分枝杆菌分型鉴定荧光pcr反应液及试剂盒的制作方法
【专利摘要】本发明公开了一种分枝杆菌分型鉴定荧光PCR反应液，其含有扩增引物和分子信标探针；其中所述分子信标探针包括两端分别带有荧光基团和淬灭基团的12条分枝杆菌的分子信标探针中的至少一种，各序列为SEQ?ID?NO.1～SEQ?ID?NO.12。本发明还公开了一种具有所述PCR反应液的试剂盒。利用本发明，可以快速准确地检测并鉴别包括结核分枝杆菌与非结核分枝杆菌在内的12种分枝杆菌。
【专利说明】分枝杆菌分型鉴定荧光PCR反应液及试剂盒
【技术领域】
[0001]本发明涉及一种分枝杆菌分型鉴定荧光PCR反应液及试剂盒。
【背景技术】
[0002]分枝杆菌包括结核分枝杆菌(M.tuberculosis, MTB)、非结核分枝杆菌(Nontuberculous Mycobacteria, NTM)及麻风分枝杆菌。NTM常存在于自然环境中，迄今为止已发现有150余种，其中约1/3与人类疾病有关。
[0003]我国历次结核病流行病学资料显示，NTM分离率从1990年的4.9%升至2000年的
11.1%，2010年为22.9%，这基本反映出我国NTM病呈明显上升的态势。
[0004]临床研究发现，NTM对大多数抗分枝杆菌药物均耐药，因此，NTM病的用药原则与结核病有着明显的不同，而且不同型别NTM病的用药种类和病程也可有所不同，所以NTM的分型鉴定就成了治疗前的一个非常重要的工作。
[0005]然而，NTM病的病理所见与结核病很难鉴别，传统临床只能依靠分枝杆菌的生长特性、色素、生长速度、菌落形态及用生化试验等参数作出鉴定，这种方法费时、费力，且没有标准化试剂，缺乏敏感性和特异性，导致很多结果不易判断。高效液相色谱测定分枝菌酸及气相色谱测定脂肪酸均存在菌种鉴定的局限性，受菌株的生长环境、营养状况的影响，并且需要特殊的仪器。
[0006]基因检测方法可以检出不同型的NTM，但其中PCR产物直接序列测定和限制性内切酶切图谱操作复杂，且不适合检测混合性感染。普通荧光定量PCR只能区分NTM和MTC(结核分枝杆菌)，而不能对NTM进行分型。基因芯片和反向点杂交法可以对NTM进行分型，但这两种方法均操作较复杂，不适合临床大规模推广使用。
【发明内容】
[0007]本发明的主要目的在于提出一种检测准确、快速、可靠的分枝杆菌分型鉴定荧光PCR反应液及试剂盒。
[0008]一种分枝杆菌分型鉴定荧光PCR反应液，其含有扩增引物和分子信标探针；
[0009]其中所述分子信标探针包括两端分别带有荧光基团和淬灭基团的12条分枝杆菌的分子信标探针中的至少一种，其序列为:
[0010]
【权利要求】
1.一种分枝杆菌分型鉴定荧光PCR反应液，其特征在于，其含有扩增引物和分子信标探针； 其中所述分子信标探针包括两端分别带有荧光基团和淬灭基团的如下12条分枝杆菌的分子信标探针中的至少一种，所述分子信标探针的序列为:_
其中上述各序列依次对应序列表中的SEQ ID N0.1~SEQ ID N0.12号序列； 或者，所述分子信标探针的序列为对应于上述各序列的反向互补序列。
2.如权利要求1所述的荧光PCR反应液，其特征在于，所述扩增引物中的下游引物的用量大于上游引物的用量以使PCR产物大部分为负链产物，设计成正链探针的分子信标探针用于与负链产物进行杂交。
3.如权利要求1或2所述的荧光PCR反应液，其特征在于，所述分子信标探针的整体为颈环结构，两端为与分枝杆菌无关的互补的颈结构，中间为与分枝杆菌特异杂交的环状结构。
4.如权利要求1至3任一项所述的荧光PCR反应液，其特征在于，12个分子信标探针分成四种荧光标记，相同荧光标记探针的Tm设计成一定的梯度，差异在2°C以上，熔解温度范围在60°C~80°C左右。
5.如权利要求1至4任一项所述的荧光PCR反应液，其特征在于，所述荧光基团选自FAM、HEX、TAMRA和CY5，所述淬灭基团为Dabcyl。
6.如权利要求1至5任一项所述的荧光PCR反应液，其特征在于，所述扩增引物的序列为:
其中上述两序列分别对应序列表中的SEQ ID N0.13~SEQ ID N0.14号序列。
7.—种分枝杆菌分型鉴定荧光PCR反应试剂盒，其特征在于，具有如权利要求1至6任一项所述的荧光PCR反应液。
【文档编号】C12Q1/68GK104131100SQ201410375163
【公开日】2014年11月5日 申请日期:2014年7月31日 优先权日:2014年7月31日
【发明者】廖生赟, 张涛, 吕纯芳 申请人:深圳市亿立方生物技术有限公司