专利名称：一种合成海藻糖的融合蛋白及其在培育矮化草坪草中的应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种合成海藻糖的融合蛋白及其在培育矮化草坪草中的应用。
背景技术：
低矮整齐的草坪在美化人们的生活环境方面起着重要作用，为了保持草坪草低 矮，目前人们普遍采用定期修剪的方式，造成了人力和资源的浪费，因此有必要培育矮生草 坪草新品种。近期，分子生物学技术的发展为分子育种手段培育矮生草坪草新品种提供了 技术平台。海藻糖是一种由两个葡萄糖分子以α，α-1，1糖苷键相连而成的非还原二糖， 在生物界中广泛存在，它能清除有害的氧自由基，保护蛋白和磷脂膜抗氧化胁迫，维持细 胞膜在高渗透压下的稳定状态，阻止细胞内膜变性，抑制膜融合、降低相变温度、保持膜 的流动性等等。因此人们通过转基因方法在植物中积累海藻糖以培育耐逆植物新品种。 同时为了消除海藻糖的前体6-磷酸-海藻糖在植物体内的积累而影响植物的生理代谢 禾口生长(Trehalose Mediated Growth Inhibition of Arabidopsis SeedlingsIs Due to Trehalose-6-Phosphate Accumulation. Plant Physiology,2004，135 :879-890)。 人们将合成海藻糖的TPS和TPP基因融合后转入植株以得到生长不受影响的耐逆植 株。如将大肠杆菌的TPS和TPP融合基因转化水稻，成功获得了正常生长的耐逆的转基 因 /K 禾 (Expression of a bifunctional fusion of the Escherichiacoli genes for trehalose-6-phosphate synthase and trehalose-6-phosphate phosphatase in transgenic rice ρlants increases trehalose accumulation and abioticstress tolerance without stunting growth. Plant physiology,2003，131 (2) :516-524)将融 合的酵母TPS和TPP基因转入烟草，或是将TPS基因导入叶绿体，或是逆境诱导表达TPS 都能得到了正常生长的耐逆转基因烟草等等。(Improved droughttolerance without undesired side effects in transgenic plants producingtrehalose Plant Mol. Biol.2007,64 :371-386)但是，在草坪草的转基因研究中发现，将TPS和TPP融合基因转化草坪草，能得到 矮生的转基因植株，为用分子生物学手段培育矮生草坪草新品种提供了可能。
发明内容
本发明提供了一种培育矮生草坪草的方法及其所用的融合蛋白。本发明提供了一个融合蛋白。该融合蛋白包括叶绿体转运肽和磷酸海藻糖合成酶，所述叶绿体转运肽位于所述 融合蛋白的氨基端，所述磷酸海藻糖合成酶位于所述叶绿体转运肽的羧基端。所述融合蛋白还可包括磷酸海藻糖磷酸酶，所述磷酸海藻糖磷酸酶位于所述磷酸 海藻糖合成酶的羧基端。
所述叶绿体转运肽可来自双子叶植物或单子叶植物；如来自拟南芥，其序列为序 列表中的序列5，编码基因为序列表的序列6。所述磷酸海藻糖合成酶和磷酸海藻糖磷酸酶来自耻垢分支杆菌。a)由序列表中序列2所示的氨基酸序列组成的蛋白质；b)将序列2的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添 加且具有相同功能的由序列2衍生的蛋白质。所述融合蛋白中，在序列2自氨基末端第582至586位氨基酸残基为连接肽 (GSGSG)，编码序列为序列表的序列3自5’端第1772至1786位核苷酸(GGATCAGGTTCTGGA)。上述a)、b)中的融合蛋白可人工合成，也可先合成其编码基因，再进行生物表达 得到。上述a)、b)中的融合蛋白的编码基因可通过将序列表中序列1自5'端第四至2536 位碱基所示的DNA序列中缺失一个或几个氨基酸残基的密码子，和/或进行一个或几个碱 基对的错义突变得到。所述融合蛋白的编码基因也属于本发明的保护范围。所述编码基因具体可为如下1)至3)的DNA分子之一1)其编码序列是序列表中序列1自5'末端第四-2536位脱氧核糖核苷酸所示的 DNA分子；2)在严格条件下与1)限定的DNA序列杂交且编码所述蛋白的DNA分子；3)与2)限定的DNA序列具有90%以上同源性，且编码相同功能蛋白质的DNA分子。上述严格条件可为在5 X SSC，5 X Denhardt，S溶液，0. 05mg/mL鱼精DNA，50 %去离 子甲酰胺溶液中，在65°C下杂交，然后在室温用2XSSC，0. 1% SDS，在42°C用0. 25 X SSC, 0. 1% SDS各洗膜15分钟两次。含有所述基因的表达盒、重组表达载体、细胞系或重组菌均属本发明的保护范围。可用现有的植物表达载体构建含有所述融合蛋白编码基因的重组表达载体。所述植物表达载体包括双元农杆菌载体和可用于植物微弹轰击的载体等。所述植 物表达载体还可包含外源基因的3’端非翻译区域，即包含聚腺苷酸信号和任何其它参与 mRNA加工或基因表达的DNA片段。所述聚腺苷酸信号可引导聚腺苷酸加入到mRNA前体的 3’端，如农杆菌冠瘿瘤诱导(Ti)质粒基因(如胭脂合成酶Nos基因)、植物基因(如大豆 贮存蛋白基因)3’端转录的非翻译区均具有类似功能。使用所述融合蛋白编码基因构建重组植物表达载体时，在其转录起始核苷酸前可 加上任何一种增强型启动子或组成型启动子，如花椰菜花叶病毒(CAMV) 35S启动子、玉米 的泛素启动子⑴biquitin)，它们可单独使用或与其它植物启动子结合使用；此外，使用本 发明的融合的蛋白编码基因构建植物表达载体时，还可使用增强子，包括翻译增强子或转 录增强子，这些增强子区域可以是ATG起始密码子或邻接区域起始密码子等，但必需与编 码序列的阅读框相同，以保证整个序列的正确翻译。所述翻译控制信号和起始密码子的来 源是广泛的，可以是天然的，也可以是合成的。翻译起始区域可以来自转录起始区域或结构 基因。为了便于对转基因植物细胞或植物进行鉴定及筛选，可对所用植物表达载体进行 加工，如加入可在植物中表达的编码可产生颜色变化的酶或发光化合物的基因(GUS基因、萤光素酶基因等)、具有抗性的抗生素标记物(庆大霉素标记物、卡那霉素标记物等)或是 抗化学试剂标记基因(如抗除莠剂基因)等。从转基因植物的安全性考虑，可不加任何选 择性标记基因，直接以逆境筛选转化植株。所述表达载体具体可为如图1所示的表达载体。本发明还提供了一种培育矮生草坪草的方法，是将这些DNA片段导入植物细胞， 得到矮生草坪草。可通过任何常规方法将所述DNA片段导入植物细胞，如通过如图1所示的表达载 体将所述DNA片段导入植物细胞，得到矮生草坪草。本发明提供了一个融合蛋白，该融合蛋白包括了叶绿体转运肽和磷酸海藻糖合成 酶，叶绿体转运肽位于融合蛋白的氨基端，磷酸海藻糖合成酶位于叶绿体转运肽的羧基端。 融合蛋白也包括磷酸海藻糖磷酸酶，磷酸海藻糖磷酸酶位于磷酸海藻糖合成酶的羧基端。 磷酸海藻糖合成酶和磷酸海藻糖磷酸酶来自耻垢分枝杆菌。将本发明的融合蛋白的编码基 因导入草坪草中，可以得到矮生草坪草。本发明的融合蛋白及其编码基因对培育矮生的草 坪草有显著作用。应用本发明方法培育矮生草坪草可以节省人力、节约资源，有较大的应用 前景。以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。
图 1 为质粒 pCAMBIA2300: :mTPSP 的结构2为转pCAMBIA2300: :mTPSP草坪草的PCR结果电泳鉴定图3为转pCAMBIA2300: :mTPSP草坪草的表型
具体实施例方式细菌基因组DNA的提取采用SDS裂解法，植物基因组DNA的提取采用CTAB法，具 Sambrook and Russell “ Molecular Cloning :A Laboratory Manual" (2001)；
Cloning :A Practical Approach, " Volumes I and II" (D. N. Glover, ed. ,1985)。细胞总RNA的提取采用TRIZOL RNA提取液(鼎国生物技术公司)，并按供应商提 供的方案进行总RNA的提取。将得到的总RNA用DNase酶(Prmega，America)消化，以去除 残存的DNA，以分光光度计(Eppendorf公司，德国)检测样品中总RNA的浓度。取5 μ g总 RNA，用反转录试剂盒(宝生物工程(大连)有限公司)按试剂盒的方法进行反转录，以得 到的cDNA片段为模板进行如下所示的PCR扩增反应。除非有特殊说明，25 μ 1 PCR反应体系为0. 1 μ g模板DNA、1. 5mM MgCl2, 20mMTri s-HCl (pH8. 4)、50mM KCl、0. 2mM dNTP 混合物、0. 2μΜ 正向引物和 0. 2μΜ 反向引 物，以及IU的pfu高保真DNA聚合酶(上海申能博彩生物技术公司)。按照下列方案在 PCR-热循环仪(Eppendorf公司，德国)中进行PCR循环反应94°C预变性4分钟，94°C变 性30秒，按各特定温度复性，复性时间30秒，72°C延伸，延伸时间各反应特定，30个循环，最 后72 °C、10分钟。本发明中所用的引物均为上海生工公司合成。本发明中所用的引物如下
Pl :5’ -TCTCCGGAGAGTGGCCACGAA-3’P2 :5’ -GAAGCTCCCGGAGTCGGACTCG-3’ ；P3 :5’ -TCAGTCACACAAAGAGTAAAGAAGA-3’ ；P4 :5，-GGAATCGGTAAGGTCAGGAAGGT-3‘；P7 :5’ -CGTGGCCACTCTCCGGAGAGGAATCGGTAAGGTCAG-3，；P8 :5’ -CCTTCCTGACCTTACCGATTCCTCTCCGGAGAGTGGCCACGAAAC-3，；Pll :5’ -CGCCGTGCGCCGCGGCGCATAGTCACGCCGGCTCATATTAGG-3，；P12 :5’ -TAAGGGCAGCCCATACAAATG-3’ ；P13 :5， -GCCGGTGAATTCGCTGAGCA-3，；P14 :5’ -ACTCATTCCAGAACCTGATCCGAAGCTCCCGGAGTCGGACTC-3，；P15 :5’ -TTCGGATCAGGTTCTGGAATGAGTCTTTCGGGGGATCTGCAG-3，；下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。实施例1、一、磷酸海藻糖合成酶基因的克隆耻垢分枝杆菌基因组约7Mb，环状，全基因组序列测定已完成(Genbank AccessionNC_008596)。其中磷酸海藻糖合成酶基因长1512bp，编码503个氨基酸 (GenbankAccession ABK71484)。参照生物学模式菌株耻垢分枝杆菌(Mycobacterium smegmatis)的序列人工合成 1506bp的片段的磷酸海藻糖合成酶基因(三博远志)，测序表明该片段为不含起始密码子 和终止密码子的磷酸海藻糖合成酶基因序列，与基因库中序列吻合，将该磷酸海藻糖合成 酶基因片段命名为TPS(其序列是自序列1的5'末端第沈6-1771位核苷酸)。2、磷酸海藻糖磷酸酶基因的克隆耻垢分枝杆菌(Mycobacterium smegmatis)的磷酸海藻糖磷酸酶基因为 长 750bp，编码 249 个氨基酸(Nucleotide Accession CP000480, Protein Accession ABK73322)的 DNA 片段。参照生物学模式菌株耻垢分枝杆菌(MyccAacterium smegmatis)的序列人工合 成750bp的片段的磷酸海藻糖磷酸酶基因(三博远志)，测序表明，该片段为磷酸海藻糖 磷酸酶基因片段，与基因库中序列吻合，将该扩增到的磷酸海藻糖磷酸酶基因片段命名为 TPP (其序列是自序列3的5'末端第1787-2536位核苷酸)。二、拟南芥RuBisCO基因叶绿体转运肽DNA片段和烟草RuBisCO基因转录终止区 DNA片段的获得1、拟南芥RuBisCO基因叶绿体转运肽DNA片段的获得根据拟南芥RuBisCO基因(Genbank Accession NM_202369)序列分析，合成引物 P3和P4，以拟南芥总RNA反转录得到的cDNA为模板，通过55°C复性30秒，72°C延伸30秒 PCR反应扩增得到的DNA片段，测序结果表明该片段为拟南芥RuBisCO基因N端编码 转运肽的DNA序列，将该片段命名为AtTP(其序列是自序列1的5'末端第1-265位核苷 酸)。2、烟草RuBisCO基因转录终止区DNA片段的获得合成引物Pll和P12，以烟草基因组DNA为模板，通过55°C复性30秒，72°C、30秒PCR反应扩增得到407bp的DNA片段.测序结果表明，该片段含有烟草RuBisCO基因的3， 终止区和22bp的TPP3’端序列，将该片段命名为NtTrbcS (其序列是自序列3的5'末端第 2515至四21位核苷酸)。三、融合基因的获得合成PCR反应融合引物P7和P8。以P3、P7为引物，AtTP为模板，通过55°C复性 30秒，72°C、30秒PCR扩增得到DNA片段；同时以P8、P2为引物，TPS为模板，通过 55°C复性30秒，72°C、2分钟PCR扩增得到1528bp DNA片段。将两片段回收，分别取0. 1 μ g 混合，作为模板，在不加入引物的条件下，65°C复性30秒，72°C延伸2分钟，反应5个循环， 然后加入引物P3和P13，56°C复性30秒，72°C延伸2分钟，反应30个循环，得到1510bp的 DNA片段，将该片段命名为dTPSPl，连接到质粒pBluescript II KS(-)的SmaI位点，并测 序。序列分析表明dTPSPl包含了 TPS基因片段，并融合了拟南芥RuBisCO基因N端编码转 运肽的DNA片段，将该质粒命名为pBS: TPSPl。0.01 yg TPS为模板，Pl和P14为引物，65°C复性，72°C延伸2分钟，反应25个循 环，得到1527bp的DNA片段。同时分别取0. 1 μ g TPP和Nt1TrbcS,混合作为模板，在不加 引物的条件下，65°C复性30秒，72°C延伸2分钟，反应5个循环，然后加入引物P15和P12， 56°C复性，72°C延伸2分钟，反应30个循环，得到1153bp的DNA片段。将上述得到的1527bp 和1153bp PCR片段分别回收纯化，取0. 1μ g混合，在不加引物的条件下，65°C复性，72°C延 伸2分钟，反应5个循环，然后加入引物P16和P12，60°C复性30秒，72°C延伸2分钟，反应 30个循环，得到1740bp的DNA片段，该片段被命名位dTPSP2，被连接到质粒pBluescript IIKS(-)的Hinc II位点处，并测序。序列分析表明dTPSP2包含了 TPS基因片段靠3’端的 一部分，同时融合了全长的TPP基因片段以及烟草RuBisCO基因终止区的DNA片段，该质粒 被命名为pBS::TPSP2。Mlu I-Kpn I双酶切pBS: TPSP2，回收1. 71Λ的片段，插入到经过同样酶切的 pBS: TPSPl质粒上，重组质粒被命名为pBS: :dTPSP。dTPSP包含了完整的TPS基因片段(序列3第沈6_1771位核苷酸)，TPP基因 片段(序列3第1787-2536位核苷酸)，TPS和TPP基因间的连接肽DNA序列(序列3第 1772-1786位核苷酸)同时在5，端融合了拟南芥RuBisCO基因N端编码转运肽的DNA片 段(序列3第1-265位核苷酸)，以及3，端融合了 RuBisCO基因终止区的DNA片段(序列 3第2547-2921位核苷酸)。四、融合基因dTPSP植物表达载体的构建BstXI 和 XhoI 酶切质粒 pCAMBIA2300 (Genbank Accession Number AF234315)， 回收787bp的35S启动子片段，将787bp的35S启动子片段插入pUC18 (GenbankAccession Number L09136)的SphI和Mil酶切位点间，得到重组质粒pUC18: :35S。随后SpeI和KpnI 酶切质粒pBS: dTPSP，得到约3000bp的含有dTPSP的片段，将该片段插入到)(bal和KpnI 酶切的pUC18: :35S上，得到重组质粒pUC18: :35S-dTPSP。HindIII 和 KpnI 酶切 pUC18 35S_dTPSP，回收约 3. 8kb 的 35S-TPSP 片段，插入到 经过同样酶切的PCAMBIA2300上，得到重组质粒pCAMBIA2300 dTPSP (图4)。包含完整的 TPS和TPP融合基因并在其5 ‘端融合了拟南芥RuBisCO基因N端编码转运肽的dTPSPDNA 片段受到35S启动子控制，终止子为烟草RuBisCO基因终止区。
该质粒pCAMBIA2300: :dTPSP 转入到农杆菌 LBA4404 中，得到菌株 LBA4404/TPSP, 用于植物组织的侵染。同时以pCAMBIA2300质粒做为阴性对照，转入到农杆菌LBA4404中，得到菌株 LBA4404/2300o五、草坪草转化1、愈伤组织诱导选取成熟饱满的草坪草早熟禾的种子，室温下在蒸馏水中浸泡4小时后剥去种 皮，再放入蒸馏水中继续浸泡过夜。浸泡好的去皮种子先用70%酒精过两遍，再用30%次 氯酸钠消毒30分钟，无菌水冲洗三遍。在无菌条件下，将种子接入愈伤组织诱导培养基。接 种密度100粒/皿，平皿直径75mm。每升愈伤组织诱导培养基的组成如下在MS基本培养基的基础上加入生长素类 物质2，4-二氯苯氧乙酸(2，4-0，5丨811^，美国)&^，6-苄氨基嘌呤(Sigma，美国)0. lmg，pH 5. 8。2、愈伤组织的农杆菌侵染将愈伤组织置于经过重悬静置菌液浓度为0D600 = 0. 1的LBA4404根农杆菌菌液 中侵染10分钟，倒去菌液，在无菌滤纸上将愈伤晾干(约5分钟)，置于覆有一层无菌滤纸 的共培养培养基，25°C暗培养3天。所用共培养培养基为步骤-的愈伤组织诱导培养基。3、抗性愈伤组织的筛选共培养后用筛选培养基对愈伤组织进行筛选，每三星期转皿一次，约两个月后上 分化培养基。每升抗性愈伤组织筛选培养基的组成如下在MS基本培养基的基础上加入2， 4-二氯苯氧乙酸(2,4-D, Sigma，美国)ang，6-苄氨基嘌呤(Sigma，美国)0. lmg, G418(青 岛生工)20mg-100mg，羧苄青霉素(北京欣经科生物技术有限公司)250mg，pH5. 8。4、抗性愈伤组织的分化将经过筛选的直径达到0. 5cm以上的抗性愈伤组织放到分化筛选培养基上进行 分化，并于25°C下光照培养(1 光/ 暗)。10天后有绿色小芽出现，约两周后即可生长 为幼苗。每升分化培养基的组成如下在MS基本培养基的基础上加入6-苄氨基嘌呤 (Sigma，美国)0. 2mg,激动素(Sigma，美国)0. 2mg, G418 (青岛生工)50mg, ρΗ5· 8。5、转化植株的生根将已分化的幼苗接种于生根培养基，生根。生根培养基为MS基本培养基。六、PCR鉴定取生根培养基上的10棵转pCAMBIA2300 dTPSP苗叶片用CTAB法提取植物DNA， 用引物P3和P13进行PCR反应验证，结果得到与预期1510bp相当的条带(如图2所示，图中 最左列为marker，左第2列为质粒阳性对照，最右列为阴性对照，其余为转pBI121 dTPSP 基因植物DNA)可见转基因阳性率接近100%。七、表型观察 将同时转化的转pCAMBIA2300 dTPSP和转pCAMBIA2300苗载入沙盆室内培育一个半月后可见转pCAMBIA2300::dTPSP的草坪草明显矮生。如图3所示，左为转 PCAMBIA2300: :dTPSP 植株，右为转 pCAMBIA2300 植株。将转基因苗及对照苗50厘米间隔同时种于田间，正常施肥浇水不予修剪，第二年 五月分别测量植株的高度，数据如下
权利要求
1.一种融合蛋白，包括含叶绿体转运肽的磷酸海藻糖合成酶和磷酸海藻糖磷酸酶，所 述叶绿体转运肽位于所述磷酸海藻糖合成酶的氨基端，所述磷酸海藻糖合成酶位于所述叶 绿体转运肽的羧基端。所述磷酸海藻糖磷酸酶位于所述磷酸海藻糖合成酶的羧基端。
2.如权利要求1所述的融合蛋白，其特征在于所述叶绿体转运肽来自双子叶植物或 单子叶植物；所述磷酸海藻糖合成酶和磷酸海藻糖磷酸酶来自耻垢分支杆菌。
3.如权利要求1所述的融合蛋白，其特征在于所述叶绿体转运肽来自拟南芥，其序列 为序列表的序列4。
4.如权利要求1所述的融合蛋白，其特征在于所述融合蛋白为下述a)、b)的蛋白质a)由序列表中序列2所示的氨基酸序列组成的蛋白质；b)将序列2的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且 具有相同功能的由序列2衍生的蛋白质。
5.权利要求1-4中任一所述融合蛋白，其特征在于其编码基因为如下1)至3)的DNA分子之一1)其编码序列是序列表中序列1自5'末端第四-2536位脱氧核糖核苷酸所示的DNA 分子；2)在严格条件下与1)限定的DNA序列杂交且编码所述蛋白的DNA分子；3)与1)限定的DNA序列具有90%以上同源性，且编码相同功能蛋白质的DNA分子。
6.含有权利要求5所述基因的表达盒、重组表达载体、细胞系或重组菌；所述表达载体 为如图1所示的表达载体。
7.一种培育矮生草坪草的方法，是将权利要求1至4中所述融合蛋白的编码基因导入 植物细胞，得到矮生草坪草。所述草坪草可以是早熟禾。
8.如权利要求7所述的方法，其特征在于所述编码基因通过如图1所示的表达载体 导入植物细胞。
全文摘要
本发明公开了一种应用一种融合蛋白培育矮生草坪草的方法。本发明提供的融合蛋白，包括含叶绿体转运肽的磷酸海藻糖合成酶，叶绿体转运肽位于融合蛋白的氨基端，磷酸海藻糖合成酶位于叶绿体转运肽的羧基端。融合蛋白还可包括磷酸海藻糖磷酸酶，磷酸海藻糖磷酸酶位于磷酸海藻糖合成酶的羧基端。将本发明的融合蛋白的编码基因导入植物中，可以得到矮生草坪草。本发明的融合蛋白及其编码基因可用于培育美观少修剪的草坪草新品种。
文档编号C12N15/63GK102146139SQ201010112498
公开日2011年8月10日 申请日期2010年2月5日 优先权日2010年2月5日
发明者吴茜, 徐健勇, 李钦清, 温红雨, 赵建杰, 陈婉丽, 陈蕾 申请人:北京北方杰士生物科技有限责任公司