉淀的温度增加，此后不排出浓缩物中的水。将温度升高至150-200°C， 优选170°C，压力为6-8bar (翼状精磨机)。根据木材，在2至15分钟的范围内选择磨碎时 间。将混合物过滤，分离沉淀与溶液。回收溶液并将沉淀用作燃料。可将从组成步骤A-D中任何步骤获得的溶液级分进行进一步处理，通过脱色方 法、PH调节和其他促进微生物生长的措施，诸如除去水，并可将如此获得的溶液用于微生物 的培养基中，可使微生物生产脂质。通过将组成步骤A-D进行组合，可将40-65%的原始木 纤维材料从用作源材料的纤维转化成可溶性形式。溶解的碳水化合物包括葡萄糖、半乳糖、 甘露糖、木糖和阿拉伯糖单元，它们的共有部分对所用的木材类型而言是典型的。II.根据本发明的另一优选实施方式，使用了 IOOg的木纤维、磨碎的木材、再循环纤 维、TMP浆、锯屑或磨木浆，在1升的4-8%碱溶液，优选IM的NaOH中，在90-100°C的温度 下提取2-4小时，优选3小时。通过在室温过滤分离沉淀与溶液，并回收两种级分。取决于 源材料纤维的处理，溶液中碳水化合物的产率落于5-8%的范围之内。优选将该溶液通过下 列组成步骤中的任何步骤进行处理A.将浸提液以上述方式再次原样用于提取下列纤维批次，并回收溶液。B.根据之前实施方式的步骤B-D中的任何步骤，将浸提液采用酸进行水解以处理 已经溶解于其中的木质素以及寡糖和多糖。C.根据实施方式I中的步骤B利用根据步骤A再循环的浸提液。为了增加单糖产率，优选使用下列方法或其组合将在碱处理中回收的沉淀进行处 理D.根据之前的实施方式I的步骤B、C、D或根据它们的所有步骤，将沉淀进行处理。 将混合物过滤，中和溶液，并回收沉淀和溶液二者。E.将从实施方式II的步骤A剩余的沉淀采用碱进行再次处理，优选在这样的条 件下，即其中将混合物磨碎2-8分钟，优选6分钟，在4-lObar的压力下，优选8bar，温度为 170°C。进行过滤，将溶液中和并回收。通过这一额外的磨碎，可将溶解的材料量增加至源 材料中纤维原始量的27%。将在每一个组成步骤A-E中产生的含碳水化合物的溶液(包括葡萄糖、半乳糖、甘 露糖、木糖和阿拉伯糖单元)处理成适合于由微生物进行的脂质生产的形式，例如，通过脱 色、PH调节，或通过从溶液中除去水，并且它被用作微生物的培养基，或用作其部分，并使微 生物生产脂质。III.根据本发明的第三优选实施方式，使用了木纤维、磨碎的木材、TMP浆、锯屑、磨木 浆、再循环纤维(或根据上述步骤B制备的中和了的提取物)，采用5-10% (优选5%)强 度的酸进行水解，通过向每IOOg待水解材料中加入1升所述酸(例如，矿物酸)，在约为1 的PH下，使用90-100°C的温度进行2-4小时，优选2小时。通过过滤分离沉淀与溶液。从 源材料中纤维的量计算，溶液含有4-14%的碳水化合物。可将沉淀用作纤维，或可根据上 述第一实施方式中的步骤C或D或二者将其进一步处理以增加单糖产率。将溶液从沉淀分 离、中和、过滤，并原样使用或以浓缩的形式用作微生物的培养基或其部分，使微生物生产 脂质。
IV.根据本发明的第四优选实施方式，使用IOOg的木纤维、磨碎的木材、TMP浆、锯屑、 磨木浆或从实施方式I的步骤A-C或实施方式II的步骤A剩余的沉淀，加入5-10%的酸， PH约为1 (例如，矿物酸)，使其吸附2-4小时，优选2小时。倾倒出过量的酸，并将沉淀在精 磨机(例如，翼状或盘状精磨机)中再次磨碎。优选通过预汽蒸一分钟将沉淀的温度升高， 并使浓缩物不流出。将温度升高至150-200°C，优选170°C，压力为6-8bar (翼状精磨机)。 根据木材，在2至15分钟的范围内选择磨碎时间。通过过滤将沉淀从溶液中除去。可将残 留的沉淀用作燃料或以上述方式再次磨碎以增加溶液中的单糖产率。将溶液中和、过滤，并 原样或以浓缩的形式使用，并以实施方式I-III中所述的方式使用。V.根据本发明的第五优选实施方式，使用IOOg的木纤维、磨碎的纤维、TMP浆、锯屑、 磨木浆或根据实施方式I-IV中任何实施方式残留的沉淀，加入40-72%的强酸(例如，硫 酸)，使其在室温吸附2-4小时，优选2小时。倾倒出过量的酸，并将沉淀在精磨机(例如， 翼状或盘状精磨机)中再次磨碎。优选通过预汽蒸一分钟将沉淀的温度增加，并使浓缩物 不流出。将温度升高至150-200°C，优选170°C，压力为6-8bar (翼状精磨机)。根据木材， 在2至15分钟的范围内选择磨碎时间。将碳水化合物混合物过滤并分离沉淀与溶液。从 用作源材料的沉淀起，溶解的物质部分落于40-65%的范围内。可将残留的沉淀用作燃料， 或可将其再次磨碎以增加单糖产率。将溶液中和、过滤并根据实施方式I-IV中任何实施方 式进行处理。备选地，使40-72%的强硫酸在室温吸附到沉淀中1-3小时，优选1. 5小时。在此 之后，将酸稀释至5%，并在常压和100°C下煮沸4小时。进一步的处理如上。利用微生物的脂质生产本发明提供了，经由在多个组成步骤中产生的滤液的组合物，包含于源材料中的 碳水化合物以及己糖和戊糖单糖将要广泛地用于通过微生物工艺的脂质和单细胞生物质。 采用预处理，诸如洗涤、中和、脱色或其他处理后操作，可将每一种回收的滤液原样或与多 种含水级分组合使用用于单细胞脂质的生产。因为源材料的处理方式，这是本发明的一部 分，本发明也适用于乙醇生产。将滤液，即含水级分，或滤液的任何组合，加入到已经接种了或接种了微生物的 微生物培养基中，使微生物生产脂质。将脂质以微生物物质的形式回收，或将脂质与所述 物质分离，并回收从中分离出的脂质和微生物物质二者。可使用已知的方法通过从细胞 中除去脂质或通过碎裂细胞而回收脂质。可使用有机溶剂从碎裂的细胞中提取脂质。可 应用于本发明的脂质回收方法，例如，在Z.Jacob的出版物Yeast Lipids Extraction, Quality Analysis, and Acceptability, Critical Reviews in Biotechnology,12(5/6)； 463-491(1992)中进行了描述。用于回收脂质的优选方法是相分离。将在微生物中形成的 脂质处理成脂肪酸酯的处理也可在没有先前的微生物细胞勻浆化和随后的脂肪分离的情 况下发生。本发明的优选实施方式涉及从在有机源材料的处理中产生的碳水化合物混合物 形成脂质或脂质混合物的方法，所述碳水化合物混合物包括单体和低聚物形式的己糖和戊 糖，根据本方法，将含碳水化合物的混合物加入到培养了产生脂质的微生物的含水培养基中，所述培养基补充有生长所要求的营养素，采用所述微生物进行培养基的接种，培养微生 物并使之生产脂质，回收细胞物质，并从细胞或含脂肪的细胞中分离脂质或脂质混合物，或 它们的组分被原样使用。根据本发明的方法提供了针对微生物学脂质生产的特殊弹性。含有己糖和戊糖二 者的级分是用于许多产生脂质的微生物的天然碳源。因此，该方法同样具有允许在宽范围 内选择微生物的优点，例如基于脂质生产的能力、生物质的产率、培养的类型或培养条件。 可将微生物的其他组分，除脂质外，以许多不同的方式能量有效地利用，因此改善根据本发 明的工艺的全部经济性能。利用不含脂质的微生物物质的优选方式是水解并循环进入产生 脂质的微生物的培养基或用作饲料或营养物质。也可能将多种组分从不含脂质的微生物物 质中分离出来，所述组分诸如(特别的)糖类、着色剂、β-葡聚糖、留醇、留醇酯或蛋白质。微生物是从天然的或遗传上修饰的积累脂肪的微生物中选择的，优选从酵母、霉 菌、细菌和藻类中选择，更优选从酵母和霉菌中选择，最优选从酵母中选择。重要的是，将要 被利用的微生物能够从己糖或戊糖或从二者产生脂质。因此，本发明包括基于它们含有的 ATP 柠檬酸盐裂解酶活性(EC 2. 3. 3. 8)的脂质积累的所有微生物。适用于本发明的合成脂质的酵母属包括下列属念珠菌属、子囊菌酵母属、 油脂酵母属、红酵母属和隐球菌属，它们包括将戊糖木糖合成脂质的菌株，诸如弯假丝 酵 母(D) (Evans, C. Τ. and Ratledge,1983. Acomparison of the oleaginous yeast, Candida curvata, grown on different carbon sources in continuous and batch culture, Lipids 18 623—629)、瘦弱红酵母(Rhodotorula gracilis) (Yoon， S. ， Rhim， J.，Choi，S.，Ryu, D· and Rhee, J. 1982. Effect of Carbon and Nitrogen Sources on Lipid Production of Rhodotorula gracilis，J. Ferment. Technol. 60，243-246)以及 红冬孢酵母菌(Rhodosporidium toruloides)、胶红类酵母菌(Rhodotorula glutinis)、 牧草红酵母菌(Rhodotorula graminis)、斯氏油脂酵母、产油油脂酵母、溶脂念珠菌、隐 球菌属、白色隐球菌、皮肤毛孢子菌和芽毛孢子菌(Fall，R.，Phelps，P. md Spindler， D. 1984，Bioconversion of Xylan to Triglycerides by Oil-Rich Yeasts. Appl. Environ. Mircobiol. 47，1130-1134)，以及将戊糖阿拉伯糖合成脂质的菌株，斯氏油脂酵母 (Naganuma, T. , Uzuka, Y. and Tanaka K. 1985. Physiological Factors Affecting Total Cell Number and Lipid Content of the Yeast, Lipomyces starkeyi, J. Gen. Appl. Microbiol. 31，29-37)。相应地，适用于本发明的积累脂肪的霉菌属包括，在其他霉菌属之中-曲霉菌属-黑毛菌属-Clodosporidium-小克银霉属-裸孢壳属-镰刀菌属-被孢霉菌-毛霉菌属_青霉属
-腐霉菌属-根霉菌属_木霉属相应地，适用于本发明的积累脂肪的细菌属包括，在其他细菌属之中-不动秆菌属-Actinobacter-鱼腥藻属-节秆菌属-芽孢秆菌属-梭菌属-Flexibacterium-微球菌属-分枝秆菌属-诺卡尔菌属-念珠藻科_颤藻属-假单胞菌属-红球菌属-红微菌属_红假单胞菌属-斯瓦尼菌属-链霉菌属_弧菌属相应地，适用于本发明的积累脂肪的微藻属包括，在其他微藻属之中-葡萄藻属-成胞藻属(Brachiomonas)-衣滴虫属-小球藻属-隐、甲藻属(Crypthecodinium)-杜氏藻属(Dunaliella)-眼虫属-微球藻属(Nannochloris)-微藻属(Nannochloropsis)-舟形藻属(Navicula)-菱形藻属(Nitzschia)-裂殖壶菌属(Schizochytrium)-肋线藻属(Sceletonema)-栅藻属-融合微藻属(Tetraselmis)
-破囊壶菌属(Thraustochytrium)-吾肯氏壶菌属(Ulkenia)根据本发明的优选实施方式，这样的微生物被用于脂质合成，它们将含脂肪酸的 脂质以优选为细胞干重12-65%重量的量合成进入它们的细胞。根据本发明的特别优选实施方式，将在本发明中形成的、以适合于微生物的方式 处理的不含脂质的生物质用作培养基中的营养素。除这些组分外，培养基可补充有所用微 生物优选的组分。为了生产脂质，微生物通常要求，在其他之中，碳源，在本发明中它来自 于源材料，氮源，诸如无机铵盐(例如，硫酸铵)或有机氮源(例如，氨基氮、酵母提取物或 水解过的细胞物质)，以及微量营养素源，诸如磷酸盐、硫酸盐、氯化物、微生物或阳离子源 (例如，Mg、K、Na、Ca、Fe或Cu离子源)，借此，需要时可将这些组分加入到培养基中。应用 本发明的方法时，细胞的脂质浓度优选为40 %重量，最优选65 %重量。生物燃料的制造可将包含于微生物来源的脂质的脂肪酸酯通过任何已知方法进行处理以适合用 作生物柴油。一种优选的方法是采用短链醇进行酯交换，优选甲醇，以获得脂肪酸的醇酯。在生化柴油和可再生柴油的制造中，在酯交换时发生时产生的不纯侧流，其侧流 含有醇化合物，诸如甘油或非酯化脂肪酸盐，并且它难以以能量有效的方式开发，可将其再 利用用于单细胞脂质的生产，所述脂质是原样可用的或可再循环成生物来源的其他含甘油 脂的材料。发明的优点本发明的优点包括这样的事实，即本方法所需要的设备是简单的，并且只要是涉 及制造和操作的相关技术均是已知的。根据本发明的方法不局限于任何生产规模，但可被 容易地放大或缩小，根据碳水化合物的含量和待处理的源材料的量。进行该方法以生产脂 质不要求耗能的加热，加压单元操作或除酸、碱或酶催化剂外的其他化学催化剂。本方法只 要求使用能够掺入根据本发明的方法的内循环或所述生物材料的处理中的化学品。本方法 也不要求对可用的糖溶液进行增加费用的脱水，因为稀释的碳水化合物溶液适合于原样用 于或用作微生物培养基。本方法的全部经济性能是通过这样的事实改善的，即在其中产生 的不含脂质的生物质，除内循环外，具有许多不同的用途，诸如个体有机组分的生产，作为 饲料或作为饲料的原料，或作为用于微生物生产的补充培养基。本方法同样适用于单细胞 生物质和乙醇的生产。根据本发明的生物质分级处理的优点是有机材料更广泛的水解，因此，与现有技 术相比，用于单细胞脂质生产的生物材料具有更好的可用性。此外，从酸和碱处理获得的滤 液或沉淀相互中和并减少了中和所要求的化学品的使用。现有技术的方案描述了含用于乙醇生产的微生物学步骤的方法，其中含碳水化合 物的材料被用作原料，原样或转化成单糖。专利申请出版物US 2002/0185447和专利US 5637502也描述了碳水化合物的处理方法，诸如采用酸或碱处理，跟在这些处理之后的是成 醇发酵(alcoholic fermentation)。关于微生物学处理，两种所述方法均局限于乙醇生产， 其中使用了从多糖形成的己糖。在专利申请出版物US 2003/0096385中，使用微生物生产 了异戊二烯基乙醇(乙醇的栊牛儿基和法呢基衍生物)。专利申请出版物WO 03/038067描 述了这样的方法，其中真菌微生物的基因组修饰可得到能够利用戊糖的生物。该出版物仅仅针对乙醇生产。本发明提供了针对热机械木材加工的更显著含水侧流开发的新的可能的方案，特 别是发生在纸浆和造纸工业，特别是作为用于交通燃料原料的热机械木材加工。本发明考 虑到在与机械木浆制造的连接中产生的含碳水化合物侧流的生物学荷载，因此，废水处理 的能源费用有待降低。以具体的形式，本发明是脂质生产工艺，它提供了针对产生用于交通 燃料、生化柴油或可再生柴油的原料的环境友好的方案，例如从在TMP工艺或木材的相应 机械处理中产生的稀的含碳水化合物的含水级分。本方法也提供了针对其他源材料开发的备选方案。依照本方法，再循环纤维，诸如 印刷纸、包装材料和可比较的基于纤维素的材料，可被用作源材料。与现有技术相比，本发明因此是符合可持续发展的原则的，通过增加脂质原料的 利用度并降低来自其他来源的有机脂质的总需求。本发明因此提高了基于可再生自然资源 的生物燃料原料的利用度，并且有助于将它们的生产费用带至消费者可接受的终端用户水 平。在考虑到源材料的全面利用的地方，本发明不仅仅局限于所含的碳水化合物的全 面利用。本方法也包括允许木材物质中可提取级分的脂质组分被回收的阶段。当采用水处 理源材料时，滤液将脂质组分分开，所述脂质组分可通过本领域技术人员熟悉的方法从含 水溶液中回收。作为源材料酸处理的结果，可提取级分中的脂质得到游离脂肪酸，所述游离 脂肪酸以不溶的碱土金属盐诸如Ca++盐形式与滤液分离，在沉淀分离之后，它们被酯交换 成醇酯。相应地，源材料的碱提取，从可提取的级分产生脂肪酸盐，所述盐是水溶性的，因此 混合于滤液中。在本发明中，所述盐被转化成水不溶性盐诸如Ca++盐形式，从水相分离沉淀 并用于制造脂肪酸醇酯。下列实施例意图阐明本发明，它们不能被理解为以任何方式限制本发明的范围。 本发明也不以任何方式局限于所用的微生物菌株。本发明不仅可通过所用的菌株实现，而 且可通过相同种或属的其他菌株，或其他微生物属或种的菌株或通过遗传学修饰的微生物 菌株实现。产生脂质的微生物通常是可用的，它们存在于数个菌株保藏机构中，例如ATCC、 DSM等等。产生脂质的微生物和使用微生物(包括藻类)的脂质生产工艺在文献中进行了描 述，例如在著作中Single Cell Oils，eds. Ζ· Cohen 和 C. Ratledge，AOCS Press, 2005 and Microbial Lipids,eds. C. Ratledge and S. G. Wilkinson,vol.1 and 2,Academic Press, 1988。
实施例实施例1将木纤维、磨碎的木材、TMP浆、锯屑和磨木浆各IOOg保存于1升沸水90-100°C中 2小时。将溶液从纤维材料(下文中称为沉淀)中过滤出来。回收沉淀，并根据实施例4或 5中给出的备选方式中的一种使用多种备选方式处理沉淀以增加单糖产率。溶液的碳水化 合物产率范围为2%至6%，取决于源材料，当使用在高温(超过170°C)下磨碎的云杉纤维 作为源材料时，通常为4%。这些溶液中的一些在没有进行蒸发的情况下被再利用用于提取 下列批次的纤维，这些溶液中的一些被蒸发浓缩直至达到约20%重量的干物质含量。将浓 缩的滤液回收用于单细胞脂质的生产。对所提取的树种而言，溶解的碳水化合物通常分为
18己糖和戊糖。实施例2将木纤维、磨碎的木材、再循环纤维、TMP浆、锯屑和磨木浆各自加入到1升5%碱 溶液(NaOH)中，并在90-100°C搅拌3小时。在常温进行过滤，并根据实施例4将沉淀进行 进一步处理用于单糖的生产。将提取溶液进行处理以便每一种溶液的一部分被再次用于处 理下一批次的纤维，一部分被中和，一部分被根据实施例4进行水解，因为一些木质素以及 一些寡糖和多糖已经溶解于碱提取溶液中了。通过所述碱处理从不同源材料获得的溶液保 持源材料重量5%的平均值。将在原始碱处理中获得的沉淀采用碱进行再处理，通过重复之前的碱处理并在 Sbar的压力和170°C的温度下磨碎6分钟。使用这种进一步磨碎，可将溶解于碱溶液中材 料的量增加至源材料原始量27%的平均值。溶液变成黑色，在中和、水解和浓缩之后，将它 们采用活性炭和离子交换剂进行处理用于脱色。回收混合物并将其用于生产单细胞脂质。实施例3将木纤维、磨碎的木材、TMP或MDF浆、锯屑、磨木浆、再循环纤维和根据实施例2制 备的中和了的提取物各IOOg在1升5%矿物酸(pH 1)中在90-100°C水解3小时。通过过 滤将沉淀与溶液分离。溶液含有源材料量平均10%的单糖。将每一种溶液进行处理以便一 部分被中和、过滤并通过蒸发浓缩直至达到约20%重量的单糖量，将浓缩液回收用于单细 胞脂质的生产。将溶液的一部分再次原样使用用于下列批次源材料的水解，如在该实施例 中所述。根据下面的实施例5，将沉淀进行进一步处理以增加单糖产率。实施例4将木纤维、磨碎的木材、TMP浆、MDF浆、锯屑、磨木浆、稻草、谷皮和根据实施例1_3 的沉淀各125g加入到浓度为10%的硫酸溶液中，使酸吸附2小时。倾倒出过量的酸，并将 混合物引导至翼状精磨机，通过预汽蒸11分钟将温度升高，而不让浓缩物流出，之后，将温 度升高至160°C且压力至8bar，使用翼状精磨机进行磨碎。11分钟的混合物磨碎时间是针 对云杉纤维而选择的。磨碎后，将沉淀与溶液分离。将每一种沉淀进行分割以便一部分被 用于焚化，一部分被根据下面的实施例5再次磨碎以增加单糖产率。相应地，将溶液中和、 过滤并通过蒸发浓缩直至达到约20%的单糖浓度。将这些溶液回收用于单细胞脂质的生 产。实施例51D.将木纤维、磨碎的木材、TMP浆、锯屑、磨木浆、稻草和谷物纤维以及根据实施 例1-4剩余的沉淀各125g加入到40%硫酸溶液中，并使其在室温吸附2小时。倾倒出过量 的酸，并将沉淀在翼状热磨机中磨碎以便通过预汽蒸11分钟将沉淀的温度升高而不让浓 缩物流出。然后将温度升高至170°C且压力至8bar。对稻草和谷物纤维而言，最适宜的磨 碎时间为11分钟。将沉淀与溶液分离。溶解了的物质的比例平均超过源材料的50%。将 溶液中和、过滤并通过蒸发浓缩，并回收用于单细胞脂质的生产。将沉淀即残留的纤维部分 地进行焚化，部分根据该实施例再次磨碎以增加单糖产率。同样将浓硫酸(72% )单独地吸附到上述源材料中，处理时间为2小时，在室温。 随后，将酸稀释至5%并在常压和10(TC下煮沸4小时。进一步处理和所产生级分的用途如 上发生。
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实施例6可从谷壳、稻草和谷皮生产适合用于生产单细胞脂质的单糖，通过使用5%酸的直 接水解或采用更强的酸浸渍并在5%溶液中水解或首先采用碱处理，并且可将半纤维素和 纤维素如上面的实施例所呈现的单独地进行水解。这些处理可与采用酸或碱的浸渍处理相 结合，随后在翼状或盘状精磨机中重复磨碎以生产热-磨木浆。然而，在该实施例中，将谷 壳、稻草和谷皮(各125g)在8bar的压力下进行预汽蒸11分钟并在翼状精磨机中在170°C 的温度下处理成热-磨木浆。将所产生的热-磨木浆在1升体积的5%酸(硫酸)中在 90-100°C和常压下水解4小时。通过过滤将溶液级分分离并中和。随后，将溶液浓缩并回 收用于单细胞脂质的生产。单糖产率平均为源材料的50%。为了增加碳水化合物产率，将 过滤后剩余的沉淀根据实施例5进行热机械地再处理，并将一部分进行焚化。实施例7将谷壳、稻草和谷皮(各16kg)各自在100升碱溶液(1. 2M NaOH)中在90_100°C 处理4小时。混合物被分割成沉淀和溶液。平均所饲源材料干物质的49-57%终结于溶液 中。给予5%的碱溶液，至于酸，使用硫酸，并将它们如实施例6中所述进行水解。主要形成 了木糖和阿拉伯糖的混合物，也含少量葡萄糖和半乳糖。溶液的单糖含量变为所饲源材料 的23-33%。在将溶液回收用于单细胞脂质的生产之前，通过活性炭处理将它们的颜色降 低。将过滤中获得的沉淀浸渍于5%酸(硫酸)中，并在翼状精磨机中在6bar的压力 和150°C的温度下磨碎11分钟。沉淀降解成可溶的碳水化合物，主要是葡萄糖和半乳糖，中 和并过滤之后，将其回收用于单细胞脂质的生产。将酸水解之后进行的过滤后剩余的沉淀 级分仍然再次磨碎，然后根据实施例4在10%酸中水解。在这些处理之后获得了溶液，它们 含有总共55-65%的源材料。将溶液回收用于单细胞脂质的生产。实施例8将蒸汽干燥的甜菜浆倒入桶中，并将足够的沸水倒入它的上面以便水覆盖了甜菜 浆。在通过倾析将水与固体分离之前，使溶液冷却。3. 6mg/ml的干物质已经溶解于水中。将 含水级分部分用于处理新的批次，部分在浓缩之后回收用于单细胞脂质的生产。将所获得 的固体级分，沉淀，含16. 7%的干物质，称量为748g，相当于作为干物质的125g干甜菜浆， 将其采用0. 4M磷酸(H3PO4, 500ml)在室温浸渍18小时。倾倒出过量的酸溶液，并在开始热 机械磨碎之前预汽蒸11分钟。使用翼状精磨机将混合物磨碎11分钟。在磨碎过程中，压 力为8bar，温度最初为172°C，当磨碎时间过去10分钟时温度为162°C。将混合物从精磨机 中除去并过滤。溶液级分，2. 26升，含有2. 75%的干物质。过滤之后，所饲进行磨碎的50% 的干物质存在于溶液中。溶液主要含有单糖，葡萄糖、半乳糖、阿拉伯糖和木糖。此外，观察 到了较小量的分子量范围为500至3000的寡糖和更高分子量的化合物。将溶液级分中和、 浓缩并回收用于单细胞脂质的生产。将从甜菜浆的上述处理获得的固体纤维浆，沉淀(125g干物质)，在室温浸渍于 15%盐酸中4小时。倾倒出过量的酸，并将浆在相同条件下再次磨碎。过滤阶段之后，观察 到另外的28%的单糖已经进入了溶液相。弃去沉淀。实施例9将源材料——云杉纤维进行热机械地处理，称量46. 8g (约1升体积)，并将0. 2NNaOH加入到它的上面，向其中进一步加入5. 6g的Na2CO3和1.3g的MgSO4 6H20 (500ml)。将 混合物加热至50°C，在溶液中得到较小量的葡萄糖、木糖、半乳糖、阿拉伯糖、甘露糖和另外 的低聚物。溶液的PH约为11，将其过滤并用水洗涤。将洗涤液和滤液合并，并将溶液蒸发 至320ml。已溶解的物质的量为源材料的4.5% (干物质)。为了增加单糖的量，向溶液中 加入酸，得到沉淀。将沉淀与溶液分离，将后者回收并用于生产单细胞脂质。如实施例3中 所述，将沉淀在5%酸中水解成单糖。利用水解，从沉淀物质中产生了 单糖，这些单糖进 入溶液，并在脱色后将其回收用于单细胞脂质的生产。实施例10将45g批次(约1升)热机械处理过的云杉纤维称重，在其上面加入0. 2N NaOH, 向其中进一步加入5. 6g的Na2CO3和1. 3g的MgSO4 6H20(500ml)。将混合物加热至50°C, 过滤，并用水洗涤沉淀。将洗涤液和滤液合并。为了增加单糖的量，向合并后的滤液中加入 酸，并根据实施例3进行水解。中和后，将所产生的水解产物回收用于单细胞脂质的生产。 将洗涤后的沉淀压缩至300ml，并加入1升pH 4. 8的柠檬酸盐缓冲液，并加入纤维素酶。低 聚物和葡萄糖在混合物中产生。将酶处理过的混合物原样回收以及作为分离的滤液、溶液 回收，并用于生产单细胞脂质。实施例11提供125g批次的燕麦谷壳，并将其在170°C和Sbar的压力下热机械地磨碎2分 钟。处理后，通过过滤将沉淀与溶液分离。将溶液回收用于生产单细胞脂质。使用7g批 次的沉淀(纤维)，给予强度为19%的硫酸并回流4小时。分析显示处理得到以源材料的 56%进入溶液的单糖，大部分为木糖、甘露糖、葡萄糖、半乳糖和阿拉伯糖。将溶液回收用于 生产单细胞脂质。实施例12称量400g的燕麦谷壳，并加入3升水和200g NaOH。将混合物在搅拌下保持在 90-96°C的温度2小时。将混合物过滤穿过布料，并分离纤维。将滤液级分(50ml)中和，并 采用柠檬酸盐缓冲液(40ml)将其pH调节至4.8，加入multifect木聚糖酶(IOml)，并将混 合物自动调温至50°C。糖类被释放进入溶液，其中25. 2%为木糖，11. 8%为阿拉伯糖。在 50小时的反应时间之后，溶液中也存在低聚物。将整个混合物回收用于生产单细胞脂质。实施例13采用0. 4M硫酸将125g甜菜浆浸渍，12小时之后倾倒出过量的酸。将浆转移至翼 状精磨机，在其中将浆预汽蒸4分钟并在150°C和6bar的压力下磨碎11分钟。将混合物中 和并加入柠檬酸直至PH跌至4。加入IOml果胶酶4450U,即178mg/ml的蛋白质(Sigma)， 并使反应在25°C进行24小时。反应后，将混合物的一部分回收用于单细胞脂质的生产，并 将一部分过滤。将从过滤获得的沉淀返回磨碎阶段，并将从该处理得到的溶液级分采用2g/ L的活性炭进行处理，然后引导至阴离子交换柱。将从柱可获得的单糖溶液蒸发至20%浓 度的干物质，回收用于单细胞脂质的生产。实施例14根据实施例7将燕麦谷壳进行处理，得到含23. 8g/L葡萄糖、93. 3g/L木糖、37. Ig/ L阿拉伯糖和9. Og/L半乳糖的混合物。将该混合物作为培养基加入用于合成脂质的酵母 菌解脂耶氏酵母菌(Yarrowia lipolytica) ATCC 20373和胶红类酵母菌TKK 3031，原样，作为1 1稀释液和作为补充有llg/L葡萄糖的相应稀释液。培养周期为68小时，温度为 28°C，在250rpm下振摇，培养体积为50ml。如在图3中所观察到的，酵母菌能够生长并在不 要求添加其他营养素的情况下合成脂质。实施例15将三种酵母菌胶红类酵母菌、解脂耶氏酵母菌和马克思克鲁维酵母 (Kluyveromyces marxianus) (Anam. Candida kefyr) ATCC 42265，采用木糖作为碳源进行 单独地培养。培养基含有20g/L木糖、10g/L酵母提取物和20g/L蛋白胨。在200rpm的振 摇下，在50ml的体积和25°C下进行培养。图4显示所有的三种菌株能够利用戊糖作为碳源。
权利要求
一种从包括多糖的有机源材料生产脂质或脂质混合物的方法，所述多糖选自包括纤维素、半纤维素、淀粉、所有的这些、其任何混合物或其降解产物或者非淀粉多糖的组，其特征在于包括a)将源材料用选自包括下列的组的物质处理i)水，ii)酸，和iii)碱，之后，分离沉淀和滤液，并将获得的沉淀原样或在水、酸或碱的存在下进行机械的或热机械的磨碎，并分离沉淀和滤液，备选地，将沉淀再次进行i)、ii)或iii)任何部分的处理和/或磨碎一次或更多次，以及b)将产生脂质的微生物与如此获得的滤液或与复数种所得滤液或与沉淀，或者与从这些所得的任何组合以及，任选地，与源材料，在培养基中接触，借此微生物开始生产脂质，并c)回收脂质。
2.根据权利要求1的方法，其特征在于，同样任选地使用包括一个或更多下列步骤的 方法处理沉淀d)将从a)部分获得的沉淀用强酸处理并分离沉淀和滤液，或者，备选地，e)将从a)或d)部分获得的沉淀酸化并将其进行机械地或热机械地磨碎，分离沉淀和 滤液，或者，任选地，使用根据步骤a)、d)或e)中任何步骤的方法以任选的次序将从步骤 a)、d)或e)中任何步骤获得的沉淀再次处理一次或更多次，f)将产生脂质的微生物与从a)、d)或e)部分获得的滤液或沉淀，或者与从这些获得 的任何组合以及，任选地，与源材料，在培养基中接触，借此微生物细胞开始生产脂质，并g)回收脂质。
3.根据权利要求1或2的方法，其特征在于，所述源材料源于木材的机械的或热机械的 处理或者源于栽培植物。
4.根据权利要求1-3中任一项的方法，其特征在于，将所述源材料用水或酸处理。
5.根据权利要求1或2的方法，其特征在于，所述源材料源于选自包括再循环纤维、甜 菜浆、谷壳、稻草、麦麸、谷物颗粒、完整可栽培作物、栽培植物、TMP浆和MDF浆的组的来源。
6.根据权利要求1、2或5的方法，其特征在于，将所述源材料用酸处理。
7.根据权利要求1或2的方法，其特征在于，所述源材料源于选自包括锯屑、精制的磨 木浆、谷壳、稻草、TMP浆、MDF浆、甜菜浆和含有非必要量淀粉的栽培植物的组的来源。
8.根据权利要求1、2或7中任一项的方法，其特征在于，将所述源材料用碱处理。
9.根据权利要求1或2的方法，其特征在于，所述源材料源于选自包括微生物物质、沼 泽的或水下的生物质、来自纤维素工厂的集水区域的生物质、来自城市废物的生物质和来 自城市下水道的生物质的组的来源。
10.根据前述权利要求中任一项的方法，其特征在于，所述滤液含有至少0.5-1%重 量、高达20-30%重量、优选4-5%重量的可用于脂质生产的糖类。
11.根据权利要求1或2的方法，其特征在于，步骤a)、d)或e)中任何步骤的处理进 行一次或更多次。
12.根据权利要求1的方法，其特征在于，在a)iii)部分中用碱处理源材料时，将所得沉淀用酸再处理，并分离沉淀和滤液。
13.根据权利要求1或2的方法，其特征在于，用强酸处理含纤维的沉淀时，将所得沉淀 再次机械地或热机械地磨碎。
14.根据前述权利要求中任一项的方法，其特征在于，将一种或更多种酶加入到生物材 料处理溶液中。
15.根据前述权利要求中任一项的方法，其特征在于，使用使滤液更适于微生物生长的 方法，诸如脱色方法、调节PH和/或除去水或加入水，将从任何工艺步骤 获得的滤液进行进一步处理。
16.根据前述权利要求中任一项的方法，其特征在于，将所述源材料进行机械地、热机 械地、物理地、化学地、生物学地预处理，或通过这些处理的组合预处理。
17.使用根据权利要求1-16中任一项的方法所生产的脂质或脂质混合物用作制造生 物燃料的原料的用途。
18.—种生物燃料，其特征在于，脂质用于它的生产，其中所述脂质是使用根据权利要 求1-16中任一项的方法生产的。
19.一种净化城市下水道的方法，其特征在于，使用根据权利要求1-16中任一项的方 法处理城市下水道。全文摘要
本发明涉及从有机源材料形成脂质或脂质混合物的方法，所述有机源材料包括纤维素、半纤维素、淀粉、非淀粉多糖、其任何混合物或其降解产物。根据本方法，将源材料用水、酸或碱的水溶液处理一次或更多次，并分离沉淀和滤液。可将从上述处理中获得的沉淀进行机械的或热机械的磨碎，或者可将沉淀用强酸处理，或者可将沉淀酸化并进行机械地或热机械地磨碎。处理后，分离沉淀和滤液。将产生脂质的微生物与源材料或所得滤液在培养基中接触，借此微生物细胞开始生产脂质，并回收脂质。
文档编号C12P19/02GK101910407SQ200880124741
公开日2010年12月8日 申请日期2008年11月14日 优先权日2007年11月14日
发明者M·穆朱南, O·帕斯蒂南, S·拉克索, S·霍卡南 申请人:阿尔托大学基金会