组合使用Cry1Fa和Cry1Ab蛋白用于控制Cry抗性蔗螟和用于甘蔗中的昆虫抗性管理的制作方法

专利名称：组合使用Cry1Fa和Cry1Ab蛋白用于控制Cry抗性蔗螟和用于甘蔗中的昆虫抗性管理的制作方法
组合使用CryIFa和CryIAb蛋白用于控制Cry抗性蔗螟和用于甘蔗中的昆虫抗性管理
背景技术：
人们每年要花费数十亿美元用于控制害虫，并且它们还会造成另外数十亿美元的损失。合成的有机化学杀虫剂为用于控制害虫的主要工具，但是在一些区域，生物杀虫剂，例如来自苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis) (Bt)的杀虫蛋白，发挥着重要的作用。通过转化Bt杀虫蛋白基因产生昆虫抗性植物的能力给现代农业带来了革命，并提高了杀虫蛋白及其基因的重要性和价值。已经有数种Bt蛋白用于产生抗昆虫的转基因植物，它们现在已经被成功地注册并商业化。这些包括谷物/玉米(corn)中的CrylAb, CrylAc, CrylF和Cry3Bb,棉花中的CrylAc和Cry2Ab,和马铃薯中的Cry3A。
表达这些蛋白的商业产品表达单一的蛋白，但是在如下情况下例外，即期望2种蛋白的组合杀虫谱(例如在玉米中组合CrylAb和Cry3Bb以分别提供对鳞翅目害虫和食根昆虫的抗性)，或者蛋白的独立作用使它们可用作在易感昆虫群体中延迟抗性产生的工具(例如在棉花中组合CrylAc和Cry2Ab以提供对烟草青虫(tobacco budworm)的抗性管理)。也就是说，昆虫抗性转基因植物的一些品质虽然使这种技术被快速而广泛地采用，但是也带来了担忧，即害虫群体可能对这些植物所产生的杀虫蛋白产生抗性。已经提出了多种策略用于防止(preserve)基于Bt的昆虫抗性性状的效用，包括以高剂量使用蛋白质并与庇护所组合，不同毒素交替使用或者共使用(McGaughey等.(1998)，“B.t. Resistance Management,，，Nature Biotechnol. 16:144-146)。被选择用于IRM混杂的蛋白质需要独立地发挥其杀虫效果，从而对一种蛋白质产生的抗性不会赋予对第二种蛋白质的抗性(即对于蛋白质无交叉抗性)。如果例如选择对“蛋白A”有抗性的害虫群体对“蛋白B”敏感，则我们可以得出结论，蛋白A和蛋白B无交叉抗性并且它们的组合可有效延迟对单一蛋白A的抗性。当没有抗性昆虫群体时，可以基于假定与作用机制和交叉抗性潜力相关的其它特征进行评估。已经有提议使用受体介导的结合来鉴定可能不会显示交叉抗性的杀虫蛋白(van Mellaert等1999)。在这种方法中固有的缺少交叉抗性的关键预测子(predictor)是杀虫蛋白在敏感昆虫物种中不会竞争受体。在两种B. t. Cry毒素竞争相同受体的情况下，如果昆虫中的受体发生突变使得毒素之一不再与该受体结合从而对该昆虫不再具有杀虫性，则也可能的情况是昆虫对第二种毒素(其竞争性结合相同的受体)也有抗性。然而，如果两种毒素结合两种不同的受体，这可以指示昆虫不会同时对这两种毒素具有抗性。CrylFa可用于控制许多鳞翅目害虫物种，包括欧洲玉米螟(ECB; Ostrinianubilalis (Hiibner))和秋粘虫(FAW; Spodoptera frugiperda)，并且对鹿螟(SCB; Diatraeasaccharalis)有活性。CrylFa蛋白，如在含有事件TC1507的谷物/玉米植物中产生的，负责用于FAW控制的工业领先的昆虫抗性性状。CrylFa进一步被配置在Hereulex ，SmartStax 和WideStrike 产品中。使用CrylFa蛋白进行(竞争性或同源性)受体结合研究的能力受到了限制，因为可以获得的用于标记蛋白以在受体结合测定法中进行检测的常用技术会趋于使CrylFa蛋白的杀虫活性失活。CryIAb和CryIFa是目前在转基因谷物/玉米中(分开)使用的用于保护植物免于多种害虫的杀虫蛋白。这些蛋白提供保护的谷物/玉米中的关键害虫是欧洲玉米螟(ECB)。US 2008/0311096部分地涉及使用CrylAb控制CrylF抗性ECB群体。

发明内容
本发明部分地涉及令人惊讶的发现，即CrylFa对于针对CrylAb有抗性的蔗螟(SCB)群体非常有活性。本领域的技术人员会意识到这一公开的益处，产生CrylFa和CrylAb (包括其杀虫部分)的甘蔗植物可用于延迟或防止SCB对这些杀虫蛋白单独的任何 一个产生抗性。发明详沭本发明部分地涉及令人惊讶的发现，即CrylFa对于针对CrylAb有抗性的鹿螟(SCB;Diatraea saccharalis)群体非常有活性。因此，本发明部分地涉及令人惊讶的发现，即在甘蔗中CrylFa可用于与CrylAb组合或“混杂”，从而阻止SCB对这些杀虫蛋白的任何单独一个产生抗性。换言之，本发明部分地涉及令人惊讶的发现，即选择对CrylAb有抗性的鹿螟群体对CrylFa无抗性；对CrylAb毒素有抗性的鹿螟对CrylFa易感(即无交叉抗性)。因此，本发明包括在甘蔗中使用CrylFa毒素控制对CrylAb有抗性的蔗螟群体。本领域的技术人员会意识到本公开的益处,表达crylFa和cryIAb (包括其杀虫部分)的甘蔗植物可用于延迟或防止对这些杀虫蛋白的任何单独一个产生抗性。本发明包括使用CrylFa和CrylAb保护甘鹿免于由鹿螟或者由已经对CrylAb产生抗性的蔗螟群体导致的损害和收得率损失(yield loss)。因此,本发明教导了一种IRM混杂，用以减缓(mitigate)鹿螟对CrylAb和/或CrylFa产生抗性。部分地基于本文所描述的数据，在甘蔗中共表达CrylFa和CrylAb基因能够产生高剂量的用于控制SCB的IRM混杂。也可以向本组合添加其它的蛋白质以增加抗虫谱(spectrum)。这些数据提示，CrylFa可有效控制已经对CrylAb产生抗性的SCB群体。一种应用选择是在已经由于产生了抗性而使CrylAb不能有效控制SCB的地域使用这些Cry蛋白。另一种应用选择是将这些Cry蛋白中的一种或两种与CrylAb组合使用，从而减缓SCB对CrylAb产生抗性。本发明的嵌合毒素包括B. t.毒素的完整核心N-端毒素部分，并且在毒素部分末端之后的某点，蛋白质具有向异源原毒素(protoxin)序列的转变。B. t.毒素的N端毒素部分在本文称作“核心”毒素。向异源原毒素区段的转变可以发生在毒素/原毒素连接点附近，或者可选择地，天然原毒素的一部分(延伸越过毒素部分)可以被保留，而向异源原毒素的转变发生在其下游。
作为实例，本发明的一种嵌合毒素具有CrylAb的完整核心毒素部分(氨基酸1-601)和异源原毒素(氨基酸602至C端)。在一个优选实施方案中,包含原毒素的嵌合毒素的部分源自CrylAb蛋白毒素。作为第二个实例，本发明的第二种嵌合毒素具有CrylCa的完整核心毒素部分(氨基酸1-619)和异源原毒素(氨基酸620至C端)。在一个优选实施方案中，包含原毒素的嵌合毒素的部分源自CrylAb蛋白毒素。(上述也可应用于CrylFa杀虫蛋白。)除非另外指出，可以如US 2008/0311096所述获得序列。本领域的技术人员会意识到，B. t.毒素，甚至在某种类型的毒素例如crylFa或CrylAb中，可以在一定程度上改变长度以及从毒素部分向原毒素部分转变的确切位置。通常，crylFa毒素长度为大约1150-大约1200个氨基酸。从毒素部分向原毒素部分的转变通常发生在全长毒素的大约50%-大约60%。本发明的嵌合毒素包括该核心N端毒素部分的完整区域(expanse)。因此,嵌合毒素包括全长crylFa或CrylAb B. t.毒素的至少大约50%。这通常为至少大约590个氨基酸。关于原毒素部分，cryIA(b)原毒素部分的完整区 域从毒素部分的末端延伸到该分子的C端。这一部分的最后大约100-150个氨基酸是最关键的，应包含在本发明的嵌合毒素中。基因和毒素根据本发明，有用的基因和毒素不仅包括公开的全长序列，还包括保留了本文特别例示的毒素的特征杀虫活性的这些序列的片段、变体、突变体和融合蛋白。如本文所使用的，术语基因的“变体”或“变异”是指编码相同毒素或者编码具有杀虫活性的等价毒素的核苷酸序列。如本文所使用的，术语“等价毒素”是指对靶害虫具有与所要求保护的毒素相同或基本上相同的生物活性的毒素。如本文所使用的，边界表示大约95% (CrylAb和IFa的)、78% (CrylA和CrylF的)和 45%(Cryl 的)序列同一性，参见 “Revision of the Nomenclature for theBacillus thuringiensis Pesticidal Crystal Proteins, , N. Crickmore, D. R. Zeigler, J.Feitelson, E. Schnepf, J. Van Rie, D. Lereclus, J. Baum,和 D. H. Dean. Microbiology andMolecular Biology Reviews (1998) Vol 62:807-813。这些截断值(cut offs)也可仅应用于核心毒素(对于CrylAb和CrylFa毒素)。本领域的技术人员应当显而易见，编码活性毒素的基因可以通过多种手段鉴定和获得。本文例示的特定基因或基因部分可以从在培养物保藏中心保藏的分离物获得，如上所述。这些基因或其部分或变体也可以通过例如使用基因合成仪合成构建。基因的变异可以使用用于制备点突变的标准技术容易地构建。另外，这些基因的片段可使用商业上可获得的外切核酸酶或内切核酸酶根据标准的程序进行制备。例如，可以使用酶如Bal31或定点诱变从这些基因的末端系统地切除核苷酸。另外，编码活性片段的基因可使用多种限制酶获得。可以使用蛋白酶直接获得这些毒素的活性片段。保留例示的毒素的杀虫活性的片段和等价物也在本发明的范围内。另外，由于遗传密码的冗余性，多种不同的DNA序列可编码本文公开的氨基酸序列。本领域的技术人员完全可以生成这些编码相同的或者基本上相同的毒素的可替换的DAN序列。这些变体DNA序列也在本发明的范围内。如本文所使用的，“基本上相同的”序列是指具有不会实质上影响杀虫活性的氨基酸取代、缺失、添加或插入的序列。保留了杀虫活性的片段也包含在这个定义内。另一种用于鉴定根据本发明有用的编码毒素的基因和基因部分的方法是通过使用寡核苷酸探针。这些探针是可检测的核苷酸序列。这些序列可以通过用合适的标记加以检测或者可制成固有地发荧光，如国际申请No. W093/16094中所述。如本领域众所熟知的，如果探针分子与核酸样品通过在两分子之间形成强键而杂交，则有理由假定，探针和样品具有相当的同源性。优选地，杂交通过本领域众所周知的技术在严格条件下进行，如例如在Keller, G. H. , M. M. Manak(1987)DNA Probes, Stockton Press, New York, N. Y. , pp. 169-170中所述。盐浓度和温度组合的一些实例如下(按照严格性增强的顺序)2X SSPE或SSC在室温；1X SSPE 或 SSC 在 42°C ；0. IX SSPE 或 SSC 在 42°C ；0. IX SSPE 或 SSC 在 65°C。探针的检测提供了一种用已知的方式确定杂交是否发生的方法。这种探针分析提供了用于鉴定本发明毒素编码基因的快速方法。根据本发明用作探针的核苷酸区段可以用DNA合成仪和标准的步骤合成。这些核苷酸序列也可以用作PCR引物以扩增本发明的基因。本文特别例示了本发明的某些毒素。因为这些毒素仅仅是本发明毒素的实例，因此应当显而易见，本发明包括具有与例示毒素相同或相似杀虫活性的变体或等价毒素(和编码等价毒素的核苷酸序列)。等价毒素与例示毒素具有氨基酸同源性。该氨基酸同源性通常为大于75%，优选大于90%，最优选大于95%。氨基酸同源性在毒素的关键区域最高，所述关键区域决定其生物活性或者涉及最终负责生物活性的三维构型的确定。在此方面，某 些氨基酸取代是可以接受的，并且如果这些取代位于对于活性非关键的区域内或者是不影响分子三维构型的保守氨基酸取代的话，其是可以预期的。例如，氨基酸可以在下面的分类中被替换非极性、极性不带电荷、碱性和酸性。只要取代不会实质改变化合物的生物活性，一个类型的氨基酸被相同类型的另一种氨基酸代替的保守取代就属于本发明的范围。表I提供了属于每种类型的氨基酸的实例的列表。
氨基酸类型氨基酸实例
非极性Ala, Val, Leu, He, Pro, Met, Phe, Trp
极性不带电荷Gly，Ser, Thr, Cys, Tyr, Asn, Gln
酸性Asp, Glu
碱性Lys，Arg, His在一些情况下，也可以进行非保守取代。关键的因素是这些取代不会显著降低毒素的生物活性。重组宿主。编码本发明毒素的基因可以被引入到很多种微生物或植物宿主内。毒素基因的表达直接或间接地导致细胞内产生和保持杀虫剂。交配转移和重组转移可用于产生表达本发明两种毒素的B.t.株。其它的宿主生物体也可以用一种或两种毒素基因转化，然后用于实现协同效应。通过合适的微生物宿主例如假单胞菌属(Pseudomonas),可以将微生物施加到害虫位置，并在那里增殖和被摄取。结果是控制害虫。可选择地，具有毒素基因的微生物可以在使毒素的活性延长并使细胞稳定的条件下被处理。然后将保留毒性活性的经处理的细胞施加到靶害虫的环境中。
当藉由合适的载体将B.t.毒素基因引入到微生物宿主中，并将所述宿主以存活状态施加于环境时，重要的是应使用某些宿主微生物。选择已知占据一种或多种目标作物的“植物圈”(叶面(phylloplane)、叶围(phyllosphere)、根围(rhizosphere)和 / 或根面(rhizoplane))的微生物宿主。选择这些微生物使得能够与野生型微生物成功地竞争特定的环境(作物或其它昆虫栖息地)，以提供稳定地保持和表达可表达多肽杀虫剂的基因，并且理想地，提供使杀虫剂免于环境降解和失活的改进的保护。已知大量的微生物在多种重要作物的叶面(植物叶子的表面)和/或根围(围绕植物根系的土壤)栖息。这些微生物包括细菌、藻类和真菌。特别感兴趣的是微生物，如细菌例如假单胞菌属、欧文氏菌属(Erwinia)、沙雷氏菌属(Serratia)、克雷伯氏菌属(Klebsiella)、黄单抱菌属(Xanthomonas)、链霉菌属(Streptomyces)、根瘤菌属(Rhizobium)、红假单细胞属(Rhodopseudomonas)、嗜甲基菌属(Methylophilius)、土壤杆菌属(Agrobactenum)、醋酸杆菌属(Acetobacter)、乳杆菌属(Lactobacillus)、节杆菌属(Arthrobacter)、固氮菌属(Azotobacter)、明串球菌属(Leuconostoc)和产碱菌属(Alcaligenes);真菌，特别是酵母，例如酵母属(Saccharomyces)、隐球菌属(Cryptococcus)、克鲁维酵母属(Kluyveromyces)、掷抱酵母属(Sporobolomyces)、红酵母 属(Rhodotorula)和短梗霉属(Aureobasidium)。特别感兴趣的是如下的植物圈细菌物种，如丁香假单胞菌(Pseudomonas syringae)、突光假单胞菌(Pseudomonas fIuorescens) >粘质沙雷氏菌(Serratia marcescens)、木醋酸杆菌(Acetobacter xylinum)、根癌土壤杆菌(Agrobacterium tumefaciens)、浑球红假单胞菌(Rhodopseudomonas spheroides)、野油菜黄单抱菌(Xanthomonas campestris)、苜猜根瘤菌(Rhizobium melioti)、真养产喊菌(Alcaligenes entrophus)和维捏兰德固氮菌(Azotobacter vinlandii);和植物圈酵母物种，如深红酵母(Rhodotorularubra)、粘红酵母(R. Glutinis)、海洋红酵母(R. Marina)、澄红酵母(R. aurantiaca)、浅白隐球菌(Cryptococcus albidus)、流散隐球菌(C. diffluens)、罗伦特隐球菌(C. Laurentii)、罗斯酵母(Saccharomyces rosei)、有抱酵母(S. pretoriensis)、酿酒酵母(S. cerevisiae)、玫瑰掷抱酵母(Sporobolomycesroseus)、香味掷抱酵母(S. odorus)、维罗纳克鲁维酵母(Kluyveromyces veronae)和出芽短梗霉(Aureobasidium pullulans)。特别感兴趣的是染色的微生物(pigmentedmicroorganisms)。可以获得大量的方法用于将编码毒素的B. t.基因在允许所述基因稳定保持和表达的条件下引入到微生物宿主中。这些方法是本领域技术人员众所周知的，并且例如在美国专利No. 5，135，867中描述，该专利通过提述并入本文。细胞的处理。可以对表达B.t.毒素的苏云金芽孢杆菌或重组细胞进行处理以延长毒素活性和稳定细胞。在将所形成的杀虫微囊施于靶害虫的环境时，所述微囊将B. t.毒素包含于已稳定化的细胞结构内并保护所述毒素。合适的宿主细胞可以包括原核生物或真核生物，通常被限制于那些不会对高等生物如哺乳动物产生实质毒性的细胞。然而，当毒性物质不稳定或者施加水平足够低以至可以避免对哺乳动物宿主的任何可能的毒性时，也可以使用会产生对高等生物有毒性的物质的生物。作为宿主，特别感兴趣的是原核生物和低等真核生物，如真菌。尽管在一些情况下可以采用孢子，但是在处理时，细胞通常是完整的并且基本上处于可增殖的形式，而不是处于孢子形式。微生物细胞(例如含有B.t.毒素基因的微生物)的处理可以通过化学或物理手段进行，或者通过化学和/或物理手段的组合进行，只要该技术不会有害地影响毒素的性质并且不会消除细胞保护毒素的能力即可。化学试剂的实例是卤化剂，特别是原子序号17-80的卤素。更特别地，碘可以在温和的条件下使用足够长的时间以获得期望的结果。其它合适的技术包括醒处理，如戍二醒；抗感染剂处理，如氯化苯甲烃铵(zephiranchloride)和氯化十六烧卩比唳(cetylpyridinium chloride);醇处理,如异丙醇和乙醇；多种组织固定剂处理，如Lugol碘、布安氏固定剂(Bouin’ s fixative)、多种酸和海利氏固定剂(Helly’ s fixative)(参见Humason, Gretchen L. , Animal Tissue Techniques, ff.H. Freeman and Company, 1967);或物理(加热)和化学剂的组合,它们在把细胞施加于宿主环境时可以保留和延长细胞内产生的毒素的活性。物理手段的实例为短波辐射，如Y-辐射和X-辐射、冷冻、UV照射、冷冻干燥等。用于处理微生物细胞的方法在美国专利No. 4，695，455和4，695，462中公开，所述专利通过提述并入本文。 细胞一般具有更强的结构稳定性，可提高对环境条件的抗性。当杀虫剂处于原型(proform)时,所选的细胞处理方法应当不抑制杀虫剂被祀害虫病原体从原型加工成成熟形式。例如，甲醛会交联蛋白质并可抑制多肽杀虫剂原型的加工。处理的方法应当能够保留至少相当部分的毒素的生物可用性或生物活性。出于生产目的在选择宿主细胞时特别感兴趣的特征包括将B. t.基因引入宿主的便宜性,表达系统的可用性,表达效率,杀虫剂在宿主体内的稳定性,和附加遗传能力的存在性。用作杀虫剂微囊的感兴趣特征包括对杀虫剂的保护质量，如厚细胞壁、染色和细胞内包装或形成包涵体；在含水环境中的存活；缺乏哺乳动物毒性；吸引害虫摄食；容易杀死和固定而不会伤害毒素；等等。其它的考虑包括配制和操作的便宜性、经济性、储存稳定性等。细胞生长。含有B. t.杀虫基因的细胞宿主可以在任何常规的营养培养基中生长，其中DNA构建体提供选择优势，提供选择性培养基使得基本上全部或者全部的细胞保留 B. t.基因。然后可以根据常规方法收获这些细胞。可选择地，细胞可以在收获之前被处理。产生本发明毒素的B.t.细胞可以用标准技术培养基和发酵技术培养。当完成发酵循环时，可以首先通过本领域众所周知的手段将B.t.孢子和结晶与发酵液分离来收获细菌。回收的B.t.孢子和结晶可以通过添加表面活性剂、分散剂、惰性载体和其它有利于操作和施用于特定靶害虫的组分配制成可润湿的粉末、液体浓缩物、颗粒或其它配制物。这些配制物和施用步骤是本领域众所周知的。配制物。含有引诱剂和B.t.分离物孢子、结晶和毒素的配制的诱饵颗粒，或者含有可以从本文公开的B. t.分离物中获得的基因的重组微生物，可施于土壤。配制的产品也能够作为种子包被或根处理或全植物处理在作物周期(crop cycle)的晚期施加。B. t.细胞的植物和土壤处理可以作为可润湿的粉末、颗粒或尘埃通过与多种惰性材料混合而加以利用，所述惰性材料如无机矿物质(层状硅酸盐、碳酸盐、硫酸盐、磷酸盐等)或植物材料(粉末状玉米穗轴、稻壳、核桃壳等)。配制物可以包括展布剂-粘着剂佐剂(spreader-sticker adjuvant)、稳定剂、其它杀虫添加剂或表面活性剂。液体配制物可为基于水的或非水的，并作为泡沫、凝胶、悬浮液、可乳化的浓缩物等利用。成分可以包括流变剂、表面活性剂、乳化剂、分散剂或聚合物。
本领域的技术人员会意识到，杀虫剂浓度可以变化很大，取决于特定制剂的性质，特别是它是否是浓缩的或者是否直接使用。杀虫剂以按重量计至少1%存在，并可为按重量计100%。干燥配制物中具有按重量计约1-95%的杀虫剂，而液体配制物一般为在液相中按重量计约1-60%的固体。配制物一般具有大约IO2 (10. sup. 2)-大约IO4 (10. sup. 4)个细胞/mg。这些配制物以每公顷大约50mg(液体或固体)至Ikg或者更多施用。所述配制物可通过喷雾、扬尘、撒布(sprinkling)等向鳞翅类害虫的环境(例如叶子或土壤)中施加。
植物转化。用于产生本发明杀虫蛋白的优选重组宿主是转化的植物。编码如本文公开的Bt毒素蛋白的基因可以用多种本领域众所周知的技术插入植物细胞。例如，可以获得大量含有在大肠杆菌中的复制系统和允许选择转化细胞的标记的克隆载体，用于将外源基因插入高等植物。所述载体包括例如pBR322、pUC系列、M13mp系列、pACYC184等。因此，具有编码Bt毒素蛋白序列的DNA片段可在合适限制位点插入所述载体。最终的质粒可用于转化入大肠杆菌(E. Coli)。大肠杆菌细胞在合适的营养介质中培养,然后收获和裂解。回收质粒。作为分析方法，通常进行序列分析、限制分析、电泳和其它生物化学-分子生物学方法。在每个操作后，可以将所用的DNA序列切割并连接到下一个DNA序列。每个质粒序列可以克隆于相同和其它的质粒中。根据将期望基因插入植物的方法，其它的DNA序列可为必需的。如果例如使用Ti或Ri质粒用于转化植物细胞，那么至少Ti或Ri质粒T-DNA的右边界，但常常是左右两个边界，必须连接作为待插入基因的侧翼区。用于转化植物细胞的T-DNA的使用已经被广泛研究，并充分描述于EP 120516, Lee和Gelvin (2008)，Hoekema(1985) ,Fraley等(1986)，和An等(1985)中有，并且在本领域已经被良好建立。一旦所插入的DNA被整合于植物基因组中，就会相对稳定。转化载体通常含有选择标记，其赋予转化的植物细胞对杀生物剂或抗生素(如双丙氨磷、卡那霉素、G418、博来霉素或潮霉素等)的抗性。因此，单独使用的标记应当允许选择转化的细胞，而非不含插入DNA的细胞。大量的技术可用于将DNA插入植物宿主细胞。这些技术包括使用根癌土壤杆菌或毛根土壤杆菌(Agrobacterium rhizogenes)作为转化剂的T-DNA转化、融合、注射、生物射弹(biolistics)(微粒子轰击)或电穿孔以及其它可能的方法。如果使用土壤杆菌转化，则待插入的DNA必须被克隆入特殊的质粒，即克隆入中间载体或者克隆入二元载体中。中间载体可以通过同源重组整合入Ti或Ri质粒，归因于与T-DNA中的序列同源的序列。Ti或Ri质粒还包括T-DNA转移必需的vir区(vir region)。中间载体自身在土壤杆菌中不能复制。中间载体可以通过辅助质粒(接合)转移到根癌土壤杆菌中。双元载体自身能够在大肠杆菌和土壤杆菌属中复制。它们包括选择标记基因和被T-DNA左右边界区框定的接头或多接头。它们能够被直接转化进入土壤杆菌属(Holsters等，1978)。用作宿主细胞的土壤杆菌属包括携带致病区的质粒。该致病区是将T-DNA转移入植物细胞所必需的。可以含有额外的T-DNA。使用如此转化的细菌转化植物细胞。可以有利地用根癌土壤杆菌或毛根土壤杆菌培养植物外植体，用于将DNA转入植物细胞。然后在含有用于筛选的杀生物剂或抗生素的合适培养基中从感染的植物材料(例如叶片、茎杆区段、根，还有原生质体或悬浮培养的细胞)再生整个植物。然后测试如此获得的植物是否存在插入的DNA。在注射和电穿孔的情况中，对质粒没有特殊的要求。可以使用普通的质粒，例如PUC衍生物。
被转化的细胞以通常的方式在植物内生长。它们能够形成生殖细胞并将转化的性状传递到后代植物。这些植物可以正常的方式生长并与具有相同转化遗传因子和其它遗传因子的植物杂交。所得的杂交个体具有相应的表型特征。在本发明的一个优选实施方案中，用其中密码子选择已对植物进行优化的基因转化植物。参见，例如美国专利No. 5380831，其通过提述并入本文。虽然本文例示了一些截短的毒素，但是在Bt领域中众所周知的是，130kDa型(全长)毒素具有作为核心毒素的N端半部和作为原毒素“尾”的C端半部。因此，适当的“尾”可与本发明的截短/核心毒素一起使用。参见，例如美国专利No. 6218188和美国专利No. 6673990。此外，用于生成在植物中使用的合成Bt基因的方法是本领域已知的(Stewart和Burgin, 2007)。优选的转化植物的一个非限制性实例是能育的玉米植物，其包含编码CrylFa蛋白的植物可表达基因，并进一步包含编码CrylAb蛋白的第二植物可表达基因。将CrylAb和CrylFa性状转移(或渐渗)到近交(inbred)玉米种系中可以通过轮回选择育种，例如通过回交实现。在这种情况下，期望的轮回亲本首先与携带赋予CrylAb和CrylFa性状的合适基因的近交供体(非轮回亲本)杂交。然后将该杂交的后代与轮回 亲本回交，其后选择所得后代的从非轮回亲本转移来的期望性状。在与轮回亲本回交3个，优选4个，更优选5个或更多个世代并对期望性状进行选择后，后代在控制被转移性状的座位(loci)处是杂合体，但在大多数或者基本上全部的其它基因处则与轮回亲本相似(参见，例如 Poehlman &Sleper (1995) Breeding Field Crops,第 4 版，172-175; Fehr (1987)Principles of Cultivar Development,第 I 卷:Theory and Technique,360-376)。昆虫抗件管理(IRM)策略。例如Roush等概述了(outline)双毒素策略，也称作“锥形”或“混杂”，用于管理杀虫转基因作物。(The Royal Society. Phil. Trans. R. Soc.Lond.B. (1998)353,1777-1786)。美国环境保护局在其网站上针对转基因作物的使用为提供非转基因避难所(非-Bt作物/谷物/玉米的块状地(blocks))给出了如下的指导。(epa. gov/oppbppdl/biopesticides/pips/bt_corn_refuge_2006. htm)针对抗玉米螟Bt (CrylAb和CrylF)谷物/玉米产品的具体结构要求(structuredrequirement)如下结构避难所在谷物/玉米带中，20%非鳞翅类Bt谷物/玉米避难所；在棉花带中，50%非鳞翅类Bt避难所。块状地(blocks)内部(即在Bt田地内)外部(即Bt田地1/2英里(如果可能1/4英里)内的分离田地使随机配合最大化)田地内的条带条带必须至少4行宽(优选6行)以降低幼虫运动效应。美国玉米生产者协会在其网站上(ncga.com/insect-resistance-management-fact-sheet-bt-corn)也提供了关于避难所要求的相似指导。例如玉米螟IRM的要求_(避难所)种植在至少20%的玉米田亩以避免杂交-在产棉区,避难所必须为50%
_(避难所)必须种植在避免杂交的1/2英里内-避难所可以在Bt田内成条状种植；避难所条带必须至少4行宽-只有对于靶昆虫达到了经济阈值时才可以用常规的杀虫剂处理避难所-基于Bt的可喷洒杀虫剂不能用在避难所玉米上-在每一块具有Bt玉米的农场上必须种植适当的避难所
如Roush等所述(例如在1780和1784页右栏)，混杂或锥形混杂可允许使用更小的避难所。Roush建议，对于成功的混杂，大约10%的避难所即可与大约30-40%的避难所相当(或略低)。任何上面的百分比(如lF/lAb的百分比)或者相似的避难所比例可用于在甘蔗中的本双重或三重混杂或锥形混杂。存在提供避难所的多种方法，包括田地内的多种几何种植模式(如上所述)和包装好(in-bag)的种子混合物,如Roush等(前文)和美国专利No. 6，551，962中进一步讨论的。本文提及或引用的所有专利、专利申请、临时申请和出版物通过提述以其全部内容并入，其程度为它们与本说明书的明确教导没有不一致。下面的实施例说明了本发明。这些实施例不应当认为是限制性的。
实施例实施例I -总结-CrylAb易感和抗性鹿螟对CrylFa苏云金芽孢杆菌Cry蛋白的响应CrylFa 蛋白已证明对鹿螟(Diatraea saccharalis)的 Bt 易感株(Bt-SS)和 Bt抗性株(Bt-RR)均有杀虫活性。蔗螟(D. Saccharalis)的Bt-RR株已证明对胰蛋白酶活化的CrylAb蛋白具有142倍的抗性。此鹿螟Bt抗性株显示一些对CrylFa的交叉抗性,但是抗性比例显著降低(4倍)。结果提示，CrylFa可以在蔗螟和其它玉米螟物种中有效地管理CrylAb 抗性。实施例2 -材料和方法苏云金芽孢杆菌Cry蛋白纯化的胰蛋白酶活化苏云金芽孢杆菌(Bt)CrylAb蛋白从Case Western ReserveUniversity, Cleveland, Ohio,生物化学系 Marianne Puztai-Carey 博士获得。CrylFa 由Dow AgroSciences Company (Indianapolis, IN)提供，置于缓冲液中。CrylAb 是冻干的，纯度为99. 9%。昆虫来源鹿螟的Bt 易感株(Bt-SS)用 2004 年从 Northeast Louisiana 中 Winnsboro 附近的玉米田收集的幼虫建立。蔗螟的Bt抗性株(Bt-RR)用F2筛选从单个等-种系家族产生。这些Bt抗性昆虫在商业CrylAb玉米杂交种上完成幼虫发育，并显示对纯化的胰蛋白酶活化的CrylAb毒素具有显著的抗性水平。在确认Bt抗性期间，Bt抗性株的个体与Bt易感株的个体回交，并在回交的F2世代中用CrylAb玉米叶组织对抗性重新选择。昆虫生物测定法蔗螟的Bt-SS和Bt-RR株对CrylAb和CrylFa的幼虫易感性用饮食并入规程(dietincorporation procedures)加以确定。在每一个生物测定法中，使用6或7个Cry蛋白浓度。Bt浓度的范围对于测定CrylAb蛋白为0. 03125至32 y g/g，对于评价CrylFa为0. 03125至128ii g/g。Cry蛋白溶液是通过将Bt蛋白与适量蒸馏水混合(用于测定CrylAb)，或者与缓冲液混合(用于检测CrylFa)制备的。然后在将饮食分散入128孔板(128-cell trays) (Bio-Ba-128，C_D International, Pitman, NJ)的各个孔之前将 Bt 溶液与半人工(meridic)饮食混合。在生物测定法中，用IOml注射器(Becton, Dickinson和Company, Franklin Lakes, NJ)将大约0. 7ml经过处理的饮食置于每个孔内。仅用蒸懼水(空白对照)或缓冲液处理的饮食用作对照处理。在每个孔的饮食表面上释放一个新生 24h)的鹿螟。幼虫接种后，用通风盖(vented lids) (C-DInternational, Pitman, NJ)覆盖孔。将生物测定板置于保持28 °C，50%RH和16:8(L:D)h光周期的环境室内。在接种后第7天记录幼虫死亡率、幼虫重量和没有显示体重增加(〈0. Img/幼虫)的存活幼虫的数目。昆虫株与Cry蛋白浓度的每个组合重复4次，每个重复有16至32个幼虫。数据分析幼虫死亡率标准以“实际”死亡率测量，其同时考虑实际死亡的幼虫和不显示体 重显著增加(〈0. Img/幼虫)的存活幼虫作为病态或无进食昆虫。一种处理中，蔗螟的实际死亡率用如下的公式计算实际死亡率(%) =IOOx[死亡幼虫数目+不显示体重显著增加(〈0. Img/幼虫)的存活幼虫数目]/测试昆虫的总数。每个蔗螟株的“实际”死亡率(下文简称为死亡率)相对于饲以非处理对照饮食(用于分析CrylAb)或仅用缓冲液处理的饮食(用于评价CrylFa)的幼虫死亡率进行修正。然后对经过修正的剂量/死亡率数据进行机率分析，用于确定导致50%(LC5(i)死亡率值的Cry蛋白浓度和相应的95%置信区间(Cl)。在机率分析中使用的处理包括产生零死亡率的最高浓度、导致100%死亡率的最低浓度，和这些极限之间的所有结果。通过将Bt-RR昆虫的LC5tl值除以Bt-SS株的LC5tl值计算抗性比例。用致死剂量比例检验(lethal dose ratio test)确定抗性比例在a =0. 05水平是否显著。并使用双向(two-way) ANOVA分析死亡率数据，随后用LSMEANS检验在a =0. 05水平确定处理的差异。饲以CrylAb蛋白饮食的蔗螟的幼虫生长抑制用下式计算幼虫生长抑制(%) =IOOx(用非处理的对照饮食饲育的幼虫体重-用Bt饮食饲育的幼虫体重)/(用非处理的对照饮食饲养的幼虫体重)；而对于分析CrylFa，其用下式计算幼虫生长抑制(%) =IOOx (用仅用缓冲液处理的对照饮食饲育的幼虫体重-用Bt饮食饲育的幼虫体重)/(用仅用缓冲液处理的对照饮食饲育的幼虫体重)。如果没有体重显著增加(〈0. Img/幼虫)的幼虫，则指定该重复(实验)为100%的幼虫生长抑制。生长抑制数据用双向ANOVA进行分析，以昆虫株和Cry蛋白浓度作为两个主要因子。使用LSMEANS检验确定a =0. 05水平的处理差异。图和表中提供了非转化的数据。实施例3-结果饲以Cry蛋白处理的饮食的蔗螟Bt-SS和Bt-RR株的幼虫死亡率CrylAb蛋白(图I) =CrylAb蛋白浓度对蔗螟Bt-SS和Bt-RR株的幼虫死亡率均有显著影响(F=90. 67;df=6, 42;P<0. 0001)(图I)。幼虫死亡率随着CrylAb浓度增加而提高。在0. 031 ii g/g或更高浓度观察到Bt-SS株的显著水平的幼虫死亡率，在32 ii g/g死亡率达到接近100%。对于Bt-RR株，显著的死亡率在2 u g/g时发生，在32 ii g/g时达到61%。两个昆虫株之间观察到幼虫死亡率的相当大的差异(F=346. 73，df. =1，42，P〈0. 0001)。在所有CrylAb测试浓度下，Bt-RR株的幼虫死亡率均显著(P〈0. 05)低于Bt-SS昆虫的。昆虫株和浓度之间的相互作用也显著(F=18. 82;df=6, 42;P<0. 0001)。随着CrylAb浓度增加，Bt-RR株幼虫死亡率增加得比Bt-SS株的更缓慢。基于Bt-SS和Bt-RR株的幼虫死亡率计算的LC5tl值分别为0. 13和18. 46 ii g/g (表I)。根据致死剂量比例检验，两株之间的LC5tl的142倍差异是显著的(P〈0. 05)。Cryl Fa蛋白(图2) =CrylFa蛋白被证明具有杀虫活性并且仅有一些交叉抗性。Cry蛋白浓度对蔗螟Bt-SS和Bt-RR株的幼虫死亡率均有显著影响(F=251. 78; df=8, 54; P〈0. 0001)。对于 Bt-SS 株在 0. 125 u g/g,对于 Bt-RR 株在 0. 5 u g/g观察到显著水平的幼虫死亡率，并在8 ii g/g对于两株的死亡率均达到100%。两个昆虫株的幼虫死亡率的差异也是显著的(F=11.82;df. =1，54;P=0. 0011)。在0. 125，0. 5和2 y g/g，Bt-RR株具有显著(P〈0.05)低于Bt-SS株的死亡率。昆虫株和浓度的相互作用也是显著的(F=8. 61;df=8, 54;P<0. 0001)。一般地，在〈8y g/g 的 Cry 蛋白浓度，Bt-RR 株的幼虫 死亡率增加得比Bt-SS株的更缓慢。基于Bt-SS和Bt-RR株的幼虫死亡率计算的LC5tl值分别为0. 29和I. 15 U g/g (表I)。基于致死剂量比例检验，两株之间的LC5tl的4倍差异是统计上显著的(P〈0.05)。饲以Cry蛋白处理的饮食的蔗螟的幼虫生长抑制CrylAb蛋白(图3):饲以CrylAb处理的饮食的蔗螟Bt-SS和Bt-RR株的幼虫生长抑制在不同浓度之间有显著差异(F=175. 07;df=5, 36;P<0. 0001)。随着CrylAb浓度增力口，Bt-SS和Bt-RR幼虫的生长下降。昆虫株对于生长抑制的影响在Bt-SS和Bt-RR株之间有显著差异(F=I 182. 51;df=l, 36;P<0. 0001)。在所有测试的Bt浓度，Bt-SS株的幼虫生长抑制均显著大于Bt-RR株。在最低测试浓度0. 031 ii g/g的浓度，Bt-RR没有显示任何生长抑制，但是Bt-SS幼虫与对照相比具有>90%的生长抑制。在0. 5 ii g/g, Bt-RR显示27%的生长抑制，而Bt-SS幼虫的生长则接近完全停止。昆虫株与Bt浓度的相互作用也是显著的(F=IlO. 72;df=5, 36;P<0. 0001)。随着CrylAb浓度增加，Bt-RR株的幼虫生长抑制增加得比Bt SS株的更缓慢。CrylFa蛋白(图4):饲以CrylFa蛋白处理的饮食的鹿螟Bt-SS和Bt-RR昆虫株的幼虫生长抑制在不同浓度之间有显著差异(F=301.69;df=7，48;P〈0. 0001)。在0. 125，0. 5和2 u g/g浓度，Bt-SS的生长抑制均显著大于(P〈0. 05) Bt-RR幼虫的。昆虫株对生长抑制的影响在两种昆虫株之间有显著差异(F=45. 88;df=l, 48;P<0. 0001)，并且昆虫株与Bt浓度的相互作用也是显著的(F=18. 38; df=7, 48; P〈0. 0001)。Bt-SS株的生长抑制增加得比Bt-RR株的更快。在0.03125 ii g/g观察到两种昆虫株的显著的幼虫生长抑制。Bt-SS株的生长在2 ii g/g完全抑制；而对于Bt-RR株,这发生在8 ii g/g。参考文献Finney, D. J. 1971. Probit analysis. Cambridge University Press, England.Huaj G.，L. Masson, J. L. Jurat-Fuentes，G. Schwab,和 M. J. Adang. Bindinganalyses of Bacillus thuringiensis Cry d-endotoxins using brush bordermembrane vesicles of Ostrinia nubilalis. Applied and Environmental Microbiology67 [2]，872-879. 2001.
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权利要求
1.一种甘蔗植物，包含编码CrylFa杀虫蛋白的DNA和编码CrylAb杀虫蛋白的DNA。
2.权利要求I的甘蔗植物，其中编码含CrylFa核心毒素的蛋白质的DNA和编码含CrylAb核心毒素的蛋白质的DNA被渐渗(introgressed)到所述甘鹿植物中。
3.权利要求I的植物的部分。
4.权利要求I的植物的扦插(cutting)或克隆后代。
5.一种植物田，包含非Bt避难所植物和多个权利要求I的甘蔗植物，其中所述避难所植物在所述田地中占全部植物的少于40%。
6.权利要求5的植物田，其中所述避难所植物在所述田地中占全部作物植物的少于30%。
7.权利要求5的植物田，其中所述避难所植物在所述田地中占全部作物植物的少于20%。
8.权利要求5的植物田，其中所述避难所植物在所述田地中占全部作物植物的少于10%。
9.权利要求5的植物田，其中所述避难所植物在所述田地中占全部作物植物的少于5% o
10.权利要求5的植物田，其中所述避难所植物成块状或条带状种植。
11.权利要求5的植物田，其中所述甘蔗占地超过10英亩。
12.权利要求I的甘蔗植物，其中所述CrylFa蛋白与SEQID NO: I至少99%相同，并且所述CrylAb蛋白与SEQ ID NO: 2至少99%相同。
全文摘要
本发明包括用于控制蔗螟(SCB)昆虫的方法和甘蔗植物，所述甘蔗植物包括含有Cry1Fa和Cry1Ab核心毒素的蛋白质的组合，以延迟或防止SCB产生抗性。
文档编号C12N15/82GK102753694SQ201080063815
公开日2012年10月24日 申请日期2010年12月16日 优先权日2009年12月16日
发明者J.J.希茨, K.纳瓦, N.P.斯托尔, S.L.伯顿, T.米德 申请人:陶氏益农公司