专利名称：木聚糖酶或木质素过氧化物酶的制备方法及其在工业漂白领域的应用的制作方法
技术领域：
本发明属于生物漂白材料领域，具体涉及一种利用绿色糖单胞菌来制备木聚糖酶 和木质素过氧化物酶的方法及其在工业漂白领域的应用。
背景技术：
纸浆漂白是造纸工业中的一个必要环节。在化学或机械制浆过程中，约有90%的 木质素可从木材或其他粗原料的纤维素纤维中除去，但仍残留10%，这部分残留的木质素 会造成纸浆呈褐色，并降低纸张的强度(陈嘉川等，1999)。为了漂白纸浆必须去除残余的 木质素，传统的方法是使用酸性漂白剂如氯气、二氧化氯等来去除木质素的化学漂白法，但 该方法会使造纸废水中含有大量难降解的、有毒的、强烈致癌、致畸的有机氯化物，从而造 成环境的严重污染(冯文英等，2002)。为了解决该问题，必须改革漂白工艺，发展新的无污 染漂白技术。因此传统含氯漂白法后来在很大程度上被近无氯漂白(ElementalChlorine Free, ECF)及全无氯漂白(total chlorine-free, TCF)所代替。ECF漂白极大减少了有机 氯化物的形成，但同时引起了其他化学药品消耗的增加。如果在化学漂白之前，用木聚糖酶 和木质素降解酶等酶制剂对纸浆进行预处理，就会使氯气等化学漂白剂更好地渗透到纸浆 里面，从而大大减少化学漂白剂的用量(谢响明等，2003)。近年来国内外对制浆生物技术 的研究方兴未艾，其中利用微生物酶促漂白成为当今造纸工业中最有发展前景的研究课题 之一。采用酶制剂生物(预)漂白，不但可降低纸浆Kappa值、适当提高纸浆的粘度和白度 等性能指标，而且可减少后续ECF或TCF化学药品用量，降低漂白废水的污染负荷(姚春丽 等，2003)。木聚糖(Xylan)是一种多聚五碳糖，是植物半纤维素的重要组分，它占植物碳 水化合物总量的三分之一，在自然界中是继纤维素之后含量第二丰富的可再生物质资源 (Katagiri等，2001)。木聚糖主要存在于植物细胞的次生壁中，处于木质素及其他多聚糖 之间，起着连接作用。木聚糖是一种杂合多聚分子，主链由多个吡喃木糖基通过木糖苷键相 连。侧链上连着多种不同大小的短的取代基，主要有0-乙酰基、4-0-甲基-D-葡糖醛酸残 基、L-阿拉伯糖残基等。这些侧链与植物细胞中其他几种结构性多糖(如木质素、纤维素、 果胶、葡聚糖等)以共价或非共价键连接，组成植物细胞重要的结构-细胞壁。也正由于这 些侧链的不同，使得木聚糖的结构变化范围很大，从仅由0-1，4_糖苷键连接的多聚木糖 线性分子到高度分枝的异质多糖(Kavita等，2002)。木聚糖酶可将木聚糖降解成低聚糖和木糖。对木聚糖酶的研究早在60年代就已 开始，已经从不同来源的微生物中分离到大量的不同类型、不同功能的木聚糖酶(谢响明 等，2004)。最近十几年，随着生物技术的不断发展和进步，特别是基因工程技术和蛋白质工 程技术的广泛应用后，对木聚糖酶的了解更加深入，木聚糖酶在饲料工业、制浆造纸工业、 食品工业、能源工业中都显示出广阔的应用前景，已经引起科学家们的广泛关注(怀文辉 等，2000)。
狭义上的木聚糖酶即内切_ 0 -1，4木聚糖酶。内切_ 0 -1，4-木聚糖酶在许多生 物技术应用领域都存在着巨大的潜力。它们主要水解木聚糖主链骨架的0_1，4木糖苷键， 将含木聚糖的木质素纤维素材料转化为寡聚木糖和木二糖等，进而转化为一系列具有极高 应用价值的生物产品，如应用于面包制造，啤酒和奶酪发酵等(姚春丽等，1998)。用于纸浆 生物预漂白的木聚糖酶制品主要也是指的内切-0_1，4木聚糖酶。在木聚糖酶的活性中 心含有多个能与底物结合的亚位点，这些位点的结构、大小、数量及它们与催化集团的空间 关系决定该酶对不同底物的亲和力、专一性、作用方式及酶反应的动力学参数(Iqbal等， 1994)。广义的木聚糖酶是指能够降解半纤维素木聚糖的一组酶的总称，主要包括三类 (1)内切-0-1，4-木聚糖酶(endo-P-ld-xylanases)，优先在不同位点上作用于木聚糖 和长链木寡糖，从0-1，4_木聚糖主链的内部切割木糖苷键，从而使木聚糖降解为木寡糖， 其水解产物主要为木二糖与木二糖以上的寡聚木糖，也有少量的木糖和阿拉伯糖。(2)外 切-0 -1，4-木聚糖酶(exo- 0 -1,4-xylanases)，作用于木聚糖和木寡糖的非还原端，产 生木糖。(3) 0 -木糖苷酶(0 -xylosidases)，该酶通过切割木寡糖末端而释放木糖残基 (Jonathan 等，2003)。不同来源的木聚糖酶其催化特性也有差异，主要体现在不同的最适反应pH值和 热稳定性上。近年来，人们已从多种微生物中提取了木聚糖酶。最主要的工作集中在从细 菌和真菌中提取的木聚糖酶的酶学特性的研究方面。有关细菌的木聚糖酶的酶学特性在 国内外已有较多的报道。其中研究工作进行较多的有假单孢菌(Pseudomonas)，诺卡氏菌 (Nocardia)，黄杆菌(Flavobacterium)，气杆菌(Acromonas)，黄单抱菌(Xanthonona s)等 十多个属的报道(Suren等，1997)。数据分析显示，细菌所产木聚糖酶可大体分为两类高 分子量的耐酸木聚糖酶和低分子量的耐碱木聚糖酶。但在真菌中却没有这种差别，不过低 分子量木聚糖酶的耐碱性却是共同的。细菌产生的木聚糖酶蛋白质亚基比较单一，分子量 范围在8 145kDa。而真菌产生的木聚糖酶蛋白质亚基则较复杂，分子量大小变化也较大。 对真菌木聚糖酶的研究主要集中在白腐真菌、曲霉和木霉上(Hakan等，2004)。无论是从真 菌中还是从细菌中，内切型木聚糖酶最适温度一般在40°C 60°C之间。一般细菌所产木聚 糖酶比真菌所产木聚糖酶热稳定性和好。另外，放线菌的一些属尤其是链霉菌，也可以分泌 木聚糖酶，且具有较好的耐热性和耐碱性而越来越受到人们的关注(Abdul等，1997)。不同 微生物所产木聚糖酶所能耐受的pH值范围一般是3 10。最适pH值一般为4 7。不同 木聚糖酶的等电点变化范围在3 10之间。大多数已被鉴定的木聚糖内切酶在45-75°C之 间的温度范围表现出最高活性。只有少数分离纯化后的细菌和真菌的木聚糖内切酶在80°C 以上表现出最大活性。因为杂木聚糖的结构复杂，木聚糖降解酶类并不能打开所有的木聚 糖苷键，因此木聚糖的水解需要重叠但不同特性的多种微生物木聚糖酶共同作用(Timcer 等，1999)。由于木聚糖酶在天然材料中表达水平太低、难以大量生产，并且生产成本昂贵以 及木聚糖酶的一些酶活性不能完全满足应用相关条件。因此，木聚糖酶到目前为止，并没有 得到广泛的推广应用。随着生物技术的不断进步，人们希望通过基因工程和蛋白质工程来 更加深入地研究木聚糖酶基因，并且研制出符合人们要求的木聚糖酶产品。运用基因工程 技术在分子水平上对木聚糖酶基因进行分子改造，可望解决一些木聚糖酶活性如抗逆性、
4PH值、热稳定性等的应用缺陷，利用生物反应器则有望成百上千倍地提高它的表达量。木聚 糖酶的基因工程研究已成为世界性的研究热点之一。国际上的研究表明，放线菌中的某些菌株也可通过其分泌的胞外酶(木聚糖酶和 过氧化物酶)降解半纤维素和木质素。1988年Ramachandra等首次报道放线菌-绿孢链霉 菌(Str印tomycesviridosporus)分泌的降解木质素的过氧化物酶AliP_P3，并对酶进行初 步鉴定(Ramachandra等，1988)。Ball和McCarthy于1988年也曾报道可产生胞外木聚糖 酶和过氧化物酶、但无纤维素酶活性的放线菌(Ball等，1988)，1994年之后相继报道其他 放线菌“如热紫链霉菌(S. thermoviolacaceus)，除虫链霉菌(S. avermilitis UAH30)，白 色链霉菌(S. albus)，褐色热单孢菌(Thermomonospora fusca BD25)等可分泌热稳定性高 的木聚糖酶和过氧化物酶。木质素(lignin)是一类由苯丙烷单元通过醚键和碳键连接而成、在植物界中仅 次于纤维素的最丰富和最重要的天然芳香族高分子聚合物，广泛分布于具有维管束的高等 植物中，是裸子植物和被子植物特有的化学成分(Hammel K E，Jensen K A, Mozuch M D， et al.，1993)。木质素在木质纤维中除存在于初生细胞壁和次生细胞壁外，还包围着纤维 素和半纤维素一起填充于微原纤维之间，与细胞壁多糖成分紧密结合，构成一体，加强植物 组织的强度和硬度，同时防止过多的水分和有害物质渗入细胞，对植物具有支持和保护作 用(程言君，1994)。研究表明，木质素的完全降解是真菌、细菌及相应微生物群落共同作用的结果。 自然界中，真菌被认为在木质素的降解中起着主导作用(Higuchi T,1990 ；Ball A S，B Godden，P Helvenstein,et al.，1990)。根据真菌对木质纤维素中不同组分的腐朽类型，可 将其分为白腐菌、褐腐菌和软腐菌三类(Tuomela M.，Vikman M.，Hatakka A，etal. ,2000) 白腐菌、褐腐菌都属于担子菌纲(Basidiomycetes)，软腐菌属于囊菌纲(Ascomycetes)或 半知菌类(Fungi Imperfect)。许多研究者相继发现细菌也具有分泌木质素降解酶的功能，细菌能在加有纯木 质素的土壤中繁殖，并能够缓慢降解该分子。其中起作用的细菌类主要是不动杆菌属 (Acinetobacter sp.)、黄杆菌属(Flavobacterium sp.)、微球菌属(Micrococcussp.)、 假单胞菌属(Pseudomonas sp.)和黄单胞菌属(Xanthomonas sp.)的菌株(Tuomela M.， Vikman M. Hatakka A，et al.，2000 ；Carol A C,1996 ；De Boer H A,Zhang Y Z,Collins C, et al.，1987 ；Nie G，ReadingN S，Aust S D，1998)。在这些细菌中，假单胞菌属是最有效 的降解者(Lokesh K V，2001)。目前已肯定木质素降解酶在细菌降解木质素过程中的催化 作用，研究发现细菌能够降解木质素低分子量部分和木质素的降解产物，因此推测它们可 能在木质素降解的最后阶段起作用，并且细菌降解木质素发生在初级代谢阶段，木质素降 解酶的合成时间是在细菌生长的对数期和稳定期(Nie G, Reading N S, Aust S D，1998)。放线菌不仅可以在初级代谢阶段降解木质素，在降解作用的初期使木质纤维物质 发生改性，也可在降解作用后期代谢真菌降解木质素产生的低分子量物质(Mohamed S A, Sami S，Ali G，1999)。放线菌在木质素降解过程中通过增加木质素的水溶性进而促进其 降解，同时由于能穿透木质纤维素等不溶基质，因而在中性、微碱性土壤或堆肥中，放线菌 也参与有机质的初始降解和腐殖化(Tuomela M.，Vikman M.，Hatakka A, et al.，2000 ； George P C, Susan K K, Tawnya M B，2000)。
近年来国际上对放线菌中的链霉菌属(Str印tomyces)假诺卡氏菌属 (Pseudonocardia)中的一些菌株的研究表现出强烈关注(Alan C andDavid B ff, 1983 ； Joshua S,Diana I and David Bff et al.，1997)，一些菌株可产生热稳定的多种酶系，参与 降解木质纤维素，其中链霉属的丝状菌降解木质素最高可达20% (Tuomela M.，Vikman M.， HatakkaA, et al. , 2000) 0同时研究发现放线菌较之属于担子菌亚门的白腐真菌具有生长 迅速、营养条件简单、不易污染、易于大规模应用和产酶耐热碱性强等特点(Antonopoulos VT, Hernandez M and Arias ME, et al. ,2001) 因此，放线菌对木质的降解更具有商业价 值和潜力应用，近年对其研究开始得到研究者的重视，但仍处于开始阶段。自1934年Boruff和Buswell首次发现能降解木质素的微生物种群后，人们对木 质素的生物降解酶系进行了大量研究。1983年Glenn和Tien等同时发现白腐真菌中黄孢 原毛平革菌产生胞外过氧化物酶系一木质素过氧化物酶(Lignin peroxidases)和锰过氧 化物酶(Manganese peroxidases)；日本的吉田首次在生漆中发现漆酶(Laccase) (Buswell J. A, E. Odier, 1985)。最终研究表明木质素的生物降解主要酶系由这三种酶组成。木质素过氧化物酶是代表一系列含Fe3+、卟啉环(IX)和血红素附基的同工酶，由 不同微生物产生的酶的种类和理化性质各不相同。木质素过氧化物酶是最先从黄孢原毛平 革菌(Phanerochaetechrysosporium)发现的木质素降解酶，在木质素降解中起关键性作 用，是降解木质素的过氧化物酶的主要成分。木质素过氧化物酶底物范围比较广，不但可以 氧化木质素和木质素模型物，还可以直接氧化具有高氧化还原电势的甲基氧、酚类或非酚 类的芳香族化合物，以及一大类其它有机复合物。锰过氧化物酶的分子结构与木质素过氧化物酶相似，也是一种依赖H202带有糖 基的胞外过氧化物酶，酶促反应需要锰离子。锰过氧化物酶的主要产生菌多是一些白腐真 菌，属担子菌亚门，无隔担子菌亚纲，无褶菌目的多孔菌科。锰过氧化物酶的特点是只能氧 化酚型木质素，氧化苯酚的过程中，锰过氧化物酶在H202的启动下，氧化Mn2+为Mn3+，然后 Mn3+氧化苯酚生成苯氧残基。这与木质素过氧化物酶氧化苯酚的方式有明显不同(王海磊， 李宗义，2003)。漆酶是一类能有效降解木质素纤维素，广泛存在于多种植物和菌类的分泌物中的 生物酶。在真菌中，漆酶大多分布在担子菌(Basidimycetes)、多孔菌(Polyporus)、柄孢壳 菌(Podospora)中(Duran N, Ferrer I，Rodriguez J, 1987)。近来,研究发现细菌也能产 生漆酶，如生脂固氮螺菌(Azospirillum lipoferum)，此外，在一些动物肾脏和血清中也发 现了漆酶(张甲耀，龚利萍，罗宇煊等，2002)。利用木聚糖酶的生物漂白研究虽然已经进行了相当一定长的时间，但仍需要不断 改进以适应实际生产的要求。一般木聚糖酶中往往含有纤维素酶的活性。特别是内切纤维 素酶的活性过高，会在酶处理过程中引起纤维强度、浆粘度下降，因此对酶源的选择是十分 关键的。在近20年中，木聚糖酶的发展经历了酸性低温酶(pH5_6，55°C )、偏碱性中温酶 (pH8-9，65°C )及碱性耐高温酶(pH9-10,70°C )三个阶段(Milagres等，2004)。早期开发 的木聚糖酶最适PH值大多在酸性范围内，由于制浆漂白时必须调节浆料pH值，给操作带来 不便。为了适应碱法化学浆氧脱木质素后纸浆的碱性高温条件，最近几年开发的木聚糖酶 一般是中性偏碱，最适作用温度较早期也有提高。这样的酶用于纸浆漂白时无需调节浆料的pH值和温度，利于漂白操作，且在酶处理后，可将溶解在洗涤废水中的木质素、木聚糖等 提取后回收利用，从而降低废水的色度及COD等(张勇等，2003)。可见研究和开发无纤维 素酶活性的耐热耐碱性木聚糖酶具有十分重要的意义。对于一些造纸业非常发达的国家如 美国、加拿大、瑞典，大多以木材为主要原料，浆厂的规模大多数在每天数百吨，以生物途径 代替或部分代替化学途径进行纸浆漂白自七十年代开始就受到广泛的青睐，而且近年来经 改良的木聚糖酶制品的在造纸工业中的应用已经实现了产业化(Qasim等，2000)。在我国， 用于生物漂白的微生物酶产品的研究最近十几年才开始，基本上还限于对产木聚糖酶天然 优良菌株的筛选、木聚糖酶纯化及其结构、性质的分析上，仅克隆了少数木聚糖酶基因，运 用基因工程手段产业化生产木聚糖酶产品还未见报道。因此，从优良菌株胞外酶中筛选、分 离和鉴定适用于制浆漂白的耐碱耐热木聚糖酶具有重要的意义。而木质素过氧化物酶在生物技术及环境工程如生物制浆、生物漂白、土壤生物除 污等方面具有巨大的实际应用潜力，研究者对其进行了大量的研究，但是，在实际应用中存 在的诸如经济性、可行性及适应性等方面问题依旧困扰着该酶的研究发展。首先，已报道的大部分木质素过氧化物酶其性能不能满足工业应用的实际要求， 在制浆造纸工业中要求所用的酶制剂既耐热又耐碱且不含纤维素酶活性，因此，优良的产 木质素过氧化物酶菌株极为重要。其次，目前木质素过氧化物酶生产成本较高，其原因主要 是木质素过氧化物酶生产菌株产量较低，急需提高菌株单位发酵酶活力，以解决酶的大规 模生产和工业化应用等问题。再有，木质素过氧化物酶酶制剂的酶学特性及应用特点也是 实际应用中所必需的基础数据和理论依据。目前，国内外对产木质素过氧化物酶的菌种研究仍集中在真菌类，事实上木质素 的降解转化绝不仅仅是担子菌作用的结果，许多放线菌及细菌的作用不容忽视。放线菌不 仅可以在初级代谢阶段降解木质素，在降解作用的初期使木质纤维物质发生改性，也可在 降解作用后期代谢真菌降解木质素产生的低分子量物质。而对放线菌产生的胞外酶研究主 要集中于木聚糖酶，在其中的木质素过氧化物酶研究方面，仅有个别文献报道其分泌产生 机制、发酵条件、部分提纯和评估其在木质纤维降解中的潜在用途，与白腐菌分泌的木质素 降解酶研究相比，放线菌来源的木质素过氧化物酶在其提纯与鉴定、以及对木质素的降解 分子机理方面研究报道较少(Sunna A and Antranikian G，1997)。对绿色糖单孢菌分泌胞 外酶类，尤其是木质素过氧化物酶的报道国内外尚未见报道，也未见对绿色糖单孢菌木质 素过氧化物酶纯化及特性研究。因此有必要对该菌木质素过氧化物酶分泌的机制，酶的纯 化和酶学特性等方面进行深入研究。本发明方法利用绿色糖单孢菌制备的木聚糖酶和木质素过氧化物酶具有一定耐 碱耐热性，能适应工业漂白的要求，因此可以用于纸浆漂白效果研究。
发明内容
本发明的目的是为了提供一种具有耐热耐碱性的木聚糖酶及木质素过氧化物酶 的制作方法，利用该方法制备的木聚糖酶及木质素过氧化物酶可以适应碱法化学浆氧脱木 质素后纸浆的碱性高温条件。实现上述目的本发明的技术方案为，木聚糖酶或木质素过氧化物酶的制备方法， 其特征在于，该制备方法包括以下步骤，(1)将绿色糖单孢菌菌种活化培养制得母液；(2)
7将(1)步制得的母液接种于含有诱导底物的诱导产酶桑塔斯培养基中进行培养；(3)将(2) 步制得的菌液离心后收集清夜，即得酶的粗提液；(4)将(3)步粗提液透析后进行层析和纯 化得到木聚糖酶或木质素过氧化物酶液。上述木聚糖酶或木质素过氧化物酶的制备方法中，步骤(1)中的母液的制备方法 是将4°C下保存的绿色糖单孢菌菌种，于无菌条件下挑取适量菌丝或孢子，接种于桑塔斯固 体培养基平面上，于45°C下培养72h，然后从上述活化培养后的绿色糖单孢菌中，在无菌条 件下挑取适量菌丝，接于150mL三角瓶装的50mL液体桑塔斯培养基中，在45°C、120rpm条 件下振荡培养3天作为母液。上述木聚糖酶或木质素过氧化物酶的制备方法中，所用桑塔斯培养基(STS)的组 成为大豆蛋白胨10. 0g,酵母粉2. 0g,酶水解酪素2. 0g,氯化钠6. 0g,葡萄糖10. 0g,蒸馏水 1000.OmLo上述木聚糖酶或木质素过氧化物酶的制备方法中，步骤(2)中用于制备木聚糖酶 所用的诱导底物是下述之一棉纱、木聚糖、木聚糖和棉纱混合物、杨木粉、杨木粉和棉纱混 合物、松木粉或松木粉和棉纱混合物。上述木聚糖酶或木质素过氧化物酶的制备方法中，步骤(2)中用于制备木质素过 氧化物酶所用的诱导底物是下述之一胡枝子、麦草、毛白杨、松木粉、麦草浆、粗木质素、苯 甲醇、藜芦醇、二四二氯苯酚或愈创木粉。上述木聚糖酶或木质素过氧化物酶的制备方法中，步骤(2)中，母液于接种含有 诱导底物的诱导产酶桑塔斯培养基时的接种量为2% (lmL/50mL)。上述木聚糖酶或木质素过氧化物酶的制备方法中，步骤(3)中，采用CM Sephadex C-50作为交换介质，pH 6. 0磷酸缓冲液作为实验缓冲液对粗提液进行阳离子交换层析。上述木聚糖酶或木质素过氧化物酶的制备方法中，可以将(1)步制得的母液接种 于含有诱导底物后进行发酵培养制得木质素过氧化物酶。利用上述方法制备的木聚糖酶或木质素过氧化物酶可以用于工业漂白领域。本发明的技术方案具有以下优点，(1)本发明方法中利用绿色糖单胞菌所产的木 聚糖酶液中，其纤维素酶的活性较低，可以防止在酶处理过程中引起纤维强度、浆粘度的下 降；(2)利用本发明方法制备的木聚糖酶，具有一定的耐热耐碱性，在pH 7.0下反应表现最 高活性，同时在90°C下处理3h后酶活残留达63. 55%,适应工业条件的要求；(3)本发明方 法中还利用绿色糖单孢菌发酵大量生产木质素过氧化物酶液，并可以直接有效的攻击木质 素而产生漂白效果；(4)本方法利于绿色糖单孢菌所产的木质素过氧化物酶，具有一定的 耐热耐碱性，在PH7. 0 8. 0下反应表现最高活性，同时在70 90°C下处理lh后酶活为原 来的61%，适应工业条件的要求。
图1是以STS培养基为对照针对不同诱导底物的产木聚糖酶活性分析结果；图中，k、STS培养基；k+、诱导底物是棉纱的培养基；m、诱导底物是木聚糖培养基； m+、诱导底物是木聚糖和棉纱混合物的培养基；y、诱导底物是杨木粉培养基；y+、诱导底物 是杨木粉和棉纱混合物的培养基；s、诱导底物是松木粉培养基；s+、诱导底物是松木粉和 棉纱混合物的培养基。
图2是以STS培养基为对照针对不同诱导底物的产木质素过氧化物酶活性分析结 果；图3是发酵罐中绿色糖单孢菌菌体生长曲线；图4是发酵过程中溶氧及pH变化曲线；图5是发酵过程中接种量对发酵产酶影响；图6是发酵培养基中碳氮源比例对发酵产酶的影响；图7是搅拌速度对发酵产酶的影响；图8是不同通气量对产酶影响的结果；图9是木聚糖酶的产酶时程；图10是木聚糖酶的耐碱性分析结果；图11是对三倍体毛白杨硫酸盐浆进行生物漂白，分析漂后纸浆的白度、粘度变 化；图12是对三倍体毛白杨硫酸盐浆进行生物漂白，分析漂后纸浆的卡帕值变化；图13纸浆Sav漂白后的白度和粘度变化；图14纸浆Sav漂白后的卡帕值变化。
具体实施例方式下面对本发明的技术方案进行具体描述，本发明所用的绿色糖单孢菌 (Saccharomonospora viridis (Schuurmans etal) Nonmura&0hara4. 1089)菌禾中购自中国禾斗 学院微生物研究所菌种保藏中心，为卫生部药品生物制品检定所从波兰引进。下述实施方 式中所用材料均为市售可得。1. 1菌种的活化培养将4°C下保存的绿色糖单孢菌菌种，于无菌条件下挑取适量菌丝或孢子，接种于桑 塔斯固体培养基平面上，于45°C下培养72h。1. 2培养基的制备绿色糖单孢菌诱导产酶培养基为桑塔斯培养基加诱导底物。桑塔斯培养基(STS) 的成份为大豆蛋白胨10. 0g，酵母粉2. 0g，酶水解酪素2. 0g，氯化钠6. 0g，葡萄糖10. 0g, 蒸馏水 1000. OmL。(固体培养基加琼脂 15. 0 20. 0g/1000. 0ml)，pH 7. 2。产木聚糖酶的诱导底物是以下物质之一棉纱(4cm2*3)、木聚糖8g、木聚糖和棉 纱混合物、杨木粉16g、杨木粉和棉纱混合物、松木粉16g、或松木粉和棉纱混合物。产木质素过氧化物酶的诱导底物是以下物质之一胡枝子、麦草、毛白杨、松木粉、 麦草浆、粗木质素、苯甲醇、藜芦醇、二四二氯苯酚、愈创木粉。1. 3产酶培养基的筛选设置了 7种不同的诱导底物，同时以STS培养基作为对照。将接种后的产酶培养 基在45°C，120rpm条件下震荡培养12h后，每间隔12h取样，制备粗酶液测定木聚糖酶、纤 维素酶活性、木质素过氧化物酶，确定在每种培养基的产酶高峰及最高酶活，筛选能诱导产 生活力较高的木聚糖酶而无纤维素酶活性、木质素过氧化物酶的最佳产酶培养基。1. 4母液及粗酶液的制备将活化培养后的绿色糖单孢菌在无菌条件下挑取适量菌丝，接于150mL三角瓶装
9的50mL液体桑塔斯培养基中，在45°C、120rpm条件下振荡培养3天作为母液。将制备好的 母液接种于诱导产酶培养基中，接种量为2% (lmL/50mL)。在45°C、120rpm下振荡培养。取 培养好的菌液在4°C，10000g下离心8min，收集上清夜，即酶的粗提液，可于_20°C下保存备用。1. 5绿色糖单孢菌发酵产酶最佳条件1. 5. 1发酵罐中绿色糖单孢菌菌体生长曲线及菌液光密度0D660在发酵罐培养过程中，接种后每6h取样，至发酵结束。以同条件下未接种培养液 为空白对照，培养时间为横坐标，菌液的0D660吸光度值为纵坐标绘制绿色糖单孢菌在发 酵罐中的生长曲线。取定量培养液在3000r/min条件下离心lOmin，倾去清液，用蒸馏水洗涤菌丝体2 次，于105°C下烘干至恒重，测定绿色糖单孢菌在发酵罐中不同发酵时期菌体浓度。1. 5. 2最佳发酵条件探索在前面的实验结果基础上，本组实验采用桑泰斯培养基+麦草浆作为最佳诱导产 木质素过氧化物酶培养基。将绿色糖单孢菌母液接种于该培养基中。根据溶氧、PH、接种 量、碳氮源比例、搅拌速度、通气量确定了最适的产酶工艺条件。1. 6发酵后酶活及蛋白质含量时程分析1. 7 结果1. 7. 1. 1产木聚糖酶最佳诱导培养基以STS培养基为空白对照，通过8种不同液体培养基培养后，诱导产酶结果如图1 所示。7种加诱导底物的培养基诱导产酶结果与对照培养基相比，诱导产木聚糖酶的效果 均差别不大，其中杨木粉培养基诱导产木聚糖酶活最高，松木粉和棉纱混合物培养基次之， 分别为46. 89U/mL和45. 14U/mL,与空白对照(39. 62U/mL)相比无显著差异。因此不能通 过产木聚糖酶活性的高低来筛选最佳诱导产酶培养基。同时从纤维素酶活性诱导结果可 知，酶活在0. 08U/mL到5. 47U/mL之间，与木聚糖酶的活性相比水平较低。其中松木粉和 棉纱混合物培养基诱导产纤维素酶活性为0.08U/mL，与空白对照(5.40U/mL)相比差异显 著0.05)，而其他几种培养基与空白对照相比并无显著差异。综合两种酶活诱导结果 与适应纸浆漂白实际应用的要求，选择该培养基为最佳诱导绿色糖单孢菌产木聚糖酶培养 基。1. 7. 1. 2产木质素过氧化物酶最佳培养基由图2可以看出，与对照相比，胡枝子粉、麦草粉、毛白杨粉、松木粉、麦草浆等能 够较好地促进三种木质纤维降解酶的产生，其中麦草浆的诱导效果最好(LiP 0.27U/mL、 Xylanase 5. 14U/mL、Cellulase 1. lOU/mL)。而粗提木质素，苯甲醇，藜芦醇，2，4-DCP，愈创 木酚等对木质纤维降解酶的产生并没有明显的促进作用。由此可见，相对于单一的木质素 结构类似物，木粉类物质能更的促进木质纤维降解酶的产生，其原因可能是由于在木粉 类物质除了含有木质素，纤维素，半纤维素等物质外，还含有少量的树脂、脂肪、蜡、可溶性 单宁、色素和灰分等，成分相对复杂，其中的一些组分能够分别促进几种降解酶的产生，几 种酶有协同作用，而降解的中间产物又能够对其他的酶类起到一定的诱导作用。1. 7. 2绿色单孢菌发酵产木质素过氧化物酶最佳发酵条件1. 7. 2. 1发酵罐中绿色糖单孢菌菌体生长曲线及菌液光密度0D660
如图3结果显示，绿色糖单孢菌在发酵罐中经历了大约5个小时的迟缓期后，很快 进入对数生长期，但随着菌体生长、营养物质消耗、代谢产物积累和pH等环境的变化，逐渐 不宜菌的生长，导致生长速率逐渐降低，发酵66小时后菌体进入稳定期，此时菌体浓度达 到19. 08g/L。由图3同时可以看出，菌液吸光值随时间的变化趋势与菌液浓度一致，说明菌 液浓度与吸光度值存在一定的正相关关系。因此，可用菌液吸光值替代绿色糖单孢菌的生 长曲线，根据吸光度值的变化判断菌液所处发酵阶段，准确的掌握发酵时间，此方法既简便 又可减少人为误差，对大规模生产意义非常重大。1. 7. 2. 2发酵过程中溶氧及pH变化对发酵产酶的影响如图4所示，在其他培养条件相同的情况下，由于绿色糖单孢菌为好氧微生物，在 生长过程消耗大量氧气，致使发酵过程中溶氧参数(DO)在培养开始一段时间后持续明显 下降，但适当的搅拌速度和进气量使DO都保持在35%以上，这基本保障了该菌株在好氧性 发酵产酶过程中细胞的快速生长繁殖以及酶产品合成等菌体代谢活动对溶氧的需求。发酵过程中发酵液pH值变化可以大概分成3个阶段，在第一阶段可以看到pH在 逐渐降低，其原因可能是由菌体生长过程中对氮源的消耗以及利用碳源产生有机酸造成； 随着发酵时间的增加，菌体进行初级代谢、次级代谢，胞外蛋白质迅速增加，同时消耗氮源 而积累的铵物质也导致pH的逐渐上升；而在产酶末期，pH及产酶量不再增加，延长产酶时 间可以发现，由于氮源的耗尽，菌体的死亡、自溶，大量碱性物质的释放又导致PH再次上 升。1. 7. 2. 3发酵过程中接种量对发酵产酶的影响在其他培养条件相同的情况下，加入不同比例种子液进行发酵，结果如图5所示， 当接入菌液量为培养基加入量的10%时，菌体产酶量最高。接种量为5%时，由于发酵培 养基中菌体浓度过低，因而不利于菌体的大量繁殖，进而影响其产酶能力；相反，接种量为 15%时，菌体大量繁殖，导致培养基中氧气含量及营养物质迅速下降，菌体生长受到限制， 也不利于其产酶。1. 7. 2. 4发酵培养基中碳氮源比例对发酵产酶的影响如图6所示碳氮比的大小不仅直接影响培养基的pH值，导致代谢途径和代谢产物 发生变化，严重影响菌体的生长和产酶，同时也容易造成原料的浪费。以不同的碳氮比例进 行发酵，结果表明，在碳氮比为1 3时，菌体的产酶量最高，比未优化前(C/N为1)相对酶 活性高出近70%，说明该菌产酶与碳营养的限制有关。1. 7. 2. 5搅拌速度对发酵产酶的影响如图7所示，在其他培养条件相同的情况下，发酵罐搅拌转速为150rpm时，菌液溶 氧性相对较低，致使菌体生长较差，相对搅拌转速250rpm条件下菌体延迟16小时进入稳定 期，产酶的高峰期延长及酶活力下降；搅拌转速为350rpm时，菌体生长相对较快，但同样会 对菌丝体造成过大的剪切力，引起酶蛋白的变性失活，同时在高速搅拌情况下，发酵罐中的 泡沫增多，也不利于产酶；故选择250r pm为最适搅拌转速，一方面使得培养基中溶解氧增 加，另一方面使得营养物质与菌体细胞均勻接触，同时稀释细胞周围的代谢物，有利于细胞 新陈代谢。由此说明适当的搅拌速度很好地改善了发酵体系的溶氧情况，减少了不必要的 动力消耗及过多的强机械搅拌，从而避免了过量的氧和剪切作用对菌体生长和酶活力产生 不良影响。
1. 7. 2. 6通气量对发酵产酶的影响如图8所示，发酵过程中，不同通气量对产酶影响的结果如图所示，通气量为 2. 5L/min时，培养基中溶氧情况相对较差，菌体生长缓慢，导致产酶时间延迟，酶活性相对 较低；当通气量增大到5L/min，发酵罐内溶氧值可维持在35%以上，菌体生长较快较旺盛， 产酶高峰期也有所提前，酶活力提高；当通气量继续增大到7. 5L/min时，菌体产酶状况均 无明显改善，但发酵罐中泡沫很多。所以综合考虑，通气量选取5L/min较为合适，此条件 下，发酵罐内的溶氧值能维持在35%以上水平，既不至于因通气量过低使溶氧值迅速下降， 对菌体的生长造成影响，使菌体代谢积累，抑制酶的合成；又不会因通气量过高使发酵罐产 生过多泡沫。1.7.3最佳发酵条件用16L发酵罐对绿色糖单孢菌进行了木质素过氧化物酶的诱导发酵，确定了最适 的产酶工艺条件接种量为10%，碳氮源比为1 3，搅拌速度为250r/min，通气量为5L/ min，通过控制通气量和调整搅拌转速，使溶氧维持在35%以上，此条件下绿色糖单孢菌较 摇瓶实验提前将近24h达到产酶高峰，酶活最高可达0. 41U/mL。胞外酶活性时程分析绿色糖单孢菌产酶变化规律见图9，在48h之前木聚糖酶酶活显著增加，从48h起 活性增加速度缓慢，到156h时达到最大产酶高峰，酶活为45. 14U/mL，此产酶高峰比白色链 霉菌晚出现12个小时。从156h到192h，木聚糖酶活性急剧降低，在192h时降到整个产酶 时程的最低点(14. 62U/mL)。与此同时由结果可知，与木聚糖酶活相比，纤维素酶活性水平极低(0.08 2. 33U/mL)，其产酶高峰在96h时出现，比木聚糖酶提前了 60个小时。在156h木聚糖酶活 最高时，纤维素酶活性已经降到一个非常低的水平(0. 52U/mL)，此时取样的绿色糖单孢菌 胞外酶最为适合制浆漂白的应用要求。2、绿色糖单孢菌母液及粗酶液的制备2. 1母液及粗提液的制备将活化培养后的绿色糖单孢菌在无菌条件下挑取适量菌丝，接于150mL三角瓶装 的50mL液体桑塔斯培养基中，在45°C、120rpm条件下振荡培养3天作为母液。将制备好的 母液接种于诱导产酶培养基中，接种量为2% (lmL/50mL)。在45°C、120rpm下振荡培养。取 培养好的菌液在4°C，10000g下离心8min，收集上清夜，即酶的粗提液，可于_20°C下保存备用。2. 2粗酶液的浓缩与提纯2. 2. 1粗酶液的浓缩将离心后所得的粗酶液装入透析袋中，置于70%甘油中透析4 6h，得到浓缩后 的粗酶液。2. 2. 2阳离子交换层析采用CM Sephadex C_50作为交换介质，pH6. 0磷酸缓冲液作为实验缓冲液。将溶 胀平衡好的介质与酶液充分混勻吸附后装柱(2X40cm层析柱)。分别用0. l，0.5，1.0mol 的NaCl溶液进行洗脱，用试管收集洗脱液，2mL/管，并利用紫外分光光度计检测蛋白洗脱 峰，同时测定木聚糖酶活性，得到纯化后的木聚糖酶液。浓缩与提纯过程中的木聚糖酶检测数据如表1所示。表1木聚糖酶纯化数据 2. 3DNS法测定木聚糖酶与纤维素酶活性2. 3. 1木糖，葡萄糖标准曲线的制定用pH7. 0的磷酸缓冲液分别配制lmg/ml的木糖和葡萄糖溶液。取出10支25mL 的刻度试管，分别吸入0,0. 2,0. 4,0. 6,0. 8，1. 0，1. 2，1. 4，1. 6，1. 8ml木糖(葡萄糖)溶液。 加入磷酸缓冲液，使每支试管的溶液体积为3ml。每支试管加入2mlDNS溶液，在沸水中反应 5min,反应后迅速冷却至室温。向试管中加入20ml水，在540nm测定溶液的吸光度，绘制标 准曲线。2. 3. 2酶活性的测定木聚糖酶和纤维素酶的活性测定采用DNS法(Miller等，1959)。用磷酸缓冲液 (PH7.0)配制的木聚糖溶液和CMC溶液分别作为木聚糖酶和纤维素酶的底物。在 25mL刻度试管中加入1. OmL底物，0. 2mL酶液和1. 8mL磷酸缓冲液，于60 □ C下水浴20min， 加入2mLDNS试剂，在沸水中煮5min，冷却后加水至25mL，混勻后在540nm波长下测定其吸 光度。根据标准曲线法求得测试液中木糖或葡萄糖的量，按下式求得酶活性H= 1000DC/ (tMV)；上述公式中，H酶活(U/mL) ；D酶液稀释倍数；C测试液中的木糖(葡萄糖)含量(mg/ mL) ；t反应时间(min) ；M木糖(葡萄糖)分子量；V酶液体积(mL) ；1个酶活单位定义为每 分钟催化lmg底物所需的酶量。2. 3. 3相关溶液的配制磷酸缓冲液(pH7)甲液39. 0ml,乙液 61. 0ml，混勻。甲液为 0. 2mol/LNaH2P04. H20 (27. 6g/1000ml)；乙液为 0. 2mol/LNa2HP04. 2H20 (35. 61g/1000ml)。DNS 试剂(3-5 二硝 基水杨酸试剂)酒石酸钾钠182. Og，溶解于500ml蒸馏水，加热(不超过50 □ C)，于热溶 液中依次加入3，5- 二硝基水杨酸6. 3g，氢氧化钠21. Og,苯酚5. Og,无水硫酸钠5. Og,搅拌 均勻至溶，冷却后用蒸馏水定容至1000ml，储存于棕色瓶中，室温保存，7-10天后使用。2. 4木聚糖酶的耐碱性分析分别以pH3. 0 9. 0的宽范围pH值缓冲液作为处理条件，测定木聚糖酶活，探索 其最适反应PH值。2. 5木聚糖酶的木聚糖酶的耐碱性分析稳定性分析采用正交设计法，将提取的粗酶液在50 90°C下处理不同时段，每5°C为一个梯 度。每个温度处理的时段为0. 5 3h，每0. 5h为一个梯度，然后测定木聚糖酶活性，以其相 对于未经处理的酶液活性的百分比为剩余酶活，分析该酶的热稳定性。2. 6 结果
2. 6. 1木聚糖酶的耐碱性分析绿色糖单孢菌分泌的木聚糖酶在pH3. 0 9. 0作用环境下所表现的酶活，结果如 图10所示。木聚糖酶在pH3. 0 5. 0之间条件作用下所表现的活性变化不大而且酶活不 高，为10. 80U/mL 19. 73U/mL。在pH7. 0时反应表现最高酶活，且与前相比显著增加，达到 47. 35U/mL,在pH8. 0时也保持较高的酶活水平(44. 51U/mL)，但在pH8. 0 9. 0的碱性环 境下反应，所表现的木聚糖酶活性与前相比急剧降低，在PH9. 0条件下反应酶活仅为仅为 22. 50U/mL。由此实验结果和前人所作的研究工作可以看出，与真菌及某些细菌分泌的酸性 木聚糖酶相比，绿色糖单孢菌分泌的木聚糖酶具有较好的耐碱性，该酶学特性符合制浆漂 白的碱性环境需要。2. 6. 2木聚糖酶的耐热性分析按正交设计，绿色糖单孢菌分泌的木聚糖酶经过不同温度不同时间段的处理后， 结果如表2所示。在50 65°C条件下，处理时间的长短对木聚糖酶活性的影响不大，与未 处理的对照酶活相比，基本保持在初始酶活的90%以上。在70°C 75°C条件下，酶活随处 理时间的增长略有降低，基本保持在初始酶活的80%左右。在75°C 85°C下，处理时间短 于2. 0h，剩余酶活在70%以上；处理时间为2. 0 3. Oh时，剩余酶活为初始酶活的65%以 上。在90°C下，处理时间短于1. 5h，酶活保持70%以上，处理1. 5 3. Oh时，剩余酶活为 60%以上。由此结果可知，在60°C 90°C的高温环境下(此温度范围为实际制浆漂白工艺 环境的温度范围)，绿色糖单孢菌分泌的木聚糖酶在一定时间内还保持较高活性，具有较好 的热稳定性。而且与白色链霉菌分泌的木聚糖酶相比，高温下的耐热性较好。表2木聚糖酶的耐热性分析(％ )
mm
温度 Temperature (°C ) Time (h) ____
0.51.01.52.02.53.05096.58a96.37a92.24a94.06a88.49a94.41a5590.65a98.98a96.22bc92.4 lab91.72ab95.19a6094.94a94.99a93.98abc88.24b99.46b93.19a6593.11a96.60ab88.06bcd89.78b77.17bc90.59a7082.10b85.60bc81.25bcde75.95c82.61cd76.17b7570.04bc78.56bc75.17cde71.67c68.59de68.89bc8074.55c85.37cd76.7 lde75.57c66.29de67.34bc8570.31c78.56cd72.04de71.57c65.39e68.67c9070.05c74.09d70.90e68.37c78.70e63.55d 3.绿色糖单孢菌胞外复合酶漂后纸浆性能检测3.1纸浆制备速生三倍体毛白杨产自山西省临汾地区，树龄5年。切片后由实验室15L电热回 转蒸煮锅采用硫酸盐法蒸煮获得纸浆。制浆工艺条件见表3-1，所得三倍体毛白杨硫酸盐浆 的将料性能如表3-2所示(于伟东，陈豪中，余惠生，1998)。表3-1制浆工艺条件
14 表3-2浆料性能 3. 2实验仪器
表3-3实验所用仪器
仪器名称型号生产厂家冷冻离心机3K18Sigma(德国)紫外一可见分光光度计UV3802Unico (美国)酸度计F-20A北京屹源电子科技公司旋转蒸发器RE-52AA上海亚荣生化仪器厂北欧标准粘度计—中国制浆造纸研究院球磨机—中国制浆造纸研究院油压机ZQYC西贝轻工业学院机械厂纸样抄取器ZQJ1-B西贝轻工业学院机械厂数字天平JA2003上海天平仪器厂电热鼓风干燥箱101A-2上海申光仪器仪表有限公司数字白度测定仪YQ-Z-48B杭州轻通仪器开发有限公司智能型超级恒温水槽ZC-18Q宁波市海曙天恒仪器厂电热恒温水浴锅DK-S24上海精宏实验设备有限公司恒温磁力搅拌器JB-2上海雷磁新泾仪器有限公司3. 3实验方法3.3. 1复合胞外酶漂白根据漂白浆浓计算所需加入的缓冲溶液量，将缓冲溶液与未漂纸浆在聚乙烯袋中 均勻混合后静置30min，使纸浆实际pH值接近漂白设计的pH值。将Sav加入纸浆中并混 合均勻，同时加入大约0. lmmol/L的H202 (建立一个适宜木质素过氧化物酶反应的催化环 境)(林鹿，詹怀宇，2002)，置于设定好温度的恒温水浴中反应，过程中每隔15min将聚乙烯 袋取出揉搓一次。至规定时间后将纸浆取出，用蒸馏水小心洗净残余酶液，在纸样抄取器上CN 101857859 A说明书14/15 页
抄成统一定量的浆片，自然风干后供浆料分析测试实验使用。3. 3. 2后续化学漂白将漂白所需的化学漂剂加入根据浆浓得出用量的蒸馏水中，混合均勻后，一起倒 入装有待漂纸浆的聚乙烯袋中，揉搓混勻，置于设定好温度的恒温水浴中反应，过程中每隔 15min将聚乙烯袋取出揉搓一次。至规定时间后将纸浆取出，用蒸馏水小心洗净残余漂液， 经PFI磨磨浆到设计打浆度后，在纸样抄取器上抄成统一定量的浆片，自然风干后供浆料 分析测试实验使用。3. 4浆料分析检测3. 4.1 白度纸浆在ZQJ1-B型纸样抄取器上抄片，待风干后，按照ISO标准在YQ-Z-48B数字显 示白度仪上进行测定。3. 4. 2老化白度采用烘箱老化法，把已测定白度的浆片置于105°C的恒温烘箱中，连续烘3h进行 老化，取出冷却，在YQ-Z-48B数字显示白度仪上测定。3. 4. 3 卡帕值按照GB/T1546-1989采用标准卡帕值法进行测定。3. 4. 4 粘度按照GB/T1548-1989采用铜乙二胺粘度法进行测定。3. 5实验结果在预实验中，固定其他四个主要影响因素(pH值、温度、时间和浆浓)，设定Sav的 用量分别是lIU/g(绝干浆，下同)、10IU/g、50IU/g、100IU/g、200IU/g，同条件下对三倍体 毛白杨硫酸盐浆进行生物漂白分析漂后纸浆的白度、卡帕值和粘度变化见表3-4和图11， 图12。表3-4分析漂后纸浆的白度、卡帕值和粘度变化结果
酶用量/ (IU/g)白度/%ISO卡帕值粘度 / (ml / g)132.613.011721032.812.811805035.911.7119510036.111.6119720036.011.61196从上述实验可以看出，纸浆经Sav漂白后卡帕值下降，纸浆白度升高，粘度也略有 提升。从图11和图12中可以看到，随着Sav用量的增加纸浆的白度在酶用量低于50IU/ g时上升趋势明显；酶用量在50IU/g之后，白度不再有明显的提升，这一点反应在纸浆粘度 的变化上也有相同的趋势。与此同时，漂后纸浆的卡帕值在酶用量50IU/g前，下降较为显 著，脱木质素效果明显；在50IU/g之后，下降就比较平稳，基本上不存在脱木质素作用。说 明Sav漂白纸浆的用量应在50IU/g以下，如果超过该用量，多余的胞外酶有可能会在漂白 反应中失活，起不到漂白纸浆的作用。4.漂白纸浆的最佳酶用量
4.1实验方法同3.34. 2实验结果根据实验得出的结论，将Sav漂白纸浆的用量限制在50IU/g以下，分别设定酶用 量为10贝/^(绝干浆，下同)、20贝/^、30贝/^、40贝/^、50贝/^，同条件下生物漂白三倍体毛 白杨硫酸盐浆，分析漂后纸浆的白度、卡帕值和粘度变化，摸索出Sav漂白三倍体毛白杨硫 酸盐浆的最佳酶用量，结果如表4-1和图13、图14所示。表4-1酶用量对漂白的影响 注其它漂白条件pH值7，温度80°C，时间120min，浆浓10%，H202 0. lmmol/L。从图13和图14可以看出，经Sav漂白后，纸浆的白度和粘度均有上升，卡帕值下 降。随着Sav用量从10IU/g到50IU/g增加漂后纸浆白度在酶用量达到30IU/g之前时， 升比较明显，从原浆的32. 6% ISO上升到35. 8% ISO,白度提升3. 2% ISO ；纸浆粘度从原 浆的1170mL/g上升到1194mL/g，上升2. 1%，趋势也比较明显；纸浆卡帕值在这一区间有明 显下降，从原浆的13下降到11. 7，下降10%，说明Sav具有一定的脱木质素作用，原因可能 是其中的木质素过氧化物酶对中纸浆中木质素有降解。当酶用量在30IU/g到50IU/g之间 时，漂后纸浆的白度和粘度均不再有明显的上升，分别只提高了 0. 1% ISO和没有变化；卡 帕值也基本保持不变，已经不存在脱木质素作用。说明Sav的用量超过30IU/g之后，对纸浆 不会再有明显的提高白度和脱木质素作用，再增加酶用量对纸浆漂白不会有较大改善，这 可能是由于多余的Sav在纸浆漂白过程中已经失活，起不到漂白纸浆作用的缘故。此外，在 木聚糖酶漂白纸浆的过程中，木聚糖酶会优先降解纸浆中部分低分子量的木聚糖，因此，经 木聚糖酶漂白后的纸浆粘度会有一定程度的提升(69 Kantelinen et al,1993 ；Suurnakki et al，1994)，本实验中Sav在30IU/g时，漂后纸浆的粘度较原浆上升了 2. 1%，这同时也验 证了 Kantelinen和Suurnakki的观点。所以，从在使用酶量最少的情况下使纸浆获得最佳 的漂白效果这一原则出发，综合上述实验结论可以得出，选用30IU/g(以木聚糖酶活计)作 为Sav漂白三倍体毛白杨硫酸盐浆的最佳酶用量是比较适宜的。上述技术方案仅体现了本发明技术方案的优选技术方案，本技术领域的技术人员 对其中某些部分所可能做出的一些变动均体现了本发明的原理，属于本发明的保护范围之 内。
1权利要求
木聚糖酶或木质素过氧化物酶的制备方法，其特征在于，该制备方法包括以下步骤，(1)将绿色糖单孢菌菌种活化培养制得母液；(2)将(1)步制得的母液接种于含有诱导底物的诱导产酶桑塔斯培养基中进行培养；(3)将(2)步制得的菌液离心后收集清夜，即得酶的粗提液；(4)将(3)步粗提液透析后进行层析和纯化得到木聚糖酶或木质素过氧化物酶液。
2.根据权利要求1所述的木聚糖酶或木质素过氧化物酶的制备方法，其特征在于，步 骤(1)中的母液制备方法是将4°C下保存的绿色糖单孢菌菌种，于无菌条件下挑取适量菌 丝或孢子，接种于桑塔斯固体培养基平面上，于45°C下培养72h，然后从上述活化培养后的 绿色糖单孢菌中，在无菌条件下挑取适量菌丝，接于150mL三角瓶装的50mL液体桑塔斯培 养基中，在45°C、120rpm条件下振荡培养3天作为母液。
3.根据权利要求1或2所述的木聚糖酶或木质素过氧化物酶的制备方法，其特征在于， 所用桑塔斯培养基(STS)的组成为大豆蛋白胨10. 0g，酵母粉2. 0g，酶水解酪素2. 0g，氯化 钠6. 0g,葡萄糖10. 0g,蒸馏水1000. OmL。
4.根据权利要求1所述的木聚糖酶或木质素过氧化物酶的制备方法，其特征在于，步 骤(2)中用于制备木聚糖酶所用的诱导底物是下述之一棉纱、木聚糖、木聚糖和棉纱混合 物、杨木粉、杨木粉和棉纱混合物、松木粉或松木粉和棉纱混合物。
5.根据权利要求1所述的木聚糖酶或木质素过氧化物酶的制备方法，其特征在于，步 骤(2)中用于制备木质素过氧化物酶所用的诱导底物是下述之一胡枝子、麦草、毛白杨、 松木粉、麦草浆、粗木质素、苯甲醇、藜芦醇、二四二氯苯酚或愈创木粉。
6.根据权利要求1所述的木聚糖酶或木质素过氧化物酶的制备方法，其特征在 于，步骤(2)中，母液于接种含有诱导底物的诱导产酶桑塔斯培养基时的接种量为2% (lmL/50mL)。
7.根据权利要求1所述的木聚糖酶或木质素过氧化物酶的制备方法，其特征在于，步 骤(3)中，采用CM Sephadex C_50作为交换介质，pH6. 0磷酸缓冲液作为实验缓冲液对粗 提液进行阳离子交换层析。
8.根据权利要求1所述的木聚糖酶或木质素过氧化物酶的制备方法，其特征在于，也 可以将(1)步制得的母液接种于含有诱导底物后进行发酵培养制得木质素过氧化物酶。
9.根据权利要求1所述的木聚糖酶或木质素过氧化物酶的制备方法，其特征在于，利 用上述方法制备的木聚糖酶或木质素过氧化物酶可以用于工业漂白领域。
全文摘要
本发明公开了木聚糖酶或木质素过氧化物酶的制备方法，该方法包括以下步骤(1)将绿色糖单孢菌菌种活化培养制得母液；(2)将(1)步制得的母液接种于含有诱导底物的诱导产酶桑塔斯培养基中进行培养；(3)将(2)步制得的菌液离心后收集清夜，即得酶的粗提液；(4)将(3)步粗提液透析后进行层析和纯化得到木聚糖酶或木质素过氧化物酶液。(1)步制得的母液也可接种于含有诱导底物后发酵培养制得木质素过氧化物酶。本发明方法制备的木聚糖酶和木质素过氧化物酶，其纤维素酶的活性较低，可以防止在酶处理过程中引起纤维强度、浆粘度的下降，且具有一定的耐热耐碱性，并可以直接有效的攻击木质素和降解半纤维素，适用于工业生产上纸浆预漂白，且漂白效果良好。
文档编号C12N9/08GK101857859SQ20101015619
公开日2010年10月13日 申请日期2010年4月27日 优先权日2010年4月27日
发明者丁梦璇, 何晓青, 吴玉英, 孙晓霞, 张勇, 杨暖, 樊军, 潘文音, 谢响明 申请人:谢响明