专利名称：牛分枝杆菌Taqman荧光定量PCR检测方法
技术领域：
本发明涉及一种牛分枝杆菌检测方法，具体地说，涉及一种牛分枝杆菌Taqman荧光定量PCR检测方法。
背景技术：
自从1882年Kock发现结核分枝杆菌以来，分枝杆菌新菌种的发现、命名、分类及其演变都有很大的发展变化。在微生物分类学上，分枝杆菌归属于原核生物界、原壁菌门、 放线菌纲、放线菌目、分枝杆菌科、分枝杆菌属。分枝杆菌属成员均为好氧，平直或弯曲细长，革兰氏阳性杆菌。在一定情况下可产生菌丝，但这些菌丝在搅动后成为杆状或球形。1898年，Smith首次将牛分枝杆菌(M. bovis)和其它的分枝杆菌明确区分开来。牛分枝杆菌主要感染不同种属的温血动物，包括有蹄动物、有袋动物、食肉类动物、灵长类、鳍脚类动物和啮齿类动物在内的50多种哺乳动物，还包括类鹦鹉鸟、石鸽、北美洲乌鸦等20 多种禽类，其中牛是最敏感的动物。在核苷酸水平上，牛分枝杆菌与结核分枝杆菌基因组相比，其同源性大于 99. 95%，表现出共线性，没有广泛的置换、复制或倒置现象。在牛分枝杆菌基因组全序列测定之前，一般是利用基于杂交原理(高度准确的序列鉴定)方法来比较结核分枝杆菌复合群之间的基因差别，发现牛分枝杆菌基因组中存在大小为1 12. 7kb不等的片段缺失。在牛分枝杆菌中，仅有一个被称作TbDl的基因位点，在现有的大多数结核分枝杆菌中没有该基因的存在。因此，基因缺失在牛分枝杆菌基因组形成中可能起到了至关重要的作用。实时荧光定量PCR(real-timefluorogenetic quantitative PCR)是在定性技术基础上发展起来的核酸定量技术。它是一种在PCR体系中加入荧光基团，利用荧光信号积累，实时监测整个PCR进程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法。该技术不仅实现了对DNA模板的定量，而且具有灵敏度高、特异性和可靠性更强、自动化程度高、无污染性、具实时性和准确性等特点，目前已广泛应用于分子生物学研究和医学研究等领域。 这种探针的长度为20-24bp，在其5’末端标记一个荧光报告基团，3’末端标记一个荧光淬灭基团，其序列与两引物包含序列内的一段DNA模板完全互补。该法利用Taq酶的5’ _3’ 外切酶活性，当探针保持完整时，淬灭基团吸收发射基团的发射荧光。在PCR的退火期，探针与模板发生特异性杂交，延伸期引物在Taq酶作用下沿DNA模板延伸，当达到探针后， TaqMan的外切酶活性将探针切断，荧光信号得以释放。模板每复制一次，就有一次荧光信号的释放，通过该技术可以对模板进行准确定量。荧光定量PCR采用密封系统，将PCR扩增、荧光探针杂交及检测一体化，在单一反应管中进行，自动化程度高，可避免在PCR期间及PCR之后产物受到污染，确保结果的准确性。荧光定量PCR在扩增过程中实时监控，实现了每一轮循环均检测一次荧光信号的强度， 并记录在电脑软件之中，计算每个样品Ct值。由于Ct值与起始模板浓度的对数存在线性关系，可利用标准曲线对未知样品进行定量测定，根据标准曲线获得定量结果。Mishra等用巣式PCR对牛分枝杆菌和结核分枝杆菌进行区分和检测，但是巣式PCR比荧光PCR步骤繁琐，而且及其不敏感。研究发现，500bp基因片段为牛结核杆菌基因组所特有的基因，利用这个片段可以用于牛结核分枝杆菌的诊断和鉴别，但应用500bp基因片断进行的PCR检测并不能检出所有的牛分枝杆菌，存在漏检现象。Taylor等人对牛分枝杆菌基因数目可变区RD4侧翼序列设计引物，用STOR Green荧光定量PCR方法进行检测，并和传统PCR方法比较，结果显示特异性提高，表明该序列可以对牛分枝杆菌进行特异性检测。但是很多研究都没有进行绝对定量，本发明根据对牛分枝杆菌的高度特异性，建立了可以简便快速、准确检测牛分支杆菌的荧光定量PCR检测方法，有利于区分牛分枝杆菌和其他分枝杆菌，尤其是牛分枝杆菌和结核分枝杆菌的区分，对人结核病和牛结核病的防控和治疗、牛结核病的临床检测及各种疫苗的研究具有重要意义。
发明内容
本发明的目的是提供牛分枝杆菌的实时荧光定量PCR检测方法，利用Taqman荧光定量PCR检测方法的快速、敏感和特异性，准确检测并鉴定牛分支杆菌引起的牛结核病。为了实现本发明目的，本发明提供一种牛分枝杆菌Taqman荧光定量PCR检测用引物及探针，其中，上游引物为5 ’ -TGAAGTAGTAATGTGCGAGCTGAG-3 ’；下游引物为 5，-CGTTGTAGGCCACTCCAAGAG-3，；探针为5，-JOE-CGCTTCTGCACGACTACGGCTTGTATGA-Eclips e-3，。 本发明还提供含有上述弓I物及探针的检测试剂盒。本发明进一步提供利用上述引物及探针检测牛分枝杆菌的方法，包括以下步骤1)目的基因的扩增以牛分枝杆菌基因组DNA为模板，进行PCR反应，其中，PCR上游引物为 5，-ATCGTGAATCGTCGAGTGATG-3，，下游引物为 5，-ACCCAGAAGGCGAACAGA-3 ；回收 PCR 扩增产物；2)目的基因的克隆将步骤1)的目的基因连接在PGEM-T easy载体上并转化至大肠杆菌感受态细胞， 筛选阳性转化子，进行PCR检测并测序，提取阳性重组质粒，计算重组质粒的拷贝数；3) Taqman荧光定量PCR检测以阳性重组质粒DNA为模板，利用引物及探针，其中，上游引物为 5，-TGAAGTAGTAATGTGCGAGCTGAG-3，；下游引物为 5，-CGTTGTAGGCCACTCCAAGAG-3，；探针为 5，-JOE-CGCTTCTGCACGACTACGGCTTGTATGA-Eclipse-3‘,进行 Taqman 荧光定量 PCR 检测。前述的方法，其中Taqman荧光定量PCR检测的退火温度为50. 5°C。借由上述技术方案，本发明至少具有下列优点及有益效果(1)本发明应用blast对测序后的序列进行了同源性分析，其扩增序列与原序列完全一致，通过琼脂糖凝胶电泳检测扩增产物，其扩增的片段大小与预期大小一致，说明所扩增的片段为目的片段，可以用于对牛分支杆菌和结核分支杆菌的检测，用含有目的片段的质粒做标准质粒，并且通过计算得出其拷贝数，进行准确定量，提高了建立牛分支杆菌检测方法的准确性。(2)本发明根据对牛分枝杆菌的高度特异性，建立了可以简便快速、准确检测牛分支杆菌的荧光定量PCR检测方法，有利于区分牛分枝杆菌和其他分枝杆菌，尤其是牛分枝杆菌和结核分枝杆菌的区分，对人结核病和牛结核病的防控和治疗、牛结核病的临床检测及各种疫苗的研究具有重要意义。
图1为本发明牛分枝杆菌基因组DNA PCR扩增电泳结果，其中1为阴性对照，2为目的条带；图2为本发明不同退火温度与荧光信号强度关系曲线；图3为本发明不同Mg2+浓度与荧光信号强度关系曲线；图4为本发明不同浓度的引物和探针与荧光信号强度关系曲线；图5为本发明不同浓度的rTaq酶与荧光信号强度关系曲线；图6为本发明使用PCR Mix时不同退火温度与荧光信号强度关系曲线；图7为本发明使用PCR Mix时不同浓度的引物和探针与荧光信号强度关系曲线；图8为本发明使用单混PCR试剂时229bp标准质粒的扩增曲线；图9为本发明使用单混PCR试剂时229bp标准质粒的标准曲线；图10为本发明使用PCR Mix时229bp标准质粒的扩增曲线；图11为本发明使用PCR Mix时229bp标准质粒的标准曲线；图12为使用本发明探针检测牛分枝杆菌特异性实验结果曲线。
具体实施例方式以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。实施例1材料与方法1. 1实验材料1. 1. 1原料及试剂牛分枝杆菌由中国检验检疫科学研究院提供。结核分支杆菌(M. tuberculosis) H37Rv标准株，结核分支杆菌分离株、BCG、禽分支杆菌(M. avium)，偶发分支杆菌 (M. fortuit um)，胃分支杆菌(M. gastri)，龟分支杆菌、副结核分支杆菌、堪萨斯分支杆菌、 金黄色葡萄球菌、胞内分支杆菌的DNA核酸样品、灭活牛分支杆菌标准株菌液由武汉华中农业大学提供。大肠杆菌(E. coli)菌种DH5aPGEM-T easy 载体Pfu DNA 聚合酶T4 DNA 连接酶IQ supermixPlasmid mini kit IGel extraction kitDL 2000 makerdNTP (IOmM)
北京全式金生物技术有限公司美国Promega公司美国Promega公司美国Promega公司美国BIO-RAD公司美国Omega公司美国Omega公司宝生物工程(大连)有限公司美莱博医学科技有限公司
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Taq酶美莱博医学科技有限公司
1. 1. 2仪器
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1. 2方法
1.2. 1引物的设计与合成
根据GenBank中牛分支杆菌基因组独特的229bp序列(GenBankAccession No :AJ003103)，应用I^rimer premer5. 0软件设计引物和探针，使引物退火温度在55_65°C、GC含
量40-60%，产物大小在100-250bp之间，引物的3’端避免使用碱基A、避免出现3个以上连续相同的碱基，探针位置尽可能地靠近上游引物，探针长度20-30bp，Tm值65-70°C，GC含量40-70%，探针5’端避免使用碱基G，碱基C的含量要高于G，设计好的引物和探针满足这些设计原则后，使用BLAST进行核实，确认各引物及探针的特异性。引物由上海英骏生物技术有限公司合成。①229bp序列传统PCR引物上游引物5，-ATCGTGAATCGTCGAGTGATG-3，下游引物5，-ACCCAGAAGGCGAACAGA-3，扩增产物片段大小752bp②229bp序列荧光定量PCR引物和探针上游引物5，-TGAAGTAGTAATGTGCGAGCTGAG-3，下游引物5，-CGTTGTAGGCCACTCCAAGAG-3，探针5，-JOE-CGCTTCTGCACGACTACGGCTTGTATGA-Eclipse-3‘扩增产物片段大小145bp1. 2. 2标准质粒的构建1.2. 2. 1目的基因的扩增以牛分枝杆菌基因组DNA为模板，用传统PCR引物，扩增目的片段。反应体系为50 μ L，在0.2ml PCR反应管中加入以下试剂:试剂加样量(μ L)牛分枝杆菌基因组DNA1Pfu DNA聚合酶缓冲液5dNTP(2. 5mmol/L)4上游引物(10mmol/L)1下游引物(10mmol/L)1Pfu DNA 聚合酶1灭菌去离子水37混勻后放入PCR扩增仪进行扩增，反应程序如下1. 95°C预变性 5min
2.95 °C 变性 Imin 、 3.56°C退火Imin [35个循环 4.72 °C 延伸 Imin ^5. 72°C延伸 IOmin反应结束后，产物经1 %的琼脂糖凝胶电泳鉴定片段大小，与DNAMarker比较，如果与引物所限定的目的片段大小一致，则可进行后续实验。1. 2. 2. 2PCR 产物的回收用OMEGA公司的Gel extraction kit对传统PCR产物进行切胶回收，步骤如下(1)将PCR产物进行0. 8%的琼脂糖凝胶电泳；(2)在紫外透照台上将目的片段快速切下，放入已经称重的两个1.5mL Eppendorf 管中，然后称重，得出胶块的重量；(3)根据胶重按每毫克加一微升的量加入结合缓冲液，放55-60°C金属浴中加热直至胶完全溶解，期间每隔2-;3min振荡混合，使之充分融化；(4)吸取200 μ L Buffer GPS平衡缓冲液至装有Hibind DNA结合柱的2mL收集管，室温放置3-5min，室温下12000xg离心aiiin，弃掉收集管中滤液，将柱子重新装回收集管；(5)将溶胶转入结合柱中，室温下IOOOOxg离心Imin ；(6)弃掉滤液，向结合柱加入300 μ L结合缓冲液，IOOOOxg离心Imin ；(7)弃掉滤液，向结合柱中加入700 μ L SPff洗涤缓冲液(含无水乙醇)，IOOOOxg 离心Imin ；(8)弃掉滤液，重复(7) —次；(9)弃掉滤液，13000xg离心2min，将液体甩干。(10)将结合柱转移至一新的1. 5ml Eppendorf管中，加入30 μ L ddH20或洗脱缓冲液于结合柱中，室温静置2min，13000xg离心lmin，弃掉结合柱，管中为回收的DNA片段。(11)取2μ L回收的DNA，用微量分光光度计测定其浓度和纯度，剩余DNA置于-20°C保存备用。
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1.2.2.3目的基因的克隆(1)连接将切胶回收目的片段连接在PGEM-T easy载体上，依次加入以下试剂，反应体系
(10 μ L)如下试剂加样量(μυ目的片段32 X快速连接缓冲液5PGEM-T Easy 载体1T4 DNA 连接酶1置于4°C恒温水浴箱连接过夜。(2)连接产物的转化①将感受态细胞从-80°C冰箱中取出之后置于冰上融化；②取3yL连接产物加入融化后的感受态细胞中，轻轻混勻；③冰浴30min;④42°C水浴热激90s，再在冰上冷激anin ；⑤加入80 μ L无抗性的经37 °C预热的LB液体培养基，37 °C 150rpm震荡培养 90min ；⑥3000rmp离心2min，弃掉部分上清，留下约100 μ L液体，然后重悬，加入7 μ L IPTG和40 μ L X-gal，用涂布棒涂布于有氨苄青霉素抗性的LB固体培养基平板上，置于 37°C恒温培养箱中倒置培养约12-16小时，然后进行蓝白斑鉴定。1.2. 2. 4重组质粒的筛选与鉴定①挑取白斑于5mL含有氨苄青霉素抗性的LB液体培养基，37°C 200rmp振荡培养 12-16个小时；②以培养好的菌液为模板进行PCR鉴定；③将PCR测定为阳性的菌液进行保菌，取700 μ L菌液加300 μ L灭菌甘油于1. 5mL Eppendorf管中，混勻，标记后放入_80°C冰箱中保存待用；④将PCR鉴定阳性的菌液进行测序，测序由北京诺赛基因组研究中心有限公司完成。1. 2. 2. 5重组质粒的提取将测序阳性的菌液用OMEGA公司的Plasmid mini kit I进行阳性质粒的提取，步骤如下(1)取测序阳性的保存菌液200 μ L于3mL有氨苄青霉素抗性的LB液体培养基中， 370C 200rmp振荡培养12-16个小时；(2)取 2mL 菌液于 1. 5mL Eppendorf 管中，室温下 IOOOOxg 离心 Imin ；(3)弃掉上层培养液，向细菌沉淀中加入250 μ L Solution I (含RNase Α)，涡旋混勻；。(4)加入250 μ L Solution II，上下颠倒4-6次，轻轻混勻，室温下温育2min ；(5)加350yL Solution III，轻轻混勻至出现白色絮状物，然后室温下13000xg 离心IOmin ；
(6)小心转移上清液到一个2mL的装有DNA结合柱的收集管中(DNA结合柱的平衡方法同切胶回收)，室温下IOOOOxg离心Imin ；(7)弃滤液，加500 μ L缓冲液HB, IOOOOxg离心Imin,除去蛋白；(8)弃滤液，加700 μ L DNA洗涤缓冲液(含无水乙醇)，IOOOOxg离心Imin ；(9)弃滤液，重复(8) 一次；(10)弃滤液，13000xg离心2min，将液体甩干；(11)将结合柱转移至一新的1.5ml Eppendorf管中，加入30 μ L ddH20或洗脱缓冲液于结合柱中，室温静置2min，13000xg离心lmin，弃掉结合柱，管中为提取的质粒DNA， 置于-20°C保存；(12)取2μ L质粒DNA，用微量分光光度计测定其浓度和纯度。1. 2. 2. 6质粒拷贝数的计算和倍比稀释通过测出的阳性质粒浓度，计算重组质粒的拷贝数。公式如下拷贝数=质粒浓度(g/μ L) X加样体积X阿弗加德罗常数/(质粒总长度X — 个碱基对的平均分子量)，阿弗加德罗常数(每mol的微粒数)是6. 02 X IO23拷贝/mol，一个碱基对的平均分子量是660道尔顿，最后根据拷贝数将质粒进行10倍的倍比稀释。1. 3FQ-PCR方法的建立取1 μ L提取的阳性质粒DNA作为模板，用序列荧光定量PCR引物和探针， 按照如下体系配置，设阴性对照时以无菌水代替质粒DNA模板进行。使用单混PCR试剂时的反应体系05 μ L)
成分体积(UL)
10 X PCR 缓冲液(Mg2+ free)2. 5
MgCl2 (25mM)2
dNTP(IOmM)0. 5
rTaq 酶0. 5
上游引物(10 μ M)1
下游引物( ο μ Μ)1
探针(10 μ Μ)1
模板DNA1
(MH2O15. 5
使用PCR Mix时的反应体系(25 μ L)
成分体积(UL)
2 X PCR Taq Mix12. 5
上游引物(10 μ M)1
下游引物( ο μ Μ)1
探针(10 μ Μ)1
模板DNA1
(MH2O8. 5
反应液配好后，瞬时离心，将样品管放入Bio-Rad公司的miniopticonOpticonMonitor 3软件进行程序设置及结果分析，PCR反应程序如下
第一步95°C预变性5min
权利要求
1.一种牛分枝杆菌Taqman荧光定量PCR检测用引物及探针，其中，上游引物为5’ -TGAAGTAGTAATGTGCGAGCTGAG-3，；下游引物为5，-CGTTGTAGGCCACTCCAAGAG-3，；以及探针为5，-J0E-CGCTTCTGCACGACTACGGCTTGTATGA-Eclipse-3，。
2.一种含权利要求1所述引物及探针的检测试剂盒。
3.一种利用权利要求1所述的引物及探针检测牛分枝杆菌的方法，其特征在于，包括以下步骤1)目的基因的扩增以牛分枝杆菌基因组DNA为模板，进行PCR反应，其中，PCR上游引物为 5‘-ATCGTGAATCGTCGAGTGATG-3‘,下游引物为 5，-ACCCAGAAGGCGAACAGA-3，，回收 PCR 扩增产物；2)目的基因的克隆将步骤1)的目的基因连接在PGEM-T easy载体上并转化至大肠杆菌感受态细胞，筛选阳性转化子，进行PCR检测并测序，提取阳性重组质粒，计算重组质粒的拷贝数；3)Taqman荧光定量PCR检测以阳性重组质粒DNA为模板，利用权利要求1所述引物及探针，进行Taqman荧光定量 PCR检测。
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，其中Taqman荧光定量PCR检测的退火温度为 50. 5°C。
全文摘要
本发明提供一种牛分枝杆菌Taqman荧光定量PCR检测方法，根据229bp对牛分枝杆菌的高度特异性，设计引物及探针，其中，上游引物为5’-TGAAGTAGTAATGTGCGAGCTGAG-3’；下游引物为5’-CGTTGTAGGCCACTCCAAGAG-3’；探针为5’-JOE-CGCTTCTGCACGACTACGGCTTGTATGA-Eclipse-3’。本发明建立了可以简便快速、准确检测牛分支杆菌的荧光定量PCR检测方法，有利于区分牛分枝杆菌和其他分枝杆菌，尤其是牛分枝杆菌和结核分枝杆菌的区分，对人结核病和牛结核病的防控和治疗、牛结核病的临床检测及各种疫苗的研究具有重要意义。
文档编号C12Q1/06GK102162007SQ201010113248
公开日2011年8月24日 申请日期2010年2月23日 优先权日2010年2月23日
发明者刘建, 吴绍强, 林祥梅, 梅琳, 王彩霞, 王慧煜, 贾广乐, 韩雪清 申请人:中国检验检疫科学研究院