专利名称：一种提取杉木属植物组织中rna的方法
技术领域：
本发明涉及一种提取多年生树木类植物组织中RNA的方法，特别涉及一种提取杉木属植物组织中RNA的方法。
背景技术：
杉木是常绿针叶树种之一，是我国重要的速生商品材树种，主要分布在我国和东南亚地区。杉木生长迅速，主茎通直圆满，材质轻而韧，纹理美观，加工容易，木材芳香，不饶、不变形，抗蚁蛀，耐腐蚀。它被广泛应用于房屋建筑、装饰、家具、造船、制器皿等领域。随着杉木深度加工利用，它的用途不断拓展，加上人们生活水平的提高，要求居住环境回归自然，杉木越来越受广大群众欢迎和喜爱，尤其是在南方各省。相对于一年生植物而言，多年生的树木类植物组织中多糖多酚类等次生代谢物质含量较多，且酚类物质的含量会随着植物的生长而增加。在植物材料勻浆时，酚类物质会释放出来，氧化后使勻浆液变为褐色，并随氧化程度的增加而加深，这一现象被称为褐化效应。被氧化的酚类化合物(如醌类)能与RNA稳定地结合，从而影响RNA的分离纯化，严重影响了提取RNA的质量和产量。在沉淀RNA时，多糖也往往沉淀形成凝胶状物质，这种沉淀难溶于水，或溶解后产生粘稠状的溶液，所以也很难有效地将其与RNA分开。另外多糖可以抑制许多酶的活性，因此污染了多糖的RNA样品无法用于进一步的分子生物学研究。由于研究杉木属植物生长发育、代谢和抗逆等相关的各种分子机制以及林木转基因研究，均涉及到其组织中RNA的提取，但由于杉木属植物RNA提取的实际困难导致杉木属植物分子生物学和基因工程包括林木抗性、生殖发育、材性改良等明显落后。目前，RNA的提取方法如 TrizoU SDS、常规CTAB等方法均不能有效地从富含多糖多酚类物质的木本杉木属植物组织中提取高质量的RNA。迄今为止还没有提取杉木属植物各种组织中高质量RNA的有效方法和技术，从而导致与杉木属植物相关的分子生物学研究与应用相对于被子植物和一年生作物落后很多。
发明内容
本发明的目的是提供一种提取杉木属植物组织中RNA的方法。本发明所提供的提取杉木属植物组织中RNA的方法，包括以下步骤(1)裂解植物组织的细胞壁和细胞膜，释放内含物并去除多酚物质和多糖物质；(2)在步骤(1)的基础上去蛋白；(3)在步骤O)的基础上去苯酚；(4)在步骤(3)的基础上沉淀RNA，得到所述植物组织的RNA。所述方法中，在所述步骤⑷中，在所述沉淀RNA后，包括去除DNA的步骤；所述步骤(1)中裂解植物组织的细胞壁和细胞膜，释放内含物的方法为用RNA提取缓冲液对所述植物组织进行抽提，取上清液；所述RNA提取缓冲液由缓冲液A和β -巯基乙醇组成，缓冲液A和β -巯基乙醇的体积比 100 2-100 8，具体为 100 2,100 5 或 100 8 ；每1升所述缓冲液A由200mL STE缓冲液、40g十二烷基磺酸钠、30g聚乙烯吡咯烷酮、150mL乙醇和水组成，用水补足体积，pH值为7. 0-8. 0 ；所述水为焦碳酸二乙酯处理过的无RNA酶超纯水；每200mL所述STE缓冲液由6. Og三羟甲基氨基甲烷、8. 2g氯化钠、3. 7g乙二胺四乙酸和水组成，用水补足体积，PH值为8. 0 ；所述水为焦碳酸二乙酯处理过的无RNA酶超纯水；所述步骤( 中去蛋白的方法为用苯酚、氯仿和异戊醇的混合液抽提步骤(1)得到的产物，收集上清液；所述步骤(3)中去苯酚的方法为用氯仿和异戊醇的混合液抽提步骤( 得到的产物，收集上清液；所述步骤中沉淀RNA的方法为用无水乙醇和醋酸钠水溶液进行沉淀或用异丙醇和醋酸钠水溶液进行沉淀。3、根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于所述步骤(1)中，所述用RNA提取缓冲液对所述植物组织进行抽提的方法为将所述RNA提取缓冲液与所述植物组织混勻，放置5min-10min或5min或7min或lOmin，再离心，取上清液；所述步骤O)中，用苯酚、氯仿和异戊醇的混合液抽提步骤(1)得到的产物，收集上清液的方法为将所述苯酚、氯仿和异戊醇的混合液与步骤(1)得到的产物以1 1的体积比混勻，放置5min-10min或5min或7min或lOmin，再离心，收集上清液；所述步骤C3)中，用氯仿和异戊醇的混合液抽提步骤( 得到的产物，收集上清液的方法为将步骤( 得到的产物与氯仿和异戊醇的混合液以1 1的体积比混勻，放置 5min-10min或5min或7min或IOmin,离心，收集上清液；所述步骤(4)中，用无水乙醇和醋酸钠水溶液进行沉淀的方法为将步骤(3)得到的产物与无水乙醇和醋酸钠水溶液混合，-20°C放置30min-120min或30min或75min 或120min，再离心，收集沉淀；用异丙醇和醋酸钠水溶液进行沉淀的方法为将步骤(3) 得到的产物与异丙醇和醋酸钠水溶液混合，-20°C放置30min-120min或30min或75min 或120min，再离心，收集沉淀；所述步骤( 得到的产物与无水乙醇和醋酸钠水溶液的体积比为10 25 1 ；所述步骤C3)得到的产物与异丙醇和醋酸钠水溶液的体积比为 10 10 1。4、根据权利要求1-3中任一所述的方法，其特征在于所述步骤(1)中，所述RNA提取缓冲液与所述植物组织的配比为0. 25g_lg植物组织4mL RNA提取缓冲液，具体为0. 25g植物组织4mL RNA提取缓冲液、0. 6g植物组织4mL RNA提取缓冲液或Ig植物组织4mL RNA提取缓冲液；所述步骤(4)中，所述醋酸钠水溶液的浓度为3mol/L。所述步骤(1)中，所述离心的方式为在4°C以12，OOOr/min的速度离心5min，旋转半径为66mm ；所述步骤O)中，所述离心的方式为在4°C以12，OOOr/min的速度离心15min，旋转半径为66mm ；
所述步骤(3)中，所述离心的方式为在4°C以12，000r/min的速度离心5min，旋转半径为66mm ；所述步骤中，所述离心的方式为在4°C以12，000r/min的速度离心IOminJ^ 转半径为66mm。所述步骤O)中，所述苯酚、氯仿和异戊醇的混合液中苯酚、氯仿和异戊醇的体积比为 25 24 1 ；所述步骤(3)中，所述氯仿和异戊醇的混合液中，氯仿和异戊醇的体积比为 M I0所述步骤(1)中，所述植物组织为植物组织粉末。所述植物为杉木属植物；所述杉木属植物为杉木；所述植物组织为叶或茎。本发明的方法中，在提取之前，采用严格的无RNase处理，提取缓冲液中加入SDS 可以使蛋白迅速变性，去除多糖，β-巯基乙醇可以去除多糖多酚类物质因氧化而对RNA分离产生的干扰和破坏作用，与PVP结合的多糖多酚类物质，可以直接通过离心去除掉，或在氯仿/异戊醇抽提时除去。苯酚/氯仿/异戊醇抽提，可以有效的去除蛋白和多糖的污染。 无RNase的DNase I处理RNA溶液，可以有效去除RNA中的基因组DNA的污染，得到高纯度 RNA0本发明有效的克服了多糖多酚类次生代谢物质含量高对杉木属植物组织中总RNA提取所带来的不利影响，能从其中提取得到高质量的RNA，得到的总RNA纯度高，有效去除了蛋白、盐类以及多糖和多酚类次生代谢物质的污染。因此，本发明方法具有较大的实际应用价值。
图1为杉木针叶组织未去基因组DNA的RNA经1 %琼脂糖凝胶电泳图。图2为杉木针叶组织去除基因组DNA的RNA经1 %琼脂糖凝胶电泳图。图3为杉木茎组织未去基因组DNA的RNA经1 %琼脂糖凝胶电泳图。图4为杉木茎组织去除基因组DNA的RNA经1 %琼脂糖凝胶电泳图。
具体实施例方式下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。杉木叶购自福建省三明市清流县福新苗圃；杉木茎购自福建省三明市清流县福新苗圃。实施例1、提取杉木针叶组织RNA (未去DNA)并检测方法I一、提取杉木针叶组织RNA (未去DNA)所有的溶液、容器和器具等严格按分子克隆第二版所述方法进行无RNase方法处理。提取杉木针叶组织RNA (未去DNA)包括以下步骤1、裂解植物组织的细胞壁和细胞膜，释放内含物并去除多酚物质和多糖物质RNA 提取缓冲液由缓冲液A和β-巯基乙醇组成；
每1升所述缓冲液A由200mL STE缓冲液、40g十二烷基磺酸钠(SDS)、30g聚乙烯吡咯烷酮、150mL乙醇和水组成，用水补足体积(水为焦碳酸二乙酯(DEPC)处理的无RNA 酶的超纯水)，pH值为7.0 ；每200mL所述STE缓冲液由6. Og三羟甲基氨基甲烷(Tris)、8. 2g氯化钠(NaCl)、 3. 7g乙二胺四乙酸(EDTA)和水组成，用水补足体积(水为DEPC处理的无RNA酶的超纯水)，PH值为8. 0 ；在使用前，向缓冲液A中加入β -巯基乙醇，得到RNA提取缓冲液；β -巯基乙醇的添加量为50mL β -巯基乙醇/1升缓冲液A ；在液氮中研磨200mg杉木针叶至粉末状，迅速转入预冷的1. 5mL离心管中，按照 0. 25g植物组织4mL RNA提取缓冲液的比例加入上述RNA提取缓冲液，迅速涡旋30秒，室温放置5min ；在4°C以12，000r/min的速度离心5min，旋转半径为66mm，收集上清液转到另一个离心管中。RNA提取缓冲液中含SDS、NaCl和乙醇，通过高速离心可去除多糖及多糖衍生物。2、在步骤(1)的基础上去蛋白将苯酚、氯仿和异戊醇的混合液(苯酚、氯仿和异戊醇的体积比为25 24 1) 与步骤⑴得到的产物以1 1的体积比混勻，放置5min，在4°C以12，000r/min的速度离心15min，旋转半径为66mm ；收集上清液转到另一个离心管中。3、在步骤O)的基础上去苯酚将氯仿和异戊醇的混合液(氯仿和异戊醇的体积比为M 1)与步骤⑵得到的产物以1 1的体积比混勻，放置5min，在4°C以12，000r/min的速度离心5min，旋转半径为66mm ；收集上清液转到另一个离心管中。4、在步骤(3)的基础上沉淀RNA，得到植物组织的RNA。将步骤(3)得到的产物与无水乙醇和醋酸钠水溶液(3mol/L)以体积比为 10 25 1混合，_20°C放置30min，在4°C以12，000r/min的速度离心lOmin，旋转半径为 66mm ；收集沉淀，得到杉木针叶组织RNA ；沉淀用lmL70%乙醇洗一遍，在4°C以12，000r/min的速度离心5min，完全去除上清液，收集沉淀；将沉淀在空气中干燥5min，加50 μ L DEPC处理的水溶解沉淀，得到RNA溶液，保存在-80°C超低温冰箱里。3mol/L醋酸钠水溶液的配制方法24. 6克醋酸钠溶于DEPC处理的H2O中，调节pH 至5. 2，定容至IOOmL,高压灭菌。二、检测 1、电泳检测RNA的完整性取上述步骤一得到的杉木针叶组织RNA 1 μ L，在1 %琼脂糖凝胶上电泳，180V，电泳10-20min，其结果见图1。从图中可以看出，经过本发明的方法提取到的杉木针叶组织 RNA (未去除DNA)，电泳检测28S和18S条带均非常清晰，比例为2 1，说明RNA保持了较好的完整性。但是，没经过去除DNA的步骤，得到的RNA尚有基因组DNA的污染。2、提取RNA的纯度检测取2yL步骤一得到的杉木针叶组织RNA样品，用1ΧΤΕ(ρΗ8.0)稀释50倍，用 100 μ L IXTE (ρΗ8. 0)做空白对照，在230nm、260nm、280nm处调节紫外分光光度计的读数至零，然后读出待测样品在三个波长处的OD值。结果显示紫外分光光度计测得OD23tl为 0. 251, OD260 为 0. 512, OD280 为 0. 261，其中，0D26。/0D28(1 = 1. 962, OD260/OD230 = 2. 040。OD260/ OD280比值介于1. 9-2. 1之间，表明RNA纯度高，没有残余的蛋白污染，OD260/OD230大于2. 0， 说明没有杂质盐的污染。方法II一、提取杉木针叶组织RNA (未去DNA)所有的溶液、容器和器具等严格按分子克隆第二版所述方法进行无RNase方法处理。提取杉木针叶组织RNA (未去DNA)包括以下步骤1、裂解植物组织的细胞壁和细胞膜，释放内含物并去除多酚物质和多糖物质除以下1)- 外，其余方法均与方法I相同(1) RNA提取缓冲液中缓冲液A的pH值为7. 5 ；(2)在使用RNA提取缓冲液前，向缓冲液A中加入β-巯基乙醇，β-巯基乙醇的添加量为20mL β -巯基乙醇/1升缓冲液A ；(3)按照0. 6g植物组织4mL RNA提取缓冲液的比例加入上述RNA提取缓冲液，迅速涡旋45秒，室温放置7min。2、在步骤(1)的基础上去蛋白除将苯酚、氯仿和异戊醇的混合液与步骤(1)得到的产物以1 1的体积比混勻， 放置7min以外，其余方法与方法I相同。3、在步骤O)的基础上去苯酚除将氯仿和异戊醇的混合液与步骤( 得到的产物以1 1的体积比混勻，放置 7min以外，其余方法与方法I相同。4、在步骤(3)的基础上沉淀RNA，得到植物组织的RNA。除将步骤(3)得到的产物与异丙醇和醋酸钠水溶液(3mol/L)以体积比为 10 10 1混合，-20°c放置75min外，其余方法均与方法I相同。二、检测1、电泳检测RNA的完整性
与方法I结果无显著差异。2、提取RNA的纯度检测与方法I结果无显著差异。方法III一、提取杉木针叶组织RNA (未去DNA)所有的溶液、容器和器具等严格按分子克隆第二版所述方法进行无RNase方法处理。提取杉木针叶组织RNA (未去DNA)包括以下步骤1、裂解植物组织的细胞壁和细胞膜，释放内含物并去除多酚物质和多糖物质除以下1)- 外，其余方法均与方法I相同(1) RNA提取缓冲液中缓冲液A的pH值为8. 0 ；(2)在使用RNA提取缓冲液前，向缓冲液A中加入β -巯基乙醇，β -巯基乙醇的添加量为80mL β -巯基乙醇/1升缓冲液A ； (3)按照Ig植物组织；4mL RNA提取缓冲液的比例加入上述RNA提取缓冲液，迅速涡旋60秒，室温放置IOmin。2、在步骤(1)的基础上去蛋白除将苯酚、氯仿和异戊醇的混合液与步骤(1)得到的产物以1 1的体积比混勻， 放置IOmin以外，其余方法与方法I相同。3、在步骤O)的基础上去苯酚除将氯仿和异戊醇的混合液与步骤(2)得到的产物以1 1的体积比混勻，放置 IOmin以外，其余方法与方法I相同。4、在步骤(3)的基础上沉淀RNA，得到植物组织的RNA除将步骤(3)得到的产物与无水乙醇和醋酸钠水溶液混合后，-20°C放置120min 外，其余方法均与方法I相同。二、检测1、电泳检测RNA的完整性与方法I结果无显著差异。2、提取RNA的纯度检测与方法I结果无显著差异。实施例2、提取杉木针叶组织RNA (去除DNA)一、提取杉木针叶组织RNA (去除DNA)提取杉木针叶组织RNA(去除DNA)是在实施例1步骤(4)后面，增加去除DNA的步骤，其它步骤与实施例1的方法I完全相同。去除DNA的步骤包括如下(a)用无RNase的DNase I去除RNA中的基因组DNA (50 μ L反应体系中含有5 μ L 的 IOXDNase I bufferUOU DNase I、20U RNase inhibitor,20-50 μ L RNA溶液)，37°C反应 30min ；(b)将氯仿/异戊醇04 1)与等体积的步骤(a)的产物混合，静置5-lOmin， 12，000r/min、4°C离心 lOmin，收集上清液；(c)沉淀RNA 沉淀方法与实施例1的方法I的步骤(4)相同；(d)用ImL 70%乙醇洗沉淀，4°C，12，000r/min离心5min，完全去除上清；(e)沉淀在空气中干燥5min，加50 μ L DEPC处理的水溶解RNA沉淀，于_80°C保存。二、检测1、电泳检测RNA的完整性取上述步骤一得到的杉木针叶组织RNA 1 μ L，在1 %琼脂糖凝胶上电泳，180V,电泳10-20min，其结果见图2。从图中可以看出，经过本发明的方法提取到的杉木针叶组织 RNA(去除DNA)，电泳检测28S和18S条带均非常清晰，比例为2 1，说明RNA保持了较好的完整性。2、提取RNA的纯度检测取2yL步骤一得到的杉木针叶组织RNA样品，用1ΧΤΕ(ρΗ8.0)稀释50倍，用 100 μ L IXTE (ρΗ8. 0)做空白对照，在230nm、260nm、280nm处调节紫外分光光度计的读数至零，然后读出待测样品在三个波长处的OD值。结果显示紫外分光光度计测得OD23tl为 0. 151, OD260 为 0. 338, OD280 为 0. 162，其中，0D26(l/0D28(l = 2. 086, OD260/OD230 = 2. 238。OD260/ OD280比值介于1. 9-2. 1之间，表明RNA纯度高，没有残余的蛋白污染，OD260/OD230大于2. 0， 说明没有杂质盐的污染。实施例3、提取杉木茎组织RNA (未去DNA)一、提取杉木茎组织RNA (未去DNA)该实施例中所用的材料为杉木茎组织，该实施例的RNA提取方法与实施例1的方法I中RNA提取方法相同。二、检测1、电泳检测RNA的完整性取上述步骤一得到的杉木茎组织RNA 1 μ L，在琼脂糖凝胶上电泳，180V,电泳 10-20min，其结果见图3。从图中可以看出，经过本发明的方法提取到的杉木针叶组织RNA (未去除DNA)，电泳检测28S和18S条带均非常清晰，比例为2 1，说明RNA保持了较好的完整性。但是，没有经过去除DNA的步骤，得到的RNA尚有基因组DNA的污染。2、提取RNA的纯度检测取2yL步骤一得到的杉木茎组织RNA样品，用1ΧΤΕ(ρΗ8.0)稀释50倍，用 100 μ Ll X TE (ρΗ8. 0)做空白对照，在230nm、260nm,280nm处调节紫外分光光度计的读数至零，然后读出待测样品在三个波长处的OD值。结果显示紫外分光光度计测得OD23tl为 0. 331，OD260 为 0. 678，OD280 为 0. 346，其中，OD260/OD280 = 1. 960，OD260/OD230 = 2. 048。OD260/ OD280比值介于1. 9-2. 1之间，表明RNA纯度高，没有残余的蛋白污染，OD260/OD230大于2. 0， 说明没有杂质盐的污染。实施例4、提取杉木茎组织RNA (去除DNA)一、提取杉木茎组织RNA (去除DNA)该实施例中所用的材料为杉木茎组织，该实施例的RNA提取方法与实施例2的RNA 提取方法相同。二、检测1、电泳检测RNA的完整性取上述步骤一得到的杉木茎组织RNA lyL，在琼脂糖凝胶上电泳，180V，电泳10-20min，其结果见图4。从图中可以看出，经过本发明的方法提取到的杉木针叶组织 RNA(未去除DNA)，电泳检测28S和18S条带均非常清晰，比例为2 1，说明RNA保持了较好的完整性。2、提取RNA的纯度检测取2yL步骤一得到的杉木茎组织RNA样品，用1ΧΤΕ(ρΗ8.0)稀释50倍，用 100 μ Ll X TE (ρΗ8. 0)做空白对照，在230nm、260nm,280nm处调节紫外分光光度计的读数至零，然后读出待测样品在三个波长处的OD值。结果显示紫外分光光度计测得OD23tl为 0. 203, OD260 为 0. 428, OD280 为 0. 212，其中，0D26。/0D28。= 2. 019，0D26。/0D23。= 2. 108。OD260/ OD280比值介于1. 9-2. 1之间，表明RNA纯度高，没有残余的蛋白污染，OD260/OD230大于2. 0， 说明没有杂质盐的污染。
权利要求
1.一种提取植物组织RNA的方法，包括以下步骤(1)裂解植物组织的细胞壁和细胞膜，释放内含物并去除多酚物质和多糖物质；(2)在步骤(1)的基础上去蛋白；(3)在步骤O)的基础上去苯酚；(4)在步骤(3)的基础上沉淀RNA，得到所述植物组织的RNA。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述方法中，在所述步骤中，在所述沉淀RNA后，包括去除DNA的步骤；所述步骤(1)中裂解植物组织的细胞壁和细胞膜，释放内含物的方法为用RNA提取缓冲液对所述植物组织进行抽提，取上清液；所述RNA提取缓冲液由缓冲液A和β-巯基乙醇组成，缓冲液A和β-巯基乙醇的体积比 100 2-100 8，具体为 100 2,100 5 或 100 8 ；每1升所述缓冲液A由200mL STE缓冲液、40g十二烷基磺酸钠、30g聚乙烯吡咯烷酮、 150mL乙醇和水组成，用水补足体积，pH值为7. 0-8. 0 ；每200mL所述STE缓冲液由6. Og三羟甲基氨基甲烷、8. 2g氯化钠、3. 7g乙二胺四乙酸和水组成，用水补足体积，PH值为8. 0 ；所述步骤( 中去蛋白的方法为用苯酚、氯仿和异戊醇的混合液抽提步骤(1)得到的产物，收集上清液；所述步骤C3)中去苯酚的方法为用氯仿和异戊醇的混合液抽提步骤( 得到的产物， 收集上清液；所述步骤中沉淀RNA的方法为用无水乙醇和醋酸钠水溶液进行沉淀或用异丙醇和醋酸钠水溶液进行沉淀。
3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于所述步骤(1)中，所述用RNA提取缓冲液对所述植物组织进行抽提的方法为将所述 RNA提取缓冲液与所述植物组织混勻，放置5min-10min或5min或7min或lOmin，再离心， 取上清液；所述步骤O)中，用苯酚、氯仿和异戊醇的混合液抽提步骤(1)得到的产物，收集上清液的方法为将所述苯酚、氯仿和异戊醇的混合液与步骤(1)得到的产物以1 1的体积比混勻，放置5min-10min或5min或7min或lOmin，再离心，收集上清液；所述步骤(3)中，用氯仿和异戊醇的混合液抽提步骤( 得到的产物，收集上清液的方法为将步骤( 得到的产物与氯仿和异戊醇的混合液以1 1的体积比混勻，放置 5min-10min或5min或7min或IOmin,离心，收集上清液；所述步骤(4)中，用无水乙醇和醋酸钠水溶液进行沉淀的方法为将步骤C3)得到的产物与无水乙醇和醋酸钠水溶液混合，_20°C放置30min-120min或30min或75min或120min， 再离心，收集沉淀；用异丙醇和醋酸钠水溶液进行沉淀的方法为将步骤C3)得到的产物与异丙醇和醋酸钠水溶液混合，-20°C放置30min-120min或30min或75min或120min， 再离心，收集沉淀；所述步骤C3)得到的产物与无水乙醇和醋酸钠水溶液的体积比为 10 25 1;所述步骤(3)得到的产物与异丙醇和醋酸钠水溶液的体积比为10 10 1。
4.根据权利要求1-3中任一所述的方法，其特征在于所述步骤(1)中，所述RNA提取缓冲液与所述植物组织的配比为0. 25g-lg植物组织4mL RNA提取缓冲液，具体为0. 25g植物组织4mL RNA提取缓冲液、0. 6g植物组织4mL RNA 提取缓冲液或Ig植物组织4mL RNA提取缓冲液；所述步骤(4)中，所述醋酸钠水溶液的浓度为3mol/L。
5.根据权利要求1-4中任一所述的方法，其特征在于所述步骤(1)中，所述离心的方式为在4°C以12，000r/min的速度离心5min，旋转半径为 66mm ；所述步骤O)中，所述离心的方式为在4°C以12，000r/min的速度离心15min，旋转半径为66mm ；所述步骤(3)中，所述离心的方式为在4°C以12，000r/min的速度离心5min，旋转半径为 66mm ；所述步骤中，所述离心的方式为在4°C以12，000r/min的速度离心lOmin，旋转半径为66mm。
6.根据权利要求1-5中任一所述的方法，其特征在于所述步骤O)中，所述苯酚、氯仿和异戊醇的混合液中苯酚、氯仿和异戊醇的体积比为 25 24 1 ；所述步骤(3)中，所述氯仿和异戊醇的混合液中，氯仿和异戊醇的体积比为M 1。
7.根据权利要求1-6中任一所述的方法，其特征在于所述步骤(1)中，所述植物组织为植物组织粉末。
8.根据权利要求1-7中任一所述的方法，其特征在于所述植物为杉木属植物；所述杉木属植物为杉木；所述植物组织为叶或茎。
全文摘要
本发明公开了一种提取杉木属植物组织中RNA的方法。该方法包括以下步骤(1)裂解植物组织的细胞壁和细胞膜，释放内含物并去除多酚物质和多糖物质；(2)在步骤(1)的基础上去蛋白；(3)在步骤(2)的基础上去苯酚；(4)在步骤(3)的基础上沉淀RNA，得到所述植物组织的RNA。本发明有效的克服了多糖多酚类次生代谢物质含量高对杉木属植物组织中RNA提取所带来的不利影响，能从其中提取得到高质量的RNA，具有较大的实际应用价值。
文档编号C12N15/10GK102373194SQ20101024964
公开日2012年3月14日 申请日期2010年8月10日 优先权日2010年8月10日
发明者万里川, 张海燕 申请人:中国科学院植物研究所