一种人源乳腺癌抗原及其抗体的制作方法

专利名称：一种人源乳腺癌抗原及其抗体的制作方法
一种人源乳腺癌抗原及其抗体
技术领域：
本发明涉及一种新的人源乳腺癌抗原电压门控质子通道Hvl及其抗体。Hvl在正 常乳腺组织中不表达，在乳腺癌组织中大量表达。本发明提供了该人源乳腺癌抗原Hvl相 应的多克隆/单克隆抗体、抗体片段及衍生物等，可以在乳腺癌的诊断、预防和治疗中得到 广泛的应用。
背景技术：
乳腺癌是一种严重影响妇女身心健康甚至危及生命的最常见的恶性肿瘤之一。据 资料统计，在妇女中，乳腺癌的发病率仅次于子宫癌，占全身各种恶性肿瘤的7-10%。40-60 岁之间，绝经期前后的妇女发病率较高。仅约1-2%的乳腺患者是男性。乳腺癌是乳房腺上皮细胞在多种致癌因子作用下，发生了基因突变，致使细胞增 生失控。因为癌细胞的生物行为发生了改变，而导致细胞呈现出无序、无限制的恶性增生。 它的组织学表现形式是大量的幼稚化的癌细胞无限增殖和无序状地拥挤成团，挤压并侵蚀 破坏周围的正常乳房组织结构。由于乳腺癌细胞很容易脱落游离，随血液或淋巴液等播散全身，形成早期的远端 转移，导致其临床治愈困难。全身重要脏器的转移如肺转移、脑转移、骨转移等都将直接威 胁人的生命，因此乳腺癌是严重危及人体生命的恶性疾病。目前，在乳腺癌的治疗上主要有以下四大类方法1)手术治疗。手术治疗又分为 不同术式，它们各有优缺点，都以根治原发癌和区域淋巴结转移为主要目的，在不影响根治 原发癌的前提下，尽量减少手术破坏，争取保留功能和外形。但是，乳腺癌各术式均难免发 生复发及并发症。2)放射治疗。放疗能降低局部复发和区域淋巴结复发。但是能量过高 60Co的γ射线或4 6mV的χ线，会造成皮肤表面剂量过低，浅层组织剂量不足。放疗在 临床上又可分为单纯、术前、术后3种。但是目前医学界对放射疗法说法不一，看法不同。3) 化学治疗。乳腺癌是实体瘤中应用化疗最有效的肿瘤之一。但化疗只是一种辅助治疗，对 可手术患者均应首先考虑手术。4)内分泌疗法。在临床上，内分泌疗法副作用小，有效病例 缓解时间长，生存质量高。但其作用机理较复杂，目前尚未十分清楚。当然，除了以上几大类常用方法以外，还有一些其他的方法。例如，近几年发展起 来的新技术，在乳腺癌部位经动脉导管灌注化疗药物，使得病灶区出现皱褶，肿块变硬，腋 淋巴结缩小。但是，无论是以上哪种方式所进行的都是治疗上的，对于目前频发的乳腺癌早期 检测作用并不明显。而且这些方法并非对乳腺癌细胞具有靶向专杀的作用，也就是在杀死 癌细胞的过程中会大量危害周边的正常组织及免疫细胞，导致患者自身抵抗力下降。乳腺癌细胞存在的一些抗原性物质对于诊断乳腺癌，尤其是早期诊断乳腺癌和判 断预后有极大帮助。通过制备这些抗原的相应抗体，很容易通过免疫组化的方法检测活检 或手术标本是否是乳腺癌；同时也可以建立相应的酶联免疫检测法检测某些抗原在血清及 其它体液中的存在和数量，从而早期诊断乳腺癌或作非侵入性诊断。同时，通过制备相应抗
3原的抗体还可以被用作免疫导向治疗。所以，我们可以说，由乳腺癌的抗原而制备的抗体在 乳腺癌的诊断、预防、治疗、判断预后等方面均起着重要的作用。当然，这些抗体的作用强弱 很大程度取决于其抗原性物质的性质。如果该抗原性物质在乳腺癌组织或细胞表面的表达 的越特异，相应制备出来的抗体在免疫导向治疗过程中就越有效，越安全，制备出来的乳腺 癌预防性疫苗和治疗性疫苗应用前景也越广阔。综上所述，寻找一种特异性高、在乳腺癌中表达阳性率高、位于乳腺癌细胞表面、 对人具有抗原性的乳腺癌抗原对于人乳腺癌的诊断、预防、治疗都具有十分重要的意义。本专利工作得到了国家自然科学基金(No. 30840028和No. 30970579)、 天津市基础科学和高新技术研究项目(No. 08JCYBJC25800)及教育部博士点基金 (No. 200800551035)的资助，在此表示最衷心的谢意。

发明内容本发明的目的之一是提供一种新的人源乳腺癌抗原Hvl (电压门控质子通道)，该 抗原在乳腺癌中的表达阳性率高，在正常细胞不表达。因而所提供的抗原不仅可作为人乳 腺癌主动免疫治疗或预防的靶点，也能成为各种免疫导向治疗的靶点。本发明目的之二是提供一类抗上述人源乳腺癌抗原Hvl的抗体。首先，本发明提供的新的人源乳腺癌抗原Hvl (电压门控质子通道)的氨基酸残基 序列如序列表1所示。所述的抗原为天然抗原或者重组蛋白抗原。该抗原表达于多数人乳 腺癌的癌细胞中，不表达于人正常细胞中。该抗原可刺激人体抗人乳腺癌免疫反应，可作为抗人乳腺癌免疫导向治疗靶的抗原。将本发明提供的这种新的人源乳腺癌抗原Hvl的基因克隆入带有正确读码框的 原核表达载体，通过IPTG诱导表达，并进行纯化，获得了该人源乳腺癌抗原的重组蛋白抗原。本发明还提供了一种含有编码出如上所述序列表1 (SEQ NO. 1)所示的氨基酸序列 的DNA序列的重组载体(pGEX6p-l-C-Hvl)，以及含有该重组载体的宿主大肠杆菌。采用上述重组蛋白抗原免疫Balb/c小鼠，最终获得了抗该抗原的抗血清。采用上述抗血清及免疫组织化学的方法，检测了人乳腺癌组织切片标本，结果显 示乳腺癌组织呈阳性反应，证明该抗原表达于多数乳腺癌细胞上；同时还检测了正常人的 乳腺组织切片，结果在检测的3套正常组织切片中尚未见到阳性染色，证明该抗原至少是 极少表达于正常组织。综上所述，本发明提供的人源乳腺癌抗原Hvl是一种在人乳腺癌中表达阳性率 高，而表达特异性也高，并且位于肿瘤细胞表面的新的人乳腺癌相关抗原。本发明的第二方面提供了一类抗上述人源乳腺癌抗原Hvl的抗体。 这类抗体不仅可用于体外诊断人乳腺癌，其本身或其衍生物也可以用于在体内免 疫导向诊断或治疗人乳腺癌。这类抗体是指抗人源乳腺癌抗原的多克隆抗体、鼠单克隆抗 体或抗体片断，以及这些抗体的衍生物，所述的衍生物包括但不限于偶联核素的抗体、偶联 化学药物的抗体、偶联脂质体的抗体、融合药物前体酶的抗体、融合其它效应分子的抗体寸。
根据已知人源乳腺癌抗原Hvl，很容易获得其相应的各种抗体及衍生物。可以通过 以下方法获得相应的各种抗体，但不只限于下列方法1、采用人源乳腺癌抗原Hvl免疫家兔，在检测兔血清中相应的特异抗体的含量 后，处死动物获得抗血清，经过常规的抗体纯化即可获得抗人源乳腺癌抗原Hvl的多克隆 抗体。2、采用Hvl免疫Balb/c小鼠，在检测小鼠血清中相应的特异抗体的含量后，处死 动物获得脾细胞，经过与小鼠骨髓瘤细胞SP2/0融合，再经抗原特异性试验筛选，即可获得 鼠单克隆抗体。本发明的第三方面还提供了抗人源乳腺癌抗原Hvl的抗体及衍生物在制备人乳 腺癌诊断、治疗、预防药物中的应用。抗人源乳腺癌抗原Hvl的相应抗体可作为药物用于乳腺癌的诊断之中。例如，该 药物可用于组织标本的免疫组化染色来进行诊断，可用于组织勻浆液及各种体液、分泌液 中该抗原含量的检测来诊断。此外，单独的相应抗体还具有直接治疗乳腺癌的用途。抗人源乳腺癌抗原Hvl的相应抗体的衍生物可以作为药物用来免疫导向诊断或 治疗乳腺癌。如标记有核素或化疗药物的抗体可以将核素或化学药物带到乳腺癌组织局部，从 而减少核素或化疗药物的毒性，大大增加它们杀伤乳腺癌细胞的作用。标记有核素的抗体还可以将肿瘤的影像在伽玛照相机下显示出来，达到免疫导向 诊断的目的。纳米磁性颗粒偶联的抗体将纳米磁性颗粒浓聚于乳腺癌病灶局部，不仅可在X 光、CT、核磁共振下显像肿瘤，起到诊断的作用，还可以在高频交变磁场的作用下发热，杀伤 周围的乳腺癌细胞，起到治疗乳腺癌的目的。将该抗原相应抗体与效应分子融合，可以将效应分子浓聚于乳腺癌病灶，使效应 分子最大程度地发挥作用，起到治疗人乳腺癌的作用。总之，利用本发明提供的前述人源乳腺癌抗原Hvl的相应抗体，可制备人乳腺癌 诊断、治疗、预防的药物，用于乳腺癌的诊断、治疗，前景十分广阔。本发明的优点和积极效果本发明提供的抗原在乳腺癌中的表达阳性率高，在正常细胞不表达，因而所提供 的抗原不仅可作为人乳腺癌主动免疫治疗或预防的靶点，也能成为各种免疫导向治疗的靶
点ο该人源乳腺癌抗原本身或其融合蛋白、重组蛋白即可作为乳腺癌诊断药物。采用 该抗原可以利用蛋白杂交或酶联免疫吸附试验等方法检测患者血清或其它体液、分泌液、 器官洗液中相应抗体的含量，根据其相应抗体含量的高低即可对乳腺癌进行初步的诊断。 该人源乳腺癌抗原本身或其融合蛋白、重组蛋白不仅可以作为药物用于诊断，也可以用于 治疗、预防肿瘤的药物。根据该抗原的氨基酸残基序列，可以构建含有前述序列的重组蛋白 或抗原肽，这些重组蛋白或抗原肽激起的人体免疫反应与该人源乳腺癌抗原所激起的免疫 反应相同或极相似。因而该人源乳腺癌抗原本身或其相应的重组蛋白及抗原肽均可以作为 肿瘤疫苗，激起人体抗乳腺癌的免疫反应，加强对乳腺癌细胞的杀伤作用，从而达到预防或 治疗乳腺癌的目的。
图1是人源乳腺癌重组蛋白抗原的基因测序图；图2是检测乳腺癌细胞中Hvl分布状况的免疫组化图，其中A B图显示乳腺癌细 胞被染成褐色，C图显示正常乳腺细胞未被染色。
具体实施方式下面将结合多种实施例来说明本发明所涉及的主题，以及本发明中的新人源乳腺 癌抗原、相应抗体和各种衍生物的具体应用的实施方式。实施例1 新的人源乳腺癌重组蛋白抗原的制备首先设计出新的人源乳腺癌抗原Hvl的c端引物，序列如下C-HvlBamH I-F :5，CGCGGATCC AAGACACGTTCAGAACGGC(SEQ NO. 2)EcoR I-R :5，CGGAATTCCTAGTTCACTTCACCAAGAAG(SEQ NO. 3)通过PCR扩增，双酶切PCR产物和载体pGEX6p_l并回收，连接，得到重组质粒，测 序结果见图1。这个克隆就是含有本发明人源乳腺癌抗原DNA序列的重组表达质粒的克隆， 它命名为 pGEX6p-l-c-Hvl。将 pGEX6p-l-c_Hvl 转化到感受态 E. coli BL21 (DE3)大肠杆 菌，使用0.5mM IPTG诱导剂，进行蛋白表达。通过离子交换柱纯化得到重组蛋白抗原，氨基 酸序列如序列表SEQN0. 1所示。实施例2 抗人源乳腺癌抗原Hvl抗体的制备(一)鼠多克隆抗体采用50ug/每只人源乳腺癌抗原Hvl的重组蛋白抗原混合完全福氏佐剂多点皮下 免疫Balb/c小鼠，10天后采用50ug/每只人源乳腺癌抗原Hvl的重组蛋白抗原混合不完全 福氏佐剂多点皮下第二次免疫Balb/c小鼠。第二次免疫后，间隔一周进行第三次免疫。第 三次免疫后10天采血测效价，当效价>1 106，处死动物采血，采用凝结法收集血清，低速 离心去沉淀。用生理盐水1 2稀释，上Protein A亲和层析柱纯化，pH2. 8的0. IM甘氨 酸缓冲液洗脱，IM Tris中和后对PBS透析3次，检测0D280定抗体含量，获得抗人源乳腺癌 抗原Hvl的鼠多克隆抗体。如果效价< 1 106，则继续免疫至效价> 1 106。(二)小鼠单克隆抗体采用IOOug/只新的人源乳腺癌重组蛋白抗原混合完全福氏佐剂皮下免疫Balb/c 小鼠，4周后采用50ug/每只重组蛋白抗原混合完全福氏佐剂腹腔加强免疫，4周后再次采 用50ug/每只重组蛋白抗原混合完全福氏佐剂腹腔加强免疫，总共3次加强免疫，10天后采 血测效价，当效价>1 106，处死动物，收集脾组织，使其通过100目的筛网分离为单细胞。 采用50%的PEG促融合法将500万脾细胞与100万SP2/0细胞融合，融合后采用HAT培养 基进行筛选培养。培养1周后采用人源乳腺癌重组蛋白抗原包被的ELISA进行筛选，阳性 克隆连续进行亚克隆，筛选稳定分泌特异抗体的克隆，获得抗人源乳腺癌抗原Hvl的鼠单 克隆抗体。实施例3 抗人源乳腺癌抗原Hvl相应抗体衍生物的制备
(一)核素-抗体偶联物(I)188Re标记抗人源乳腺癌抗原Hvl相应小鼠单克隆抗体SnCl2直接还原法标记抗体，立即快速薄层层析(ITLC)测定抗体的标记效率及放 化度。标记后，ITLC实验表明=188Re-抗体标记率为90%，放化纯度大于95%。188Re-抗体 比活为356MBq/mg。ELISA测得188Re-抗体免疫活性为65%。标记抗体的体外稳定性实验 表明，抗体在37°C孵育24小时，无论是在生理盐水还是人血清白蛋白中，放射性脱落都小 于5%，示其在体外稳定。(2) 131I标记抗人源乳腺癌抗原Hvl相应小鼠单克隆抗体氯胺T法标记抗体，立即快速薄层层析(ITLC)测定抗体的标记效率及放化纯度。 标记后，ITLC实验表明131I-抗体标记率为90%，放化纯度大于95%。131I-抗体比活为 74MBq/mg, ELISA 测得 131I-抗体免疫活性 67. 3%。( 二)纳米磁性颗粒_抗体偶联物以纯水将直径约20-50nm的铁氧化物磁性颗粒超声分散，形成胶体状。按0. 2g纳 米磁性颗粒加入16mg抗体的比例加入溶于纯水的抗体，迅速搅拌混合，5min后加入终浓度 为1 %的BSA，离心并采用1 %的BSA洗涤后备用。实施例4 采用电压门控质子通道Hvl的抗体作为药物诊断乳腺癌 采用常规免疫组化方法，石蜡切片，以山羊血清封闭，一抗采用小鼠抗人乳腺癌抗 原Hvl多克隆抗体，二抗采用山羊抗小鼠IgG-HRP，DAB显色，苏木精染。
结果如图2所示，在乳腺癌组织上着色密集，同时在正常的乳腺组织未被染色。这 一区别就可以用于乳腺癌的检测。
权利要求
一种人源乳腺癌抗原，其特征在于该抗原的氨基酸残基序列如序列表1所示。
2.将权利要求1所述的人源乳腺癌抗原的基因克隆入带有正确读码框的原核表达载 体，通过IPTG诱导表达，并进行纯化，可获得该人源乳腺癌重组蛋白抗原。
3.一种含有权利要求1所述编码氨基酸残基序列的重组载体。
4.一种含有权利要求3所述重组载体的宿主大肠杆菌。
5.一类抗权利要求1所述的人源乳腺癌抗原的抗体。
6.根据权利要求5所述的抗体，其特征在于所述的抗体是抗人源乳腺癌抗原的多克隆 抗体、鼠单克隆抗体或抗体片断，以及这些抗体的衍生物，所述的衍生物包括偶联核素的抗 体、偶联化学药物的抗体、偶联脂质体的抗体、融合药物前体酶的抗体以及融合其它效应分 子的抗体。
7.一种获得权利要求6所述抗人源乳腺癌抗原的多克隆抗体的方法，其特征在于采用 权利要求1所述的人源乳腺癌抗原免疫家兔，在检测兔血清中相应的特异抗体的含量后， 处死动物获得抗血清，经过常规的抗体纯化即可获得抗人源乳腺癌抗原的多克隆抗体。
8.一种获得权利要求6所述抗人源乳腺癌抗原的鼠单克隆抗体的方法，其特征在于采 用权利要求1所述的人源乳腺癌抗原免疫Balb/c小鼠，在检测小鼠血清中相应的特异抗体 的含量后，处死动物获得脾细胞，经过与小鼠骨髓瘤细胞SP2/0融合，再经抗原特异性试验 筛选，即可获得鼠单克隆抗体。
9.一种权利要求5所述抗人源乳腺癌抗原的抗体及其衍生物在制备人乳腺癌诊断、治 疗、预防药物中的应用。
全文摘要
一种人源乳腺癌抗原及其抗体。该抗原的氨基酸残基序列如序列表1所示。所述抗原为天然抗原或者重组蛋白抗原。该抗原表达于多数人乳腺癌的癌细胞中，不表达于人正常细胞中，该抗原不仅可作为人乳腺癌主动免疫治疗或预防的靶点，也能成为各种免疫导向治疗的靶点。本发明同时提供了一类抗人源乳腺癌抗原的抗体。所述抗体指抗人源乳腺癌抗原的多克隆抗体、鼠单克隆抗体或抗体片断，以及这些抗体的衍生物，衍生物包括偶联核素的抗体、偶联化学药物的抗体、偶联脂质体的抗体、融合药物前体酶的抗体、融合其它效应分子的抗体等。本发明还提供了抗人源乳腺癌抗原Hv1的抗体及衍生物在制备人乳腺癌诊断、治疗、预防药物中的应用。
文档编号C12N1/21GK101962405SQ201010297418
公开日2011年2月2日 申请日期2010年9月30日 优先权日2010年9月30日 公开号201010297418.发明者李树杰, 潘君成, 王一凡, 王汉中, 赵青 申请人:南开大学 被以下专利引用 (1),