专利名称：甲鱼虹彩病毒的环介导等温扩增检测方法和试剂盒的制作方法
技术领域：
本发明涉及病毒的检测方法和检测试剂盒，特别是涉及甲鱼虹彩病毒(STIV)环 介导等温扩增(LAMP)检测方法和试剂盒。
背景技术：
虹彩病毒(Iridovirus)是一类对鱼类、两栖类和爬行类水生动物具有广泛感 染性的致病病原，由虹彩病毒所致疾病给世界水产养殖业造成了巨大的经济损失。近 年来，许多国家相继报道了在患病鱼、蛙和龟等水生经济动物中分离到虹彩病毒。虹 彩病毒科(Iridovirudae)分为5个属虹彩病毒属(Iridovirus)、绿虹彩病毒属 (Chloriridovirus)、娃病毒属(Ranavirus)禾口淋巴囊月中病毒属(Lymphocystivirus)、月中大 细胞病毒属(Megalocytivirus)(也称细胞肥大病毒属)。甲鱼虹彩病毒(STIV)又称中华鳖病毒，属于虹彩病毒科蛙病毒属病毒。病毒 呈典型的虹彩病毒形状，大小为直径120-160nm。病毒能在CO、CK、BF_2、EPC和FHM等 细胞株上增殖，但不能在CHSE、RU RTG-2、PG等细胞株中增殖。病毒的最适复制温度为 25-30°C，病毒对氯仿、酸性条件(pH3)、碱性条件(pHIO)以及高温(60°C，30min)敏感， IUDR(5-iodo-2-deoxyuridine)能抑制病毒的复制。病毒人工感染健康中华鳖，发病死亡率 超过 40% (Chenet al.，1999)。甲鱼虹彩病毒的诊断方法有细胞分离培养、电镜观察、免疫学方法、分子生物学 等方法，各有优缺点。细胞分离培养被认为是病毒分离鉴定的黄金法则，可靠性强但操作 时间较长电镜观察在水生动物的病毒鉴定中一直扮演着非常重要和直观的角色，通过对 感染病毒的细胞或组织(肝、脾、肾、脑等)电镜观察不但可以看到直接的包涵体和病毒的 形态特征，对病毒进行初步的分类和诊断，同时，还可以通过对不同感染阶段的连续电镜观 察，了解病毒在宿主组织里的增殖过程和增殖方式；免疫学方法包括中和实验、间接荧光抗 体试验(IFAT)和酶连免疫试验(ELISA)。分子生物学方法如PCR和实时荧光PCR目前被广 泛应用。环介导等温扩增(loop-mediated isothermal amplification, LAMP)技术 是日本学者Notomi等于2000年开发的一种新颖的恒温核酸扩增方法，其原理是针对 靶基因的6个区域，设计4条特异性引物，利用一种链置换DNA聚合酶-Bst (Bacillus stearothermophilus)DNA polymerase，在恒温63°C左右反应lh，即可完成核酸扩增反 应，通过直接观察反应产物的颜色可以进行结果判定。LAMP技术因其具有高特异性、高 效率和快速反应的特点，目前被广泛应用于动植物及人类病原体的检测。在水生生物的 病原检测方面，LAMP已经应用于检测迟钝爱德华氏菌(Edwardsiellaictaluri) (Yeh et al. ,2005)；对虾白斑综合征病毒(WSSV)；锦鲤疱疹病毒(KHV) (Gunimaladevi et al.， 2004)、虹彩病毒(RSIV)；传染性皮下及造血组织坏死病毒(IHHNV)、传染性造血器官坏死 病毒(IHNV) (Gunimaladevi etal.，2005)、病毒性出血性败血症病毒(VHSV) (Soliman and El-Matbouli，2006)；鲤春病毒血症病毒(SVCV) (Liu et al. ,2008 ；Shivappa et al.，2008)等。
发明内容
本发明的目的是针对现有技术的不足，提供一种甲鱼虹彩病毒(STIV)的环介导 等温扩增(LAMP)检测方法。本发明的另一目的在于提供一种甲鱼虹彩病毒(STIV)的检测试剂盒。为实现上述目的，本发明采用了以下技术方案本发明公开了一种甲鱼虹彩病毒(STIV)的环介导等温扩增(LAMP)检测方法，所 述方法包括利用特异性引物，以病毒核酸为模板进行环介导等温扩增反应，所述特异性引 物包括一对内引物和一对外引物，所述外引物分别含有kq ID No. 1和kq ID No. 2所示 的序列，Seq ID No. 1 正向外引物(F3):5，-CGTTTAGCGGCAACATTGG-3，；Seq ID No. 2 反向外引物(B3):5’ -TTTCTTTGCGGCC CTCTG-3’。所述内引物分别含有kq ID No. 3和kq ID No. 4所示的序列，Seq ID No. 3 正向内引物(FIP)5’ -TGGAAAAGTCTTCGGGCACCACGCAAGTCCACACTCCTCAG-3'；Seq ID No. 4:反向内引物(BIP)5 ’ -CTGTTTGAGATGGCCCTGGAGGTCTCGCTCTGGATGAGCATA-3’。所述环介导等温扩增反应的恒温温度为60°C 64°C，扩增反应的时间为 60min-120min。优选的，环介导等温扩增反应的恒温温度为63°C，反应的时间为60min。本发明进一步公开了一种甲鱼虹彩病毒(STIV)的检测试剂盒，所述试剂盒包括 含有Seq ID No. 1至Seq ID No. 4所示序列中至少一种的引物序列，Seq ID No. 1 5’ -CGTTTAGCGGCAACATTGG-3’Seq ID No. 2 5’ -TTTCTTTGCGGCC CTCTG-3，Seq ID No. 3 5’ -TGGAAAAGTCTTCGGGCACCACGCAAGTCCACACTCCTCAG-3'Seq ID No. 4 5’ -CTGTTTGAGATGGCCCTGGAGGTCTCGCTCTGGATGAGCATA-3，。在本发明具体的实施方式中，所述检测试剂盒用于环介导等温扩增反应，所述试 剂盒包括分别含有Seq ID No. 1和Seq ID No. 2所示序列一对外引物。优选的，所述检测试剂盒还包括分别含有kq ID No.ID No. 4所示序列 一对内引物。由于采用了以上技术方案，使本发明具备的有益效果在于本文建立了甲鱼虹彩病毒的环介导等温扩增检测技术，为甲鱼虹彩病毒的检测提 供快速、敏感、特异的检测方法，可以进行病毒的现场即时检测，为甲鱼健康养殖及国际贸易的发展提供技术支持。
图Ia为本发明实施例1中LAMP的反应温度优化实验结果图，左图中显示1_6为 绿色，7、8为橙色；1-8 反应温度分别为 59°C、60°C、6rC、62°C、63°C、64°C和 65°C ；M 为分子量对照 (从上到下分别为2000、1000、750、500、250和IOObp) ；8 阴性对照。图Ib为本发明实施例1中LAMP最佳反应时间的优化实验结果图，右图中3、4为 绿色，1、2为橙；1-4 反应时间分别为 30min，45min，60min，75min。图加为本发明实施例1中LAMP的特异性实验结果图，图中显示，6为较深绿色，5 为浅绿色，其余为橙色；1 为阴性对照；2-8 分别为 VNNV、VHSV, IPNV、TFV,9701 株、IHNV 和 PFRV。图2b为本发明实施例1中LAMP的特异性实验结果图，图中显示，2_5为浅绿色，其 余为橙色；1 为阴性对照；2-8 分别 BIV、TFV,9506 株、SSS0604、RSIV、LCDV 和 SGIV。图3a为本发明实施例1的LAMP灵敏度检测实验结果图，图中显示NC为橙色，其 余依稀释度为由深至浅的绿色；1-8 分别采用10倍系列稀释的病毒核酸作为模板图北为本发明实施例1采用PCR的灵敏度实验结果图；1为分子量标记(从上至下分别为2000、1000、750、500、250、IOObp) ；2-9分别为
病毒稀释κΓ-ιο—8。图3c为本发明实施例1采用real-time PCR的灵敏度实验结果图；1-8病毒分别稀释lO—LlO—8。
具体实施例方式甲鱼虹彩病毒(STIV)是引起甲鱼“红脖子病”的重要病原，发病死亡率超过40%。 本研究根据STIV胸肝激酶基因的保守序列，设计了两条内引物和两条外引物，建立了 STIV 环媒恒温扩增技术(LAMP)检测方法。对LAMP扩增条件进行了优化，结果表明最佳反应条件 为63°C反应60min，扩增产物可通过琼脂糖凝胶电泳或者picogreen荧光染料检测。LAMP 对蛙病毒属毒株具有特异性，狗鱼弹状病毒(PFRV)、传染性胰腺坏死病毒(IPNV)、病毒性 出血性败血症病毒(VHSV)、传染性造血器官坏死病病毒(IHNV)和鱼病毒性神经坏死病病 毒(VNNV)等鱼类病毒都没有扩增。LAMP检测限比常规PCR高100倍，比实时荧光PCR低 10倍。甲鱼虹彩病毒(STIV)环介导等温扩增检测方法具有快速、灵敏、简便、高效的优点， 可以用于快速检测。实施例11.材料和方法1. 1 病毒甲鱼虹彩病毒来自本实验室从甲鱼中分离的甲鱼虹彩病毒(STIV9701株)。传染性造血器官坏死病毒(IHNV)由英国环境、渔业和养殖科学中心的B. Hill教授惠赠，病毒 性出血性败血症病毒(VHSV)由挪威的国家兽医研究所Roar Gudding博士提供。狗鱼弹状 病毒(PFRV)、传染性胰脏坏死病毒(IPNV)、鱼病毒性神经坏死病病毒(VNNV)、淋巴囊肿病 毒(LCDV)、新加坡石斑病毒(SGIV)、虎蛙病毒(TFV)、伯勒虹彩病毒(BIV)等由深圳出入境 检验检疫局动植物检验检疫技术中心水生动物实验室保存。L2LAMP 引物根据虹彩病毒科蛙病毒属代表种FV-3的胸苷激酶基因(GenBank Ac. No. AY837779)的高度保守区域,使用 primer explore V3 软件(http //primerexplorer. jp)， 设计4条特异性引物(两条内引物和两条外引物)，引物序列分别为正向内引物(FIP)(Seq ID No. 3)5’ -TGGAAAAGTCTTCGGGCACCACGCAAGTCCACACTCCTCAG-3'；反向内引物(BIP)(Seq ID No. 4)5’ -CTGTTTGAGATGGCCCTGGAGGTCTCGCTCTGGATGAGCATA-3’ .正向外引物(F3)(Seq ID No. 1)5’ -CGTTTAGCGGCAACATTGG-3’ ；反向外引物(B3)(Seq ID No. 2)5，-TTTCTTTGCGGCC CTCTG-3，。引物在宝生物工程(大连)有限公司合成。1. 3病毒DNA的提取病毒DNA 的提取按照 TaKaRa MiniBEST Viral RNA/DNA ExtractionKit Ver 3. 0 操作说明书进行，荧光PCR和常规PCR灵敏度比较试验用同批次提取的DNA。1. 4LAMP的反应体系RT-LAMP采用25μ 1反应体系，包括各1μ U40pmol)的内引物FIP和BIP， 各 1 μ L(5pmol)夕卜引物 F3 和 B3，1 μ L(8U)Bst DNA 多聚酶(New England Biolabs,英 国)，2. 5yL10 倍缓冲液，5yL(5mol)甜菜碱(SIGMA,德国),0. 6 μ L(20 μ mol)MgS04, 3. 5 μ L (20 μ mol) dNTP (TAKARA,大连)，2. 5 μ L 病毒核酸作为模板，5. 9 μ L DEPC 水。将反应体系分别在59°C、60°C、6rC、62°C、63°C、64°C和 65°C恒温反应 60min，之 后85°C反应aiiin灭活酶，以确定最佳反应温度。为了确定不同温度下扩增产物的浓度，在ABI7500实时荧光PCR仪(Applied Biosystems，美国)上进行溶解曲线分析程序(90°C 15sec，60°C lmin，90°C 15sec)，以 CT 值最小的反应温度为最佳反应温度。将反应体系在确定好的最佳反应温度下分别反应30、45、60、75min以优化反应时 间。扩增产物的检测可以通过凝胶电泳法或荧光染料法。电泳法取5μ L扩增 产物进行1.5%琼脂糖凝胶电泳，EB染色，紫外灯下观察结果，因为LAMP扩增反应形 成各种不同长的茎环状结构，若电泳可见从点样孔的拖尾现象(Smear)以及很多不同 扩增长度的条带则表明发生了扩增反应。荧光染料法在20 μ L扩增产物中加入IyL lOXPicoGreenanvitrogen，美国)，混合均勻，肉眼观察颜色变化。若发生扩增反应，则颜 色变绿；若保持橙色不变，则没有发生扩增反应。
1.5LAMP特异性实验为了检测LAMP特异性，将其他主要的水生动物病毒，包括IHNV、VHSV、IPNV、PFRV、 VNNV, RSIV、LCDV、SGIV等进行LAMP反应，观察反应结果。1. 6LAMP、常规PCR和实时荧光PCR灵敏度的比较将病毒核酸进行10倍系列稀释，并分别作为模板进行LAMP、常规PCR和实时荧光 PCR反应，比较其检测限。2.结果2. ILAMP检测条件的确定通过LAMP的温度和反应时间优化实验，其反应时间和反应温度得到优化。反 应温度的优化实验结果见图la，电泳检测结果与染色观察的结果完全一致。结果显示在 60-64°C均有扩增，染色观察和电泳结果完全一致。63°C为最佳反应温度。反应时间的优化 实验结果见图lb，电泳观察和染色观察的结果都表明60min为最佳反应时间。由此，最佳的 LAMP 反应条件为63°C，60min。2. 2LAMP特异性实验LAMP特异性实验表明9701株(STIV)、TFV、BIV,9506株和SSS0604同属于虹彩 病毒科蛙病毒属的毒株，在这些毒株中均有扩增。但在其它病毒如VNNV、VHSV、IPNV、IHNV、 PFRV, LCDV、RSIV 和 SGIV 中无扩增。见图 2a，b。2. 3. LAMP灵敏度检测及与常规PCR、实时荧光PCR的比较LAMP的灵敏度实验表明，其最低检测极限为10_7的稀释度，而常规PCR、实时荧光 PCR的检测限分别为10_5、10Λ (图3a, b，c)。3.讨论目前对甲鱼虹彩病毒进行细胞分离培养被认为是病毒分离鉴定的黄金法则，最后 需要通过PCR扩增后测序分析或酶切分析来确证。其可靠性强但操作时间较长。是PCR方 法、实时荧光PCR方法作为初筛诊断方法虽然现在被广泛使用，但在特异性、简便程度、温 度和试剂仪器要求等方面有缺点，故难以在一般的养殖场现场检测上实现。本文建立了甲鱼虹彩病毒的LAMP快速检测方法，相对上述方法具有一定的优点。 首先，LAMP采用4对引物(其中一对引物长度超过40bp)共识别目的片段6个特异性的区 域，只有在引物组完全与靶序列匹配结合的情况下才能进行扩增，因此使具有较高的特异 性。其次，LAMP扩增反应在等温条件下进行，不需要昂贵的热循环加热仪器，没有了核酸的 变复性过程，节约了时间，仅一台水浴锅就能进行检测，这使得LAMP方法可以很容易的在 农场进行检测。第三，该方法可以用PicoGreen荧光染料进行结果判定，不需要凝胶电泳， 因此检测更快速便捷。本研究根据甲鱼虹彩病毒的TK基因设计引物，表现了较好的特异性。仅仅与同属 中给予序列最为相似的病毒有交叉反应。PFRV、IPNV、VHSV、IHNV、VNNV等鱼类病毒都没有 扩增。同时与同属虹彩病毒科的LCDV、SGIV、RSIV都没有扩增反应，表明引物的设计满足检 测特异性的需要。本研究方法-环介导等温扩增方法(LAMP)作为对甲鱼虹彩病毒初筛诊断灵敏度 较高，比常规PCR高100倍，比实时荧光PCR低10倍。相对于PCR和实时荧光PCR来说，但 其设备简单，技术要求不高，只需常规水浴锅在63°C即可进行，通过加入dsDNA染料后目测可以实现对扩增结果的判断。时间上这比常规PCR(5-6h)和实时荧光PCR(1.5-2h)能更早 得到反应结果，因此该技术在可操作性和检测时间及设备要求方面拥有更大的优势。在养 殖场等现场设备不足，技术人员缺乏的条件下，该方法正好补充了这方面的空白。如果进行 进一步优化、研制检测试剂盒，特别适合作为养殖场的现场检测，这将会在甲鱼养殖中病原 的早期诊断及预防控制方面发挥重要的作用。实施例2一种甲鱼虹彩病毒的检测试剂盒，该试剂盒包括以下两对引物正向内引物(FIP)(Seq ID No. 3)5’ -TGGAAAAGTCTTCGGGCACCACGCAAGTCCACACTCCTCAG-3'；反向内引物(BIP)(Seq ID No. 4)5’ -CTGTTTGAGATGGCCCTGGAGGTCTCGCTCTGGATGAGCATA-3’ .正向外引物(F3)(Seq ID No. 1)5’ -CGTTTAGCGGCAACATTGG-3’ ；反向外引物(B3)(Seq ID No. 2)5， -TTTCTTTGCGGCC CTCTG-3，。该试剂盒还包括使用说明书。该试剂盒可用于甲鱼虹彩病毒LAMP检测。以上内容是结合具体的实施方式对本发明所作的进一步详细说明，不能认定本发 明的具体实施只局限于这些说明。对于本发明所属技术领域的普通技术人员来说，在不脱 离本发明构思的前提下，还可以做出若干简单推演或替换，都应当视为属于本发明的保护 范围。
权利要求
1.甲鱼虹彩病毒(STIV)的环介导等温扩增(LAMP)检测方法，所述方法包括利用特异 性引物，以病毒核酸为模板进行环介导等温扩增反应，所述特异性引物包括一对内引物和 一对外引物，其特征在于所述外引物分别含有kq ID No. 1和％(1 ID No. 2所示的序列，Seq ID No. 1 正向外引物(F3) :5，-CGTTTAGCGGCAACATTGG-3，；Seq ID No. 2 反向外引物(B3) :5’ -TTTCTTTGCGGCC CTCTG-3’。
2.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于所述内引物分别含有^^ID No. 3和 Seq ID No. 4所示的序列，Seq ID No. 3 正向内引物(FIP)5’ -TGGAAAAGTCTTCGGGCACCACGCAAGTCCACACTCCTCAG-3'；Seq ID No. 4 反向内引物(BIP)5' -CTGTTTGAGATGGCCCTGGAGGTCTCGCTCTGGATGAGCATA-3’。
3.根据权利要求1或2所述的检测方法，其特征在于所述环介导等温扩增反应的恒 温温度为60°C 64°C。
4.根据权利要求3所述的检测方法，其特征在于所述环介导等温扩增反应的时间为 60min-120mino
5.根据权利要求4所述的检测方法，其特征在于所述环介导等温扩增反应的恒温温 度为63°C，反应的时间为60min。
6.甲鱼虹彩病毒(STIV)的检测试剂盒，其特征在于所述试剂盒包括含有％(1ID No. 1至Seq ID No. 4所示序列中至少一种的引物序列，Seq ID No. 1 5' -CGTTTAGCGGCAACATTGG-3‘Seq ID No. 2 5， -TTTCTTTGCGGCC CTCTG-3'Seq ID No. 3 5 ’ -TGGAAAAGTCTTCGGGCACCACGCAAGTCCACACTCCTCAG-3’Seq ID No. 4 5' -CTGTTTGAGATGGCCCTGGAGGTCTCGCTCTGGATGAGCATA-3’。
7.根据权利要求6所述的检测试剂盒，其特征在于所述检测试剂盒用于环介导等温 扩增反应，所述试剂盒包括分别含有Sep ID No.1和Sep IDNo.2所示序列一对外引物。
8.根据权利要求7所述的检测试剂盒，其特征在于所述检测试剂盒还包括分别含有 Seq ID No.3和Sep ID No.4所示序列一对内引物。
全文摘要
本发明公开了甲鱼虹彩病毒(STIV)的环介导等温扩增(LAMP)检测方法和试剂盒，其中所用的外引物分别含有Seq ID No.1和Seq ID No.2所示的序列。本发明为甲鱼虹彩病毒的检测提供快速、敏感、特异的检测方法，可以进行病毒的现场即时检测，为甲鱼健康养殖及国际贸易的发展提供技术支持。
文档编号C12Q1/68GK102146483SQ20101011316
公开日2011年8月10日 申请日期2010年2月10日 优先权日2010年2月10日
发明者何俊强, 兰文升, 刘宗晓, 刘荭, 郑晓聪, 高隆英 申请人:深圳出入境检验检疫局动植物检验检疫技术中心