专利名称：：结核分枝杆菌荧光定量pcr检测方法及其试剂盒的制作方法
技术领域：
：本发明涉及一种快速定量检测不同基因分型结核分枝杆菌(M.tuberculosis)血清DNA的荧光定量PCR检测方法及其试剂盒，属于生物
技术领域：
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背景技术：
：结核分枝杆菌(M.tuberculosis),俗称结核杆菌，是引起结核病的病原菌。可侵犯全身各器官，但以肺结核为最多见。结核病至今仍为重要的传染病。估计世界人口中l/3感染结核分枝杆菌。据WH0报道，每年约有800万新病例发生，至少有300万人死于该病。我国建国前死亡率达200-300人/10万，居各种疾病死亡原因之首，建国后人民生活水平提高，卫生状态改善，特别是开展了群防群治，儿童普遍接种卡介苗，结核病的发病率和死亡率大为降低。但应注意，世界上有些地区因艾滋病、吸毒、免疫抑制剂的应用、酗酒和贫困等原因，发病率又有卜.升趋势。近几年结核杆菌的变异性较大，对抗痨药物的耐药性增加，从而使结核病的发病大幅度增高。虽然传统的涂片抗酸染色、细菌培养以及胸片检査对大部分结核能作出正确的诊断，但对某些病人亦n了造成误诊或漏诊；动物接种虽特异性较高，但因时间较长，不能满足临床快速诊断的需要。近几年也出现了几种快速诊断方法，但也存在较大的缺陷，如短期培养后抗原免疫原性分析，即用放免方法或酶联免疫吸附试验(ELISA)检测BACTEC培养瓶中被培养标本所分泌的抗原，该方法可在BACTEC瓶本身鉴定出细菌之前，结合ELISA和涂片抗酸染色有效地鉴别典型和非典型分枝杆菌，敏感性较高，但存在培养时间长，重复性尚差的缺点.另---,巾是短期培养后核酸探针杂交法，即用特异性DNA探针与BACTEC瓶中培养的细菌染色体DNA杂交。该方法能有效地防止培养的假阴性结果，但却易发生假阳性结果，加之采用的方法较为复杂和繁琐，又有涉及同位素操作之嫌等，因而近来己较少应用。上面两种方法都要借助细菌培养来进行，虽然在时间上比传统培养大大縮短，但缺乏快速[会断的优势。荧光PCR是在普通PCR基础上，在扩增反应体系中加入--对引物的同时再加入一个特异性的荧光探针，该探针为两端标记荧光报告基团和荧光淬灭基团的寡核苷酸。在探针完整时，报告基团发射的荧光信号被淬灭基团所吸收，从而检测不到该探针荧光基团所发出的荧光信号，而在PC財广增时，Taq酶的5'端外切酶活性将特异性结合在目的扩增片断上的荧光探针酶切降解，使荧光报告基团游离于反映体系中，脱离了荧光淬灭基团的屏蔽作用，此时可以检测到荧光报告基团的荧光信号，荧光信号量的变化与扩增产物量成正比。因此荧光PCR技术是具有巨大发展潜力的高新检测技术，在许多领域已得到了广泛应用，其特异性强、检测周期更短、有效解决PCR污染问题、自动化程度高等优点基本实现了快速、灵敏、准确地诊断结核的目的，并且该方法正趋于常规化地应用于临床-一般实验室。
发明内容本发明目的在于提供一种精确简便的用于定量结核分枝杆菌的方法；本发明的另--l目的在于提供一种用于该方法的试剂盒。基于上述目的，本发明釆用以下技术方案用于检测结核分枝杆菌核苷酸片段的引物及探针序列包括引物序列包括由上游引物TBpfl36序列为TGTGCTCCTTGAGTTCGCCAT和下游引物TBpr244序列为GGACAGGCCGAGTTTGGTCAT组成的弓|物对，以及上游引物的互补序ATGGCGAACTCAAGGAGCACA和下游引物的互补序列GGACAGGCCGAGTTTGGTCAT，还包括上游引物TBpfl36位置向5'端方向延仲10个碱基，下游引物TBpr244位置向3'端方向延伸10个碱基，向5'端方向延伸10个碱基区域范围内得到的弓1物序列。.探针序列包括由探针TBpbl87序列为ACACTTTGCGGGCACCGTAAA及互补序列TTTACGGTGCCCGCAAAGTGT，向3，端方向延伸10个碱基和向5，端方向延伸l()个碱基区域范闱内得到的探针序列。本发明釆用以下技术方案分析所有己报道的结核分枝杆菌的基因组序列，选择了一组高度保守的基因序列，并分别设计引物和荧光探针。在常规PCR检测技术的基础上，添加一条标记了两个荧光基团的核苷酸探针，荧光报告基团(R)标记在探针的5'端，荧光淬火基团(Q)标记在3'端，两者构成能量转移结构，即荧光报告基团所发射的荧光可被荧光淬灭基团吸收，当二者距离变远时，抑制作用减弱，报告基团荧光信号增强。在扩增反应过程中，T叫酶的5'端外切酶活性将特异性结合在目的扩增片断上的荧光探针酶切降解，荧光淬灭基团(Q)的抑制作用消失，报告基团荧光信号增强，从而进行结核分枝杆菌的检测。本发明的优点1)本发明提供的引物和探针的检测灵敏度口J达1000copies/ml，说明其具有良好的灵敏度。2)本发明提供的引物和探针对于不含有结核分枝杆菌的检测样本均无扩增信号，说明其具有良好的特异性。3)由于本发明采用结核分枝杆菌高度保守的IS6110特异性基因作为扩增的目的基因，避免了假阴性结果的产生。4)由于本发明采用了荧光定量PCR技术作为检测方法，整个反应均在封闭的反应管内进行，避免了其他核酸检测方法如PCR—电泳等易于形成气溶胶污染而造成假阳性结果；由于对PCR产物进行实时监测，大大节省了监测时间，节约了人力物力。具体实施例方式1.引物和探针设计通过分别对所有己知的结核分枝杆菌基因组序列及进行比较分析，选择无二级结构且高度保守的区段(结核杆菌IS611()特异性基因，其序列见附录)，设计多对引物和探针，引物长度一般为20个碱基左右，引物间和引物内尽量避免有互补序列。最优引物、探针序列组合如下上游引物TBpfl36:TGTGCTCCTTGAGTTCGCCAT下游弓I物TBpr244:GGACAGGCCGAGTTTGGTCAT荧光探针TBpb187:ACACTTTGCGGGCACCGTAAA2.反应体系的建立和优化反应体系得建立和优化中所采用的靶区域模板以如下方法获得利用结核分枝杆菌减毒株作为待检样品，利用碱热裂解法的提取方法提取结核分枝杆菌DNA。2.l引物浓度的优化在反应体系中其他条件相同的情况下，将TB的引物浓度分别从O.1ymol/L至l.0ymol/L做倍比连续稀释后进行检测，通过试验结果的分析比较，确定最佳的引物终浓度为0.2umol/L。2.2探针浓度的优化在反应体系中其他条件相同的情况下，将TB的探针浓度分别从O.1ymol/L至0.5umol/L做倍比连续稀释后进行检测，通过试验结果的分析比较，确定最佳的引物终浓度为0.2umol/L。2.3镁离子浓度的优化在反应体系中其他条件不变的前提下，将镁离子浓度从l.0誦ol/L至4醒ol/L以0.5mmol/L递增，经过多次重复试验结果分析比较，确定最佳的镁离子浓度为3.0mmol/L。2.4TaqDNA聚合酶(Taq酶)用量的优化通过比较Taq酶用量(以单位U计)的优化试验结果，选定2U为最佳Taq酶用量。2.5dNTPs浓度的优化在反应体系屮，将dNTPs浓度从O.lmmol/L至lmmol/L以0.lmmol/L递增，经过多次重复试验结果分析比较，确定最佳的dNTPs浓度为O.3r,l/L。利用上述引物、探针进行反应体系的建立，最后确定采用的荧光定量PCR反应体系为50uL，所需各组分及相应浓度见表l。表l优化后的PCR反应体系<table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table>注1)在荧光PCR反应体积不同时，各试剂应按比例调整;2)使用的仪器不同时，应将反应参数作适当调整。3.仪器检测通道的选择在进行炎光PCR反应时，应对所用仪器中反应管荧光信号的收集进行设置，选择的荧光检测通道与探针所标记的荧光报告基团一致。具体设置方法因仪器而异，应参照仪器使用说明书。4.PCR反应条件如下93°C—2分钟，l个循环93°C40秒一56°C45秒，10个循环93°C30秒一55°C40秒，30个循环。(采集荧光信号)5.2制备待测模板，可采用碱热裂解方法提取结核分枝杆菌DNA;5.3反应休系的建立a、确定最佳引物浓度；b、确定最佳探针浓度；C、确定最佳镁离子浓度；d、确定最佳Taq使用量；e、确定最佳dNTPs浓度；5.4选择仪器的检测方式5.5J二机检测。6.实施例-.结核分枝杆菌荧光定量PCR检测方法及其试剂盒选取引物对TBpfl36/TBpr244和探针TBpb187，将待检的结核杆菌减毒株培养物用碱热裂解方法提取基因组DNA。具体歩骤如下1)将待检的结核分枝杆菌减毒株培养物充分混匀，取O.5ml转至l.5ml干净离心管；2)加入等体积4。禍aOH，充分混匀，室温放置10min;3)12,000卬m离心5分钟，弃.h清；4)沉淀加30ul核酸提取液(DNA)，充分混勻；5)最后100。C处理10分钟，12，000rpm离心5分钟；6)取上清液3ul做PCR反应。在50ul荧光PCR反应体系中，加入以上提取的结核杆菌基因组DNA3ul，根据前述PCR反应条件进行荧光PCR检测。经检测，若待测培养物中含有结核分枝杆菌则显示阳性扩增曲线(见图l)，其检测灵敏度可达lX10、opies/ml。若待检样本中不含结核分枝杆菌则无扩增信号，提示上述引物对和探针具有良好的灵敏度及特异性(灵敏度试验结果见图2，特异性试验结果见图3)。实施例2---临床检测用上述方法对135例临床样本进行检测，其中结核分枝杆菌患者63例，检出阳性率99%，准确率98.4%，并且能够对结核分枝杆菌进行准确定量分析，远远优于酶联免疫吸附测定(ELISA)方法。本发明具有特异性好，灵敏度高，定量精确，快速简便，可重复性高，可对结核分枝杆菌进行快速定量检测。此外结核分枝杆菌荧光定量PCR检测方法降低了临床样品PCR诊断的工作量和诊断的成本，具有潜在的应用价值。图1是结核分枝杆菌阳性扩增曲线图图2是灵敏度试验结果图图3是特异性试验结果图附录结核分枝杆菌IS61l()特异性基因1ttgcggtggggtgtc(;agtcgatctgcacaca(;ctgaccgagctgggtgt(;cc(;atcgcc61ccatcgacctactacgaccacatcaaccggga(;cccagccgcc(;cga〔;ctgcgcgatggc121gaactc'八a〔;(;agcacatca(;ccgcgt(xac(;ccgccaactacgc;tctttac(;gtgcccgc181aaagtgtggctaaccctgaaccgtgagggcatcgaggtggccagatgcaccgtcgaacgg241ctgatgaccaaactcggcctgtccgg(;accacccgcggcaaagcccgcaggaccacgatc301gct(;atccggccacagcccgtcccgccgatctcgtccagcgccgcttcg(;accacca(;ca361cctaaccg(;ct(;t(;ggtagcagacctcacctatgtgtcgacctgggcagggttcgcctac421(;tggcctttgtcac(i;acgcctacgctcgcag(;atcctgggctggc(;ggtcgcttccacg481at(;gccacctccatg(;tcctcgacgc(;atcga(;caagccatctggacccgccaacaagaa541ggcgtactcgacctgaaagacgttatccaccatacggataggggatctca(;tacacatcg601atccggttca(;c(;a(;cggctcgccgaggcaggcatccaaccgtcggtcggagcggtcggaagctcctatgacaatgcactagccgagacgatcaacggcctatacaagaccgagctgatc721aaacccggcaagccctggcggtccatcgaggatgtcgagttggccaccgcgcgctgggtc781gactggttcaaccatcgccgcctctacca(;tactgcggcgacgtcccgccggtcgaactc841(;a(;(;ctgcctactacgctcaacgcca(;agaccm;ccgcc(;gctga10序列表〈110〉扬子江药业集团北京海燕药业有限公司<120>结核分枝杆菌荧光定量PCR检测方法及其试剂盒<歸3<170>Patentlnversion3.3〈2J0>1<211>21<22>DNA〈213〉人工序列〈400>1tgtgctccttgagttcgccat2丄<210>2<2丄1〉21〈212>DNA〈213〉人工序列<400〉2ggac鄉ccgagtttggtcat21<210〉3〈211>21<2J2〉D\A〈2丄3>人工序列<400>3acactttg'cgggcaccgtaaa2权利要求1.一种用于结核分枝杆菌荧光定量PCR检测方法及其试剂盒与结核分枝杆菌荧光PCR检测的引物序列，其特征在于所述的引物序列包括由上游引物TBpf136序列为TGTGCTCCTTGAGTTCGCCAT和下游引物TBpr244序列为GGACAGGCCGAGTTTGGTCAT组成的引物对，以及上游引物的互补序列ATGGCGAACTCAAGGAGCACA和下游引物的互补序列GGACAGGCCGAGTTTGGTCAT。2.根据权利要求1所述的用于结核分枝杆菌荧光PCR检测的引物序列，其特征在于-所述的引物序列包括上游引物TBpfl36位置向5'端方向延伸l()个碱基，下游引物TBpr244位置向3'端方向延伸l()个碱基向5'端方向延伸IO个碱基区域范围内得到的弓I物序列及互补序列。3.—种用于结核分枝杆菌荧光PCR检测的探针序列，其特征在于所述的探针TBpbl87序列为ACACTTTGCGGGCACCGTAAA，以及其互补序列TTTACGGTGCCCGCAAAGTGT。4.根据权利要求3所述的ffl于结核分枝杆菌荧光PCR检测的探针序列，其特征在于所述的探针序列由探针TBpbl87向3'端方向延伸10个碱基向5'向延伸IO个碱基区域范围内得到的探针序列及互补序列。全文摘要本发明涉及一种结核分枝杆菌荧光定量PCR检测方法及其试剂盒，用于结核分枝杆菌核苷酸片段的PCR扩增引物和探针序列。引物序列包括由上游引物TBpf136序列和下游引物TBpr244序列组成的引物对，以及上游引物的互补序列和下游引物的互补序列，还包括上游引物TBpf136位置向5’端方向延伸10个碱基，下游引物TBpr244位置向3’及5’端方向延伸10个碱基区域范围内得到的引物序列。探针序列包括由探针TBpb187序列及互补序列，向3’端方向延伸10个碱基和向5’端方向延伸10个碱基区域范围内得到的探针序列。此方法可用于结核分枝杆菌定量检测，具有实际的临床应用价值。文档编号C12Q1/68GK101676405SQ20081022265公开日2010年3月24日申请日期2008年9月19日优先权日2008年9月19日发明者唐先兵,李晓雯,石和鹏,静肖,郑宜婷申请人:扬子江药业集团北京海燕药业有限公司