专利名称：一种利用苹果渣制备益生菌制剂的方法
技术领域：
本发明属于微生物应用技术领域，涉及益生菌的制备，特别涉及一种利用苹果渣 制备益生菌制剂的方法。
背景技术：
目前农用益生菌制剂大多作为饲料、饲料添加剂、饲料发酵剂、农业用发酵剂或粪 便无害化处理剂等多用途使用，在改善动物体内微生态环境、增强免疫力、预防疾病、促进 生长以及改善养殖环境等方面产生了巨大的经济效应和社会效应。世界多国都有不同类型 的益生菌制剂的产品问世，日本在研制开发和利用益生菌制剂方面处于领先，已经研制和 投产的产品主要有EM-1号、EM糠和由EM-1号原菌进一步研发的营养搭档伴侣、曙光一号 活菌制剂等。其产品制备过程中菌群培养所用的培养基均采用成分复杂、价格昂贵的专用 培养基；制备工艺均采用专用培养基培养后，通过高速离心，收集菌体细胞，再通过冻干或 喷雾干燥制得原菌粉(剂)。该法操作过程复杂，设备要求高，成本昂贵，规模化应用受限。我国在此方面的研究起步较晚，90年代后期才逐渐进入产业化研制阶段，但关键 技术，比如菌种、培养基和制备工艺等均被国外所垄断。目前国内使用的一些产品都非原 菌粉(剂)，而是直接引进国外产品或技术或合资将原菌剂活化、复壮、扩培后加工而成，例 如畜禽益生菌(光合菌，乳酸菌、酵母菌、革兰氏阳性放线菌)、乳康生(腊样芽孢杆菌、干 酪乳杆菌)，生物益生菌补充饲料(植物乳杆菌、酵母菌、乳酸菌)等。从而导致产品依赖性 强，无竞争性。
发明内容
本发明解决的技术问题在于提供一种利用苹果渣制备益生菌制剂的方法，以鲜苹 果渣为原料，通过益生菌菌群比例、培养条件、培养方式的综合控制，生产复合益生菌制剂 制。本发明是通过以下技术方案来实现一种利用苹果渣制备益生菌制剂的方法，包括以下步骤1)培养基的配置将鲜苹果渣和水按质量比为鲜苹果渣水=1 8 12的比例混合后，再加入 鲜苹果渣质量1. 0% 5. 0%的尿素和1. 5% 3. 5%的乳清粉，混勻，110 121°C灭菌 30min，得到苹果渣培养基；2)益生菌菌种的活化将乳酸菌以1 4X 106cfu/100ml的接种量接入苹果渣培养基中，35°C 45°C培 养2 3天后，得到乳酸菌活化的培养基；将酵母菌以1 8X106cfu/100ml的接种量接入苹果渣培养基中，28°C 33°C培 养2 3天，得到酵母菌活化的培养基；将芽孢杆菌以1 4X106cfu/100ml的接种量接入苹果渣培养基中，30°C 37°C
3培养2 3天，得到芽孢杆菌活化的培养基；3)益生菌培养、制剂在新鲜苹果渣培养基中投入其质量6 10%的益生菌活化的培养基，其中，乳酸 菌活化的培养基为2. 0 4. 5%、酵母菌活化的培养基为3. 0 5. 5%、芽孢杆菌活化的培 养基为1. 0 2. 5% ;35 39°C下无菌静置培养3 4天后，加入乳酸链球菌素和纳他霉 素，使乳酸链球菌素的浓度为1 2. 5mg/L，纳他霉素的浓度为3 6mg/L，得到益生菌制 剂。与现有技术相比，本发明具有以下有益的技术效果本发明打破了传统益生菌制剂中菌群的培养必须用专用培养基培养的模式，而是 采用农产品加工废弃物苹果渣为培养基，结合“母子同体”法培养，即益生菌的活化所用的 培养基与益生菌制剂所用的培养基一致。这样一方面可最大限度缩短菌体对环境适应和发 酵垫料启动的时间；另一方面可变废为宝，降低生产成本。本发明采用包括乳酸菌、酵母菌和芽孢杆菌的混合菌群共培养，并通过益生菌菌 群比例、培养条件和培养方式(35 39°C，无菌静置培养)、的综合控制，使混合菌群中的不 同菌种均可达到最佳的生长状态(共生长、活力强)和最大的活菌数；培养结束后经调配 (加入乳酸链球菌素和纳他霉素作为防腐剂)，即可制得该益生菌制剂。制成的益生菌制剂 随着时间的延长，总的活菌数会逐渐减少，但在常温保存一年后，益生菌制剂的总活菌数仍 不低于 108cfu/ml。本发明采用的方法无需离心、冻干或其它干燥过程，工艺及设备简便，成本低，易 规模化推广应用，适宜于农业/畜业生产使用。
具体实施例方式下面结合具体实施方式
对本发明做进一步详细描述，所述是对本发明的解释而不 是限定。实施例1利用苹果渣制备益生菌制剂的方法，包括以下步骤1)培养基的配置将鲜苹果渣和水按质量比为鲜苹果渣水=1 8的比例混合后，再加入鲜苹果 渣质量1. 0%的尿素和1. 5%的乳清粉，混勻，110°C灭菌30min ；得到苹果渣培养基；2)益生菌菌种的活化2. 1) 一级种子培养选取国家农业部规定的饲料级益生菌菌种品种目录中的乳 酸细菌、酵母菌和芽孢杆菌等作为菌种分别活化。乳酸菌的活化将乳酸菌以lml/100ml的接种量接入MRS液体培养基中，35°C培养 24小时后，即得活化的一级乳酸细菌菌种；酵母菌的活化将酵母菌以lml/100ml的接种量接入YPD液体培养基中，28°C培养 48小时后，即得活化的一级酵母菌菌种；芽孢杆菌的活化将芽孢杆菌以lml/100ml的接种量接入液体完全培养基(CM)的 试管中，30°C培养24小时，即得活化的一级芽孢杆菌菌种。2. 2) 二级种子培养
将乳酸菌以IX 106cfu/100ml的接种量接入苹果渣培养基中，35°C培养3天后，培 养基中的乳酸菌得到扩增，得到乳酸菌活化的培养基，以此作为益生菌制剂培养的乳酸菌 菌种来源；将酵母菌以lX106cfu/100ml的接种量接入苹果渣培养基中，28°C培养3天，培养 基中的酵母菌得到扩增，得到酵母菌活化的培养基，以此作为益生菌制剂培养的酵母菌菌 种来源；将芽孢杆菌以1 X 106cfu/100ml的接种量接入苹果渣培养基中，30°C培养3天，培 养基中的芽孢杆菌得到扩增，得到芽孢杆菌活化的培养基，以此作为益生菌制剂培养的芽 孢杆菌菌种来源；3)益生菌培养、制剂在新鲜苹果渣培养基中投入其质量6%的益生菌活化的培养基，其中，乳酸菌活化 的培养基为2. 0%、酵母菌活化的培养基为3. 0%、芽孢杆菌活化的培养基为1. 0% ；35°C下 无菌静置培养4天后，加入乳酸链球菌素和纳他霉素，使乳酸链球菌素的浓度为lmg/L、纳 他霉素的浓度为3mg/L，得到益生菌制剂。实施例2利用苹果渣制备益生菌制剂的方法，包括以下步骤1)培养基的配置将鲜苹果渣和水按质量比为鲜苹果渣水=1 12的比例混合后，再加入鲜苹果 渣质量5. 0%的尿素和3. 5%的乳清粉，混勻，121°C灭菌30min，得到苹果渣培养基；2)益生菌菌种的活化2. 1) 一级种子培养选取国家农业部规定的饲料级益生菌菌种品种目录中的乳 酸细菌、酵母菌和芽孢杆菌等作为菌种分别活化。乳酸菌的活化将乳酸菌以lml/100ml的接种量接入MRS液体培养基中，45°C培养 12小时后，即得活化的一级乳酸细菌菌种；酵母菌的活化将酵母菌以lml/100ml的接种量接入YPD液体培养基中，33°C培养 24小时后，即得活化的一级酵母菌菌种；芽孢杆菌的活化将芽孢杆菌以lml/100ml的接种量接入液体完全培养基(CM)的 试管中，37°C培养18小时，即得活化的一级芽孢杆菌菌种。2. 2) 二级种子培养将乳酸菌以4X 106cfu/100ml的接种量接入苹果渣培养基中，45°C培养2天后，培 养基中的乳酸菌得到扩增，得到乳酸菌活化的培养基，以此作为益生菌制剂培养的乳酸菌 菌种来源；将酵母菌以8X 106cfu/100ml的接种量接入苹果渣培养基中，33°C培养2天，培养 基中的酵母菌得到扩增，得到酵母菌活化的培养基，以此作为益生菌制剂培养的酵母菌菌 种来源；将芽孢杆菌以4X 106cfu/100ml的接种量接入苹果渣培养基中，37°C培养2天，培 养基中的芽孢杆菌得到扩增，得到芽孢杆菌活化的培养基，以此作为益生菌制剂培养的芽 孢杆菌菌种来源；3)益生菌培养、制剂
在新鲜苹果渣培养基中投入其质量10%的益生菌活化的培养基，其中，乳酸菌活 化的培养基为2. 5%、酵母菌活化的培养基为5. 0%、芽孢杆菌活化的培养基为2. 5% ；35°C 下无菌静置培养4天后，加入乳酸链球菌素和纳他霉素，使乳酸链球菌素的浓度为2. 5mg/ L，纳他霉素的浓度为6mg/L，得到益生菌制剂。实施例3利用苹果渣制备益生菌制剂的方法，包括以下步骤1)培养基的配置将鲜苹果渣和水按质量比为鲜苹果渣水=1 10的比例混合后，再加入鲜苹果 渣质量2. 5%的尿素和2. 0%的乳清粉，混勻，120°C灭菌30min，得到苹果渣培养基；2)益生菌菌种的活化2. 1) 一级种子培养选取国家农业部规定的饲料级益生菌菌种品种目录中的乳 酸细菌、酵母菌和芽孢杆菌等作为菌种分别活化。乳酸菌的活化将乳酸菌以lml/100ml的接种量接入MRS液体培养基中，40°C培养 15小时后，即得活化的一级乳酸细菌菌种；酵母菌的活化将酵母菌以lml/100ml的接种量接入YPD液体培养基中，30°C培养 30小时后，即得活化的一级酵母菌菌种；芽孢杆菌的活化将芽孢杆菌以lml/100ml的接种量接入液体完全培养基(CM)的 试管中，35°C培养20小时，即得活化的一级芽孢杆菌菌种。2. 2) 二级种子培养将乳酸菌以2X 106cfu/100ml的接种量接入苹果渣培养基中，40°C培养2. 5天后， 培养基中的乳酸菌得到扩增，得到乳酸菌活化的培养基，以此作为益生菌制剂培养的乳酸 菌菌种来源；将酵母菌以4X106cfu/100ml的接种量接入苹果渣培养基中，30°C培养2. 5天，培 养基中的酵母菌得到扩增，得到酵母菌活化的培养基，以此作为益生菌制剂培养的酵母菌 菌种来源；将芽孢杆菌以2X 106cfu/100ml的接种量接入苹果渣培养基中，35°C培养2. 5天， 培养基中的芽孢杆菌得到扩增，得到芽孢杆菌活化的培养基，以此作为益生菌制剂培养的 芽孢杆菌菌种来源；3)益生菌培养、制剂在新鲜苹果渣培养基中投入其质量8%的益生菌活化的培养基，其中，乳酸菌活化 的培养基为2. 5%、酵母菌活化的培养基为4. 0%、芽孢杆菌活化的培养基为1. 5% ；36°C下 无菌静置培养3. 5天后，加入乳酸链球菌素和纳他霉素，使乳酸链球菌素的浓度为1. 5mg/ L，纳他霉素的浓度为4mg/L，得到益生菌制剂。实施例4利用苹果渣制备益生菌制剂的方法，包括以下步骤1)培养基的配置将鲜苹果渣和水按质量比为鲜苹果渣水=1 9的比例混合后，再加入鲜苹果 渣质量3. 0%的尿素和2. 5%的乳清粉，混勻，115°C灭菌30min，得到苹果渣培养基；2)益生菌菌种的活化
2. 1) 一级种子培养选取国家农业部规定的饲料级益生菌菌种品种目录中的乳 酸细菌、酵母菌和芽孢杆菌等作为菌种分别活化。乳酸菌的活化将乳酸菌以lml/100ml的接种量接入MRS液体培养基中，38°C培养 15小时后，即得活化的一级乳酸细菌菌种；酵母菌的活化将酵母菌以lml/100ml的接种量接入YPD液体培养基中，32°C培养 30小时后，即得活化的一级酵母菌菌种；芽孢杆菌的活化将芽孢杆菌以lml/100ml的接种量接入液体完全培养基(CM)的 试管中，36°C培养20小时，即得活化的一级芽孢杆菌菌种。2. 2) 二级种子培养将乳酸菌以3X 106cfu/100ml的接种量接入苹果渣培养基中，38°C培养2. 5天后， 培养基中的乳酸菌得到扩增，得到乳酸菌活化的培养基，以此作为益生菌制剂培养的乳酸 菌菌种来源；将酵母菌以6X106cfu/100ml的接种量接入苹果渣培养基中，32°C培养2. 5天，培 养基中的酵母菌得到扩增，得到酵母菌活化的培养基，以此作为益生菌制剂培养的酵母菌 菌种来源；将芽孢杆菌以3X 106cfu/100ml的接种量接入苹果渣培养基中，36°C培养2. 5天， 培养基中的芽孢杆菌得到扩增，得到芽孢杆菌活化的培养基，以此作为益生菌制剂培养的 芽孢杆菌菌种来源；3)益生菌培养、制剂在新鲜苹果渣培养基中投入其质量9. 6%的益生菌活化的培养基，其中，乳酸菌 活化的培养基为2. 5%、酵母菌活化的培养基为5. 5%、芽孢杆菌活化的培养基为1. 6% ； 36°C下无菌静置培养3. 5天后，加入乳酸链球菌素和纳他霉素，使乳酸链球菌素的浓度为 1. 5mg/L，纳他霉素的浓度为4mg/L，得到益生菌制剂。
权利要求
一种利用苹果渣制备益生菌制剂的方法，其特征在于，包括以下步骤1)培养基的配置将鲜苹果渣和水按质量比为鲜苹果渣∶水＝1∶8～12的比例混合后，再加入鲜苹果渣质量1.0％～5.0％的尿素和1.5％～3.5％的乳清粉，混匀，110～121℃灭菌30min，得到苹果渣培养基；2)益生菌菌种的活化将乳酸菌以1～4×106cfu/100ml的接种量接入苹果渣培养基中，35℃～45℃培养2～3天后，得到乳酸菌活化的培养基；将酵母菌以1～8×106cfu/100ml的接种量接入苹果渣培养基中，28℃～33℃培养2～3天，得到酵母菌活化的培养基；将芽孢杆菌以1～4×106cfu/100ml的接种量接入苹果渣培养基中，30℃～37℃培养2～3天，得到芽孢杆菌活化的培养基；3)益生菌培养、制剂在新鲜苹果渣培养基中投入其质量6～10％的益生菌活化的培养基，其中，乳酸菌活化的培养基为2.0～4.5％、酵母菌活化的培养基为3.0～5.5％、芽孢杆菌活化的培养基为1.0～2.5％；35～39℃下无菌静置培养3～4天后，加入乳酸链球菌素和纳他霉素，使乳酸链球菌素的浓度为1～2.5mg/L，纳他霉素的浓度为3～6mg/L，得到益生菌制剂。
全文摘要
本发明公开了一种利用苹果渣制备益生菌制剂的方法，将鲜苹果渣和水按质量比为鲜苹果渣∶水＝1∶8～12的比例混合后，再加入鲜苹果渣质量1.0％～5.0％的尿素和1.5％～3.5％的乳清粉，混匀，110℃～121℃灭菌30min，得到苹果渣培养基；结合“母子同体”法培养，即益生菌的活化所用的培养基与益生菌制剂所用的培养基一致。制成的益生菌制剂随着时间的延长，总的活菌数会逐渐减少，但在常温保存一年后，总益生菌制剂的活菌数仍不低于108cfu/ml。本发明采用的方法无需离心、冻干或其它干燥过程，工艺及设备简便，成本低，易规模化推广应用，适宜于农业/畜业生产使用。
文档编号C12N1/00GK101851584SQ20101019347
公开日2010年10月6日 申请日期2010年6月7日 优先权日2010年6月7日
发明者吕嘉枥, 李瑛 申请人:陕西科技大学