专利名称：免疫磁珠分选人关节软骨cd105+/cd166+间充质干细胞的方法
技术领域：
本发明涉及一种细胞分选方法，特别涉及免疫磁珠分选人关节软骨CD105+/ CD166+间充质干细胞的方法。
背景技术：
间充质干细胞(mesenchymal stem cells，MSCs)在维持组织损伤与修复的动态平 衡中起着至关重要的作用。新近研究发现，正常人及原发性骨关节炎(osteoarthritis，OA) 患者的关节软骨内均存在间充质干细胞。因此，建立适宜的分选方法并于适宜的分选时机 从正常人及原发性骨关节炎患者的关节软骨细胞内高效、简便地分选出大量高纯度、高活 性的间充质干细胞，对满足后续细胞生物学特性研究和医学临床细胞移植治疗的需要具有 重要意义。免疫磁性细胞分选技术已有20余年的历史，其中针对某一特异性干细胞表面标 志物的阳性分选(positive isolation)较其阴性分选(negative isolation)能得到更 高的目标细胞富集率。目前常用的免疫磁珠技术分选干细胞多为单阳性标志物分选或单 阳性+单阴性标志物分选。由于组织中干细胞的数量很少，各种表面标志物的阳性率不 一，双阳性分选相对比较困难。目前研究认为，人类成体间充质干细胞的表面标志物包括 CD13、CD29、CD44、CD49、CD51、CD54、CD58、CD71、CD73、CD90、CD102、CD105、CD106、CDwl 19、 CD120a、CD 120b, CD123、CD124、CD126、CD127、CD140a 和 CD166，而某一组织中的成体间 充质干细胞并非所有上述标志物均同时阳性。因此，通常选择其中一个或两个标志物进 行成体间充质干细胞的筛选及其多向分化能力的检测，以确定其干细胞特性。CD105是 TGF-β III型受体，最早被称为SH-2，通过调节转化生长因子- β (transforming growth factor-β, TGF-β)与其受体的结合而参与细胞信号传导。⑶166又称为白细胞活化黏附 因子(activated leukocyte cell adhesion molecule，ALCAM)，是淋巴细胞抗原 CD6 的配 基，主要在白细胞和胸腺上皮细胞上表达。⑶105和⑶166作为间充质干细胞的表面标志物 之一于近年研究中得到广泛承认，并有研究认为⑶105和⑶166共表达可作为骨髓基质干 细胞的表面标志物。Alsalameh 等(Arthritis Rheum, 2004, 50 1522-1532)和刘军等(中 国组织工程研究与临床康复，2008，12 (47) =9239-9242)分别采用CD105和CD166共表达作 为表面标志物进行关节软骨间充质干细胞分选及其多向诱导分化鉴定均获得成功。但Alsalameh等和刘军等采用的分选方法均为目前常用的免疫磁珠间断分选法 即单标志分离_培养_单标志分离法，该方法存在分选效能较低、所需时间较长、操作较为 繁琐等缺点。此外，用免疫磁性细胞分选技术高效分选目标细胞应选择适宜的时机。但自 2003年Barbero等首次发现正常人及原发性骨关节炎患者的关节软骨中含有能够多向分 化的间充质干细胞以来，从最早利用细胞克隆技术到近来使用免疫磁珠技术、流式细胞术 等分选关节软骨间充质干细胞，均未明确高效获取纯净、足量关节软骨间充质干细胞的适 宜分选时机。
发明内容
有鉴于此，本发明的目的在于建立一种免疫磁珠分选人关节软骨⑶105+/⑶166+ 间充质干细胞的方法，具有高效、省时、简便等优点，可以容易地获得高纯度的人关节软骨 间充质干细胞，且细胞活性良好，能够满足后续细胞生物学特性研究和医学临床细胞移植 治疗的需要。为达到上述目的，本发明的免疫磁珠分选人关节软骨⑶105+/⑶166+间充质干细 胞的方法，包括以下步骤①取正常人或原发性骨关节炎患者的关节软骨细胞悬液，加入荧光素标记⑶166 抗体，混勻后于温度2 6°C避光孵育35 55分钟，再于2 6°C离心，弃上清液，用磷酸 盐缓冲液即PBS洗涤并重悬，获得⑶166+细胞-一抗复合物悬液；②向步骤①所得⑶166+细胞-一抗复合物悬液中加入抗荧光素免疫磁珠，混勻后 于2 6°C孵育20 40分钟，再于2 6°C离心，弃上清液，用PBS洗涤并重悬，获得⑶166+ 细胞-一抗-二抗-磁珠复合物悬液；③将LD分离柱置磁场中，用PBS洗柱后，加入步骤②所得⑶166+细胞-一抗-二 抗_磁珠复合物悬液，弃流出液，并用PBS洗柱；④从磁场中取出经步骤③处理后的LD分离柱，用PBS冲洗，收集冲洗液，于2 6°C离心，弃上清液，用PBS洗涤并重悬，获得纯化的⑶166+细胞-一抗-二抗-磁珠复合 物悬液；⑤向步骤④所得纯化的⑶166+细胞-一抗-二抗-磁珠复合物悬液中加入分离 试剂，于2 6°C孵育5 15分钟中止抗原抗体反应，使⑶166+细胞与抗体和磁珠完全解 离，再于2 6°C离心，弃上清液，用PBS洗涤并重悬后，加入终止试剂并充分混勻，使分离试 剂丧失活性，获得⑶166+细胞悬液；⑥向步骤⑤所得⑶166+细胞悬液中加入荧光素标记⑶105抗体，于2 6°C避光 孵育20 40分钟，再于2 6°C离心，弃上清液，用PBS洗涤并重悬，获得⑶105+/⑶166+ 细胞_ 一抗复合物悬液；⑦将步骤⑥所得⑶105+/⑶166+细胞-一抗复合物悬液重复步骤② ⑤的操作并 用MS分离柱替代LD分离柱，即得⑶105+/⑶166+间充质干细胞悬液。进一步，所述关节软骨细胞为原代或第4代培养关节软骨细胞。本发明的有益效果在于本发明从分选周期、分选后的细胞活度、⑶105+/⑶166+ 细胞百分比及收获率四个方面，比较了本发明的免疫磁珠连续分选法与现有的免疫磁珠间 断分选法从原发性骨关节炎患者第4代培养关节软骨细胞中分选CD166+/CD105+细胞的 效能，结果发现本发明的免疫磁珠连续分选法优于现有的免疫磁珠间断分选法，其具有高 效、省时、简便等优点，可以容易地获得高纯度的关节软骨间充质干细胞，且细胞活性良好， 能够满足后续细胞生物学特性研究和医学临床细胞移植治疗的需要。此外，本发明还观测 了原发性骨关节炎患者关节软骨组织分离细胞及其原代和传代培养细胞中CD105+/CD166+ 细胞百分比的变化，结果发现关节软骨组织分离细胞及其原代、第2代和第4代培养细胞 中的⑶105+/⑶166+细胞百分比逐步明显提高，而第4代以后培养细胞中的⑶105+/⑶166+ 细胞百分比无显著变化，由此明确了分选关节软骨间充质干细胞的适宜时机。
为了使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合附图对本发明作进 一步的详细描述，其中图1为流式细胞术检测原代培养关节软骨细胞的体积分布(A)及⑶105+/⑶166+ 细胞百分比(B)；图2为流式细胞术检测第4代培养关节软骨细胞的体积分布(A)及CD105+/CD 166+细胞百分比(B)；图3为流式细胞术检测第4代培养关节软骨细胞分选后细胞的体积分布(A)及 CD105+/CD166+细胞百分比(B)；图4为倒置显微镜观察培养第4天的第4代培养关节软骨细胞(A)及其分选出的 CD105+/CD166+ 细胞(B)。
具体实施例方式
以下将参照附图，对本发明的优选实施例进行详细的描述。优选实施例中采用的关节软骨标本为中国人民解放军第三军医大学第一附属医 院关节外科中心施行原发性骨关节炎人工全膝关节置换术中切除、Markin病理分级1 2 级的全层关节软骨标本5例，患者年龄50 65岁，平均年龄61. 0 士 6. 3岁，其中男3例，女 2例。标本获取得到医院伦理委员会批准，并经患者本人知情同意。优选实施例中采用的主要试剂及材料为透明质酸酶、胰蛋白酶(Sigma公司)， II型胶原酶(Gibco公司)，胎牛血清、DMEM/F12培养基(Hyclone公司)，小鼠抗人⑶105 抗体、小鼠抗人CD166抗体(Ancell公司)，CD105-PE抗体、CD166-FITC抗体(Serotec 公司)，Dynabeads Pan Mouse IgG 二 石兹 _ (Invitrogen 公司)，CD105MicroBeads> Anti-FITC-Multisort 试剂盒[包括抗 FITC 磁珠(Anti-FITC MultiSort MicroBeads)、分 离试齐[J (MultiSort Release Reagent)禾口终止试齐[J (MultiSort Stop Reagent) ]、LD 分离 柱、MS分离柱(MiIitenyi公司)。优选实施例中采用的主要仪器为miniMACS分选架(Militenyi公司)，CKX31型 倒置显微镜(OLYMPUS公司)，YJ-1450净化工作台(苏州净化设备公司)，二氧化碳培养箱 (Thermo公司)，低温离心机(Beckman公司),EPICS AL TRA II型流式细胞仪(Beckman公 司)。优选实施例中采用SPSS10.0统计软件处理数据，计量资料以均值士标准差 ( ±》表示，计数资料以百分比表示，组间比较采用t检验，检验水准α为双侧0.05，以P <0. 05为有统计学差异。一、人关节软骨⑶105+/⑶166+间充质干细胞适宜分选时机的确定按照文献方法(周强等.三步酶消化法高效分离兔原代关节软骨细胞及体外培 养观察.中华外科杂志，2005，43 (8) 522-526)分离原发性骨关节炎患者的关节软骨细胞 并进行体外培养。主要方法如下取关节软骨标本，切剪成约Imm3碎块，依次用浓度为Ig/ L的胰蛋白酶溶液、lg/L的透明质酸酶溶液、2g/L的II型胶原酶溶液于37°C摇床中消化1 小时、1小时、3小时，最后用300目滤网过滤，洗涤，得关节软骨组织分离细胞；所得关节软骨组织分离细胞经计数后，按3X IOVcm2接种于DMEM/F12培养基(含有体积分数为10% 的胎牛血清、浓度为100IU/ml的青霉素和100μ g/ml的链霉素)中，置温度为37°0、0)2气 体体积分数为5%的培养箱内孵育，接种72小时后首次换液，培养细胞至80%融合时(第 5天)，以质量分数为0. 25%的胰蛋白酶溶液消化，收集培养细胞，得原代培养关节软骨细 胞；所得原代培养关节软骨细胞经计数后，按照上述原代细胞培养方法以细胞比为1 2连 续传代培养至第6代，得传代培养关节软骨细胞。分别取上述关节软骨组织分离细胞及其原代和传代培养细胞各5 X IO5个，用PBS 洗涤2次后加入PBS 100 μ 1重悬，再加入CD105-PE抗体和CD166-FITC抗体(1 μ g/106个 细胞，稀释度为1 50)，4°C冰箱避光孵育30分钟，用PBS洗涤2次后，用质量分数为4%的 多聚甲醛溶液固定15分钟，再于流式细胞仪上检测不同培养阶段关节软骨细胞中CD105+/ ⑶166+细胞的百分比。结果见表1和图1 3。表1不同培养阶段关节软骨细胞中CD105+/⑶166+细胞的百分比
权利要求
免疫磁珠分选人关节软骨CD105+/CD166+间充质干细胞的方法，其特征在于包括以下步骤①取正常人或原发性骨关节炎患者的关节软骨细胞悬液，加入荧光素标记CD166抗体，混匀后于温度2～6℃避光孵育35～55分钟，再于2～6℃离心，弃上清液，用磷酸盐缓冲液即PBS洗涤并重悬，获得CD166+细胞 一抗复合物悬液；②向步骤①所得CD166+细胞 一抗复合物悬液中加入抗荧光素免疫磁珠，混匀后于2～6℃孵育20～40分钟，再于2～6℃离心，弃上清液，用PBS洗涤并重悬，获得CD166+细胞 一抗 二抗 磁珠复合物悬液；③将LD分离柱置磁场中，用PBS洗柱后，加入步骤②所得CD166+细胞 一抗 二抗 磁珠复合物悬液，弃流出液，并用PBS洗柱；④从磁场中取出经步骤③处理后的LD分离柱，用PBS冲洗，收集冲洗液，于2～6℃离心，弃上清液，用PBS洗涤并重悬，获得纯化的CD166+细胞 一抗 二抗 磁珠复合物悬液；⑤向步骤④所得纯化的CD166+细胞 一抗 二抗 磁珠复合物悬液中加入分离试剂，于2～6℃孵育5～15分钟中止抗原抗体反应，使CD166+细胞与抗体和磁珠完全解离，再于2～6℃离心，弃上清液，用PBS洗涤并重悬后，加入终止试剂并充分混匀，使分离试剂丧失活性，获得CD166+细胞悬液；⑥向步骤⑤所得CD166+细胞悬液中加入荧光素标记CD105抗体，于2～6℃避光孵育20～40分钟，再于2～6℃离心，弃上清液，用PBS洗涤并重悬，获得CD 105+/CD166+细胞 一抗复合物悬液；⑦将步骤⑥所得CD105+/CD166+细胞 一抗复合物悬液重复步骤②～⑤的操作并用MS分离柱替代LD分离柱，即得CD105+/CD166+间充质干细胞悬液。
2.根据权利要求1所述免疫磁珠分选人关节软骨CD105+/CD166+间充质干细胞的方 法，其特征在于所述关节软骨细胞为原代或第4代培养关节软骨细胞。
全文摘要
本发明涉及一种细胞分选方法，特别涉及免疫磁珠分选人关节软骨CD105+/CD166+间充质干细胞的方法，该方法为双标志免疫磁珠连续分选法，与目前常用的单标志分离-培养-单标志分离的免疫磁珠间断分选法相比，具有高效、省时、简便等优点，可以容易地获得高纯度的人关节软骨间充质干细胞，且细胞活性良好，能够满足后续细胞生物学特性研究和医学临床细胞移植治疗的需要；此外，本发明还明确了分选人关节软骨CD105+/CD166+间充质干细胞的适宜时机。
文档编号C12N5/0775GK101948802SQ201010268449
公开日2011年1月19日 申请日期2010年8月31日 优先权日2010年8月31日
发明者刘军, 常红星, 戴刚, 李忠, 杨柳, 陈光兴 申请人:中国人民解放军第三军医大学第一附属医院