专利名称：5-氨基乙酰丙酸脱水酶抑制剂的筛选方法及使用方法
技术领域：
本发明涉及5-氨基乙酰丙酸脱水酶抑制剂的筛选方法及使用方法。
背景技术：
5-氨基乙酰丙酸(5-aminolevulinic acid， ALA)广泛存在于生物体中，是合成 血红素、叶绿素、维生素B^等四吡咯化合物的共同前体物质。ALA作为一种 光动力学齐U(photodynamic agent， PDT)于1999年在美国批准上市。目前ALA在 农用化学品和医学领域具有广泛的用途。在农业领域，ALA可作为除草剂、杀 虫剂等并具有增加植物抗寒、抗盐性和促进植物生长等多种功能，作为易降解 无残留、对人畜无毒性的新一代生物农药，ALA成为极具发展前途的无公害绿 色农用化学品。在医学领域，作为新一代光动力学药剂其具有毒性小，选择性 高等显著优点，可在临床上用于治疗胃癌、皮肤癌、膀胱癌、结肠癌和胰腺癌 等多种癌症，在光化疗领域正逐步展现其巨大的应用性。基于ALA的功能和广 阔的应用前景，其合成研究已经引起广泛的重视。
目前ALA的生产多采用化学法合成，其步骤多、副产物毒性大且得率低； 而生物诱变法生产ALA，主要是优化类球红细菌突变株，所报道ALA的最高产 量为27mmol/L，但其培养周期长，成本较高。
发明内容
本发明的目的是提供一种用于生产5-氨基乙酰丙酸的5-氨基乙酰丙酸脱水 酶抑制剂的筛选方法及使用方法。
5-氨基乙酰丙酸脱水酶抑制剂的筛选方法，其歩骤为
1) 用接种针从保藏编号为CGMCC No. 1939工程菌Rosetta(DE3)-pET28a-R.S.hemA的tJ油管中蘸取菌液(大肠杆菌埃希氏菌，在中国专利局指定的保藏单 位中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏日期2007丄25， 保藏编号为CGMCC No.1939)，在含有30-40^ig/ml卡那霉素和30-40|ig/ml氯 霉素的LB培养基平板上划线后，置于37C烘箱中过夜培养；
2) 将平板上的单克隆接种于含30-50ml LB培养基的250ml摇瓶中，转速为 200-220rmp，在37'C培养7-10h得到种子；
3) 取2ml-4ml种子接种于含100-150ml LB培养基的500ml的摇瓶中，起始 培养温度为37。C， 2h后降至27-29°C，再用0.05-0.2mmol/L异丙基-(3-D-硫代半 乳糖苷诱导；4) 诱导培养4-8h，在菌体密度OD6o。达到3-5时，收获菌体；
5) 菌体经离心和超声破胞后获得粗酶液，亲和层析分离粗酶液获得重组的5-氨基乙酰丙酸合成酶，提取5-氨基乙酰丙酸合成酶后的粗酶液经凝胶过滤层析获 得5-氨基乙酰丙酸脱水酶；
6) 将糖类物质添加到5-氨基乙酰丙酸合成酶的水溶液中，并测定酶的活力 ，与不添加糖类物质的5-氨基乙酰丙酸合成酶的水溶液比较酶的活力，筛选对5-氨基乙酰丙酸合成酶的活力没有抑制作用的糖类；再将筛选得到的糖类添加到 5-氨基乙酰丙酸脱水酶的水溶液中，并测定酶的活力，与不添加糖类的5-氨基乙 酰丙酸脱水酶的水溶液比较酶的活力，筛选具有抑制5-氨基乙酰丙酸脱水酶活力 作用的糖类，即为5-氨基乙酰丙酸脱水酶的抑制剂。
本发明中，所说的糖类物质为D-葡萄糖，D-木糖，D-果糖，D-甘露糖，D-半乳糖，L-阿拉伯糖，乳糖，蔗糖或麦芽糖。
本发明筛选的5-氣基乙酰丙酸脱水酶抑制剂用于生产5-氨基乙酰丙酸的方 法将5-氨基乙酰丙酸脱水酶的抑制剂配制成浓度为300-350 g/L木糖水溶液， 加到生产5-氨基乙酰丙酸的发酵罐中，使木糖初始浓度为4 g/L，首次添加时间 为发酵开始后4小时，在以后发酵过程中维持木糖浓度在3-6 g/L。
本发明筛选得到的5-氨基乙酰丙酸脱水酶抑制剂属于生物质资源，对环境 友好，有利于资源利用和环境保护，作为抑制剂添加于生产ALA发酵过程中， 可使胞外ALA产量明显提高，具有广阔的工业化前景。
图1是糖类物质对于ALA脱水酶的抑制作用。
具体实施例方式
以下结合实施例进一歩说明本发明 实施例1
5-氨基乙酰丙酸脱水酶抑制剂的筛选方法，其步骤为
1) 用接种针从保藏编号为CGMCC No.1939工程菌Rosetta(DE3)-pET28a-R.S.hemA(大肠杆菌埃希氏菌，在中国专利局指定的保藏单位中国微生物菌种保 藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏日期2007丄25，保藏编号为CGMCC No.l939)的甘油管中蘸取菌液，在含有30-4(Vg/ml卡那霉素和30-4(Vg/ml氯霉 素的LB培养基平板上划线后，置于37'C烘箱中过夜培养；
2) 将平板上的单克隆接种于含30-50ml LB培养基的250ml摇瓶中，转速为 200-220rmp，在37。C培养7-10h得到种子；3) 取2ml-4ml种子接种于含100-150ml LB培养基的500ml的摇瓶中，起始 培养温度为37°C ， 2h后降至27-29°C ，再用0.05-0.2mmol/L异丙基-P-D-硫代半 乳糖苷诱导；
4) 诱导培养4-8h，在菌体密度OD6Qo达到3-5时，收获菌体；
5) 菌体经过离心和超声破胞后获得粗酶液，粗酶液经过Ni-NTA亲和层析 分离获得重组的5-氨基乙酰丙酸合成酶，提取5-氨基乙酰丙酸合成酶后的粗酶 液经过Sephadex G-50凝胶过滤层析获得5-氨基乙酰丙酸脱水酶。
6) ALA合成酶酶活的测定反应总体系为500ul，包含50 mM Tris-HCl (pH 7.5)， 20mMMgC12， 0.1 M甘氨酸，O.lmM磷酸吡。多醛，0.2 mM琥珀酰CoA 和酶液。在37。C下保温10min后，加入等体积的20。/。(w/v)三氯乙酸终止反应。 通过显色反应测定牛成的ALA来确定酶活。 一个酶活单位定义为在lh内合成1 nm的5-氨基乙酰丙酸(ALA)所需要的酶量。在ALA合成酶反应体系中分别加入 20mM的D-葡萄糖，D-木糖，D-果糖，D-甘露糖，D-半乳糖，L-阿拉伯糖，乳 糖，蔗糖和麦芽糖，进行ALA合成酶的酶活测定，与不添加糖类物质的空白对 照相比较，来确定是否对ALA合成酶存在影响作用，筛选对5-氨基乙酰丙酸合 成酶的活力没有抑制作用的糖类；
2) ALA脱水酶酶活的测定采用500(il的反应体系，包括50 mM的磷酸钾缓 冲液(pH-7.5)， 50 |aM ZnCl2, 1 mM of MgCl2, 5 mM ALA和酶液。在37。C下保温 10min后，加入等体积的20%0 )三氯乙酸终止反应。通过显色反应测定生成 的胆色素原来确定酶活。一个酶活单位定义为在lh内合成1 nm的胆色素原(PBG) 所需要的酶量。在ALA脱水酶反应体系中分别加入20mM的D-葡萄糖，D-木 糖，D-果糖，D-甘露糖，D-半乳糖，L-阿拉伯糖，乳糖，蔗糖和麦芽糖，进行 ALA脱水酶的酶活测定，与不添加糖类物质的空白对照相比较，来确定是否对 ALA脱水酶存在抑制作用。筛选具有抑制5-氨基乙酰丙酸脱水酶活力作用的糖 类，即为5-氨基乙酰丙酸脱水酶的抑制剂。
不同的糖类对于ALA脱水酶的抑制效果如图l所示。 将筛选获得的ALA脱水酶抑制剂用于ALA的发酵生产 将100ml 二级种子接种于含9L上述发酵培养基的15L发酵罐中，使罐上 的初始菌液密度OD,近似为0.2，发酵罐转速为300rmp,空气流量为9 L/min， 初始发酵培养基的配方为5g/L酵母提取物，10g/L胰化蛋白胨，2g/L葡萄糖， 2 g/L甘氨酸，3 g/L琥珀酸。起始培养温度为37°C ， 2h后降至28°C ，用O.lmmol/L 异丙基-(3-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导；培养6h后流加含有63g琥珀酸和36g甘氨酸，体积为900ml的补料培养基，同时添加4 g/L的木糖作为抑制剂；并根据 葡萄糖的消耗情况继续添加葡萄糖，维持葡萄糖浓度在2-4 g/L。通过流加补料 培养基控制pH为6.2。采用Mauzerall和Granick的分析方法(参照Mauzerall D, Granick S. J.Bio.Chem.， 1956, 219:435—442)测定ALA的浓度。胞外ALA的浓度 在发酵后30h时可达到8.6 g/L。
权利要求
1.5-氨基乙酰丙酸脱水酶抑制剂的筛选方法，其步骤为1)用接种针从保藏编号为CGMCC No.1939工程菌Rosetta(DE3)-pET28a-R.S.hemA的甘油管中蘸取菌液，在含有30-40μg/ml卡那霉素和30-40μg/ml氯霉素的LB培养基平板上划线后，置于37℃烘箱中过夜培养；2)将平板上的单克隆接种于含30-50ml LB培养基的250ml摇瓶中，转速为200-220rmp，在37℃培养7-10h得到种子；3)取2ml-4ml种子接种于含100-150ml LB培养基的500ml的摇瓶中，起始培养温度为37℃，2h后降至27-29℃，再用0.05-0.2mmol/L异丙基-β-D-硫代半乳糖苷诱导；4)诱导培养4-8h，在菌体密度OD600达到3-5时，收获菌体；5)菌体经离心和超声破胞后获得粗酶液，亲和层析分离粗酶液获得重组的5-氨基乙酰丙酸合成酶，提取5-氨基乙酰丙酸合成酶后的粗酶液经凝胶过滤层析获得5-氨基乙酰丙酸脱水酶；6)将糖类物质添加到5-氨基乙酰丙酸合成酶的水溶液中，并测定酶的活力，与不添加糖类物质的5-氨基乙酰丙酸合成酶的水溶液比较酶的活力，筛选对5-氨基乙酰丙酸合成酶的活力没有抑制作用的糖类；再将筛选得到的糖类添加到5-氨基乙酰丙酸脱水酶的水溶液中，并测定酶的活力，与不添加糖类的5-氨基乙酰丙酸脱水酶的水溶液比较酶的活力，筛选具有抑制5-氨基乙酰丙酸脱水酶活力作用的糖类，即为5-氨基乙酰丙酸脱水酶的抑制剂。
2. 根据权利要求l所述的5-氨基乙酰丙酸脱水酶抑制剂的筛选方法，其特征 在丁所说的糖类物质为D-葡萄糖，D-木糖，D-果糖，D-甘露糖，D-半乳糖，L-阿拉伯糖，乳糖，蔗糖或麦芽糖。
3. 权利要求1所述的5-氨基乙酰丙酸脱水酶抑制剂用于生产5-氨基乙酰丙酸 的方法将5-氨基乙酰丙酸脱水酶的抑制剂配制成浓度为300-350 g/L木糖水溶 液，加到生产5-氨基乙酰丙酸的发酵罐中，使木糖初始浓度为4g/L，首次添加 时间为发酵开始后4小时，在以后发酵过程中维持木糖浓度在3-6 g/L。
全文摘要
本发明公开的5-氨基乙酰丙酸脱水酶抑制剂的筛选方法，步骤如下用LB培养基平板活化保藏编号为CGMCC No.1939工程菌Rosetta(DE3)-pET28a-R.S.hemA；将平板上的单克隆接种于LB培养基摇瓶中培养，将得到的种子接种于LB培养基的摇瓶中发酵培养，用异丙基-β-D-硫代半乳糖苷降温诱导，收获菌体；菌体经离心和超声破胞，分离获得重组的ALA合成酶和ALA脱水酶；使用不同糖类物质作为添加剂，筛选对ALA脱水酶具备抑制作用，同时对ALA合成酶没有抑制作用的糖类抑制剂木糖。本发明的ALA脱水酶抑制剂属于生物质资源，对环境友好，用于发酵生产ALA，可使产量明显提高。
文档编号C12Q1/527GK101586147SQ20091009946
公开日2009年11月25日 申请日期2009年6月8日 优先权日2009年6月8日
发明者傅维琦, 岑沛霖, 林建平 申请人:浙江大学