专利名称：一种高分子冷凝聚法制备萝卜几丁质结合蛋白的方法
一种高分子冷凝聚法制备萝卜几丁质结合蛋白的方法
技术领域：
本发明涉及一种高分子冷凝聚法制备萝卜几丁质结合蛋白的方法。背景技术：
萝卜几丁质结合蛋白(Raphanus sativus L Chitin—binding protin，缩写 R CBP，萝卜CBP)是一种能与几丁质特异结合的蛋白质，业已证明它具有杀菌作用(华南农业大学学报，1997，18(4) :72 75)我们研究了该种蛋白质的抑菌谱较广，对白色葡萄球菌(Staphylococcus)、金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、枯草杆菌 (Bacillus Subti 1 is (Ehrenberg) Cohn)等 G+菌和变形杆菌(ProteusbacillusVulgaris) > 大肠杆菌(Escherichia Cdi)、鼠伤寒沙门氏杆菌(Salmonellatyphimwium)、多杀巴斯德氏杆菌(Pastewella multaida)、鸡白痢沙门氏菌(Salmnella)、产气杆菌 (Enterobacteratrogenes)等 G-菌以及酵母(SaccharomyceScerevisiae)，总状毛霉 (Mucor racemosus)、里根霉、黑曲霉(Aspergillus niger)、青霉等真菌都有消杀效果。 1 ]^, ^^ ^:^^! ' (Frwinia carovorasubsp)(Citrus, Baterial lanker Disease)、番爺青枯病菌(RalstoniaSalanacearum)、禾苗癌病菌(magnaporthe grisea), 7^ M^L ^'M M (RhizoctoniasolaniAG-1 ΙΑ)、 f /]、3 _ 胃(Drechslera maydis)、香蕉枯萎病菌(俗称香蕉癌症,Fusarium oxyporumsp. cubense)等植(作)物病原菌都有良好的杀菌作用。这与目前市售溶菌酶完全不同，目前市售溶菌酶它们只对革兰氏阴性(G_)菌起作用，而对革兰氏阳性(G+)菌、真菌都不起作用。萝卜CBP的分子组成、结构和特性具有以下特点①是一种单成分单体酶，而且是一种诱导酶；②是一种相对分子质量较小(11. 4KD左右)的碱性蛋白质；③是一种既具有溶酶活力，又具有几丁质酶的双功能酶蛋白；④其双功能酶活力在0_60°C，pH2. 4-10. O范围内活力稳定，在室温下两年内活力基本稳定；⑤在一定条件下，其酶蛋白结晶为长方形。活性中心包括有Glu、Asp、His和Trp 残基。这与动、微生物的酶不同，它多了一个Hi s和Trp残基；也与其它植物溶菌酶不同，它有一个Trp和His残基，却没有Cys残基，故抑菌效果不同；⑥它还与其它溶菌酶和几丁质酶不同，它不是糖蛋白，不含任何链内和链间二硫键，所以酶活性稳定，抑菌效果明显；⑦其N-端氨基酸残基顺序为WDADMVAKUM，对此序列进行Blastp搜集，结果发现， 在现有数据库中没有任何与其相匹配的有关信息。肽质量指纹图谱分析鉴定，结果发现，在现有蛋白质数据库中也没有任何与其相匹配的有关信息。从而证明它是一种新发现的既具溶菌酶又具几丁质酶活性的几丁质结合蛋白。依据其分子组成、性质及其结构特征，以及杀菌效果，尤其对G—菌，特别是对真菌灭菌效果更为强烈，该萝卜CBP具有广泛的应用价值和良好的市场前景和潜力。在医药上， 抗真菌药极少，抗生素由于微生物的抗药性和对机体的毒副作用，限制了其应用；在农业上，农作物病害90%以上是真菌引起的，由于农药的残留和对环境的污染，也限制了应用， 同样在食品、日化、禽畜养殖的防病抗病等行业，萝卜CBP用途极广，有待开发利用。萝卜在我国各地均能种植，尤在岭南等地一年四季均可柿种，萝卜几丁质结合蛋白的生产制备原料广泛、价廉，但酶含量低，现有制备工艺较复杂，难以实现工业化。聚丙烯胶(polycrylic Acid, PAA)是以游离单体丙烯酸聚合而成的高分子化合
物
-fCH2——CHir COOH随其聚合度不同相对分子质量而异。PAA无毒、易溶于水，为多聚电介质。在工业上常用作分散剂。
发明内容本发明的目的是提供一种高分子冷凝聚法制备萝卜几丁质结合蛋白的方法，工艺较简单，易于实现工业化，能较低成本且无环境污染。上述目的通过以下技术方案实现一种高分子冷凝聚法制备萝卜几丁质结合蛋白的方法，其特征在于，包括以下步骤1)材料取萝卜洗净，用刀将其表皮砍伤，在16_20°C下诱导4-7天，使其染菌，以诱导酶的合成，增加酶含量；2)提取用5-lOmmol/L NaHCO3水溶液为提取液，取两份等体积的提取液，每份提取液的体积与材料的质量比为1 ；取一份提取液和材料勻浆，得第一勻浆液，离心，收集第一上清液；再将其残渣和另一份提取液勻浆，得第二勻浆液，离心，收集第二上清液；合并第一上清液和第二上清液；3)选择性热变性将上述合并的上清液在反应罐内搅拌加热至50_55°C，并维持 4-6min，然后离心再收集第三上清液；4)超过滤浓缩将第三上清液超过滤排除相对分子质量5000以下的可溶性物质， 浓缩至原体积的1/3，得浓缩液；5)冷凝反应于上述浓缩液中，搅拌加入体积与上述浓缩液体积比为 0.5% -0. 8%的PAA，加毕转至低温5 °C _10°C下，冷凝反应M小时至48小时，反应式 PAA+R · CBP — PAA-R · CBP丨，得冷凝物，进行离心，得沉淀物PAA-R · CBP ；6)置换于 PAA-R .CBP 中，在搅拌下加入含有 80-120mmol/L CaCl2 和 5_10mmol/ L NaHC03的混合溶液，PAA-R · CBP的质量与混合溶液的体积的比为1 16-17，反应式为 PAA-R.CBP+Ca2+-PAA-Ca2+丨+R *CBP，进行离心，收集第四上清液，冷冻干燥得酶粉，沉淀物为 PAA-Ca2+。步骤5)中的PAA的加入量为PAA体积与所述浓缩液体积比为0. 5 %。步骤6)中的CaCl2的质量浓度为100mmol/L。
步骤6)中混合溶液的加入量为混合溶液的体积与PAA-R · CBP的质量的比值为 16. 78。还包括步骤7)于PAA-Ca2+中力Π入80-120mmol/L H2SO4溶液，反应式 PAA-Ca2++S042" — PAA+CaS04丨，离心出去沉淀，以回收PAA。本发明的优点本发明的工艺生产设备投资少，工艺简单，易于实现工业化生产；反应产物PAA-Ca2+可通过使用H2SO4溶液将PAA回收再利用，降低了成本，无环境污染。
图1为本发明的工艺流程图；图2为PAA加入量对酶活力的影响的示意图；图3为Ca2+浓度对酶活力的影响的示意图；图4为Ca2+溶液体积对酶活的影响的示意图。
具体实施方式如图1所示，取萝卜洗净，用刀将其表皮砍(l-2cm)伤，在16_20°C下诱导5天，取 IOOkg诱导后的萝卜，切碎，边勻浆边加入100L 5mmol/L NaHCO3溶液勻浆，得第一勻浆液， 第一勻浆液用管式离心机进行离心(HOOOr/min，室温)，得第一上清液约175L;残渣加入 100L5mmol/L NaHCO3溶液勻浆，得第二勻浆液，第二勻浆液进行离心(同上)，得第二上清液105L ；合并第一上清液和第二上清液(约^OL)，残渣干晒(烘)用作饲料；将上述合并的上清液(PH约为4. 5-5. 0)转入反应罐搅拌加热至50°C，保持5min，进行离心(同上)，收集第三上清液；将第三上清液泵入超过滤器超过滤(排除相对分子质量5000以下的可溶性物质)浓缩至原体积1/3(约95L)，得浓缩液；将浓缩液转入反应罐，搅拌下加入与上述浓缩液体积比(PAA体积浓缩液体积)为0. 5%的PAA，转入保鲜冰柜，于5°C _10°C下冷凝聚 24h,反应式PAA+R · CBP — PAA-R · CBP丨，得冷凝物；将冷凝物进行离心(同上)，收集沉淀物PAA-R · CBP约10. 4kg ；于沉淀物PAA-R · CBP中，在搅拌下加入17L的含有IOOmmol/ L CaCl2和5mmol/L NaHCO3的混合溶液，进行离心(同上)，收集第四上清液(R · CBP溶液)，冷冻干燥得2. 3kg酶粉(即R · CBP粉)，沉淀物为PAA-Ca2+ ；于沉淀物PAA-Ca2+中加入80-100mmol/L H2SO4溶液，反应式PAA-Ca2++S042_ — PAA+CaS04丨，至沉淀先完全溶解再析出大量沉淀(对于H2SO4溶液的适宜用量，本领域技术人员能控制)，离心(同上)除去沉淀，以回收PAA。R · CBP的分离纯化结果如表一。表一
权利要求
1.一种高分子冷凝聚法制备萝卜几丁质结合蛋白的方法，其特征在于，包括以下步骤1)材料取萝卜洗净，用刀将其表皮砍伤，在16-20°c下诱导4-7天，使其染菌，以诱导酶的合成，增加酶含量；2)提取用5-lOmmol/LNaHCO3水溶液为提取液，取两份等体积的提取液，每份提取液的体积与材料的质量比为1 1 ；取一份提取液和材料勻浆，得第一勻浆液，离心，收集第一上清液；再将其残渣和另一份提取液勻浆，得第二勻浆液，离心，收集第二上清液；合并第一上清液和第二上清液；3)选择性热变性将上述合并的上清液在反应罐内搅拌加热至50-55°C，并维持 4-6min，然后离心再收集得第三上清液；4)超过滤浓缩将第三上清液超过滤排除相对分子质量5000以下的可溶性物质，浓缩至原体积的1/3，得浓缩液；5)冷凝反应于上述浓缩液中，搅拌加入体积与上述浓缩液体积比为 0.5% -0.8%的PAA，加毕转至低温5°C -10 °C下，冷凝反应M小时至48小时，反应式 PAA+R · CBP — PAA-R · CBP丨，得冷凝物，进行离心，得沉淀物PAA-R · CBP ；6)置换于PAA-R · CBP 中，在搅拌下加入含有 80-120mmol/L CaCl2 禾口 5_10mmol/ L NaHCO3的混合溶液，PAA-R · CBP的质量与混合溶液的体积的比为1 16-17，反应式为 PAA-R.CBP+Ca2+-PAA-Ca2+丨+R *CBP，进行离心，收集第四上清液，冷冻干燥得酶粉，沉淀物为 PAA-Ca2+。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤幻中的PAA的加入量为PAA体积与所述浓缩液体积比为0.5%。
3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，步骤6)中的CaCl2的质量浓度为 1OOmmol/L。
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，步骤6)中混合溶液的加入量为混合溶液的体积与PAA-R · CBP的质量的比值为16. 78。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，还包括步骤7)于PAA-Ca2+中加入 80-120mmol/L H2SO4 溶液，反应式=PAA-Ca2^SOf — PAA+CaS04 I，离心出去沉淀，以回收 PAA。
全文摘要
本发明涉及一种高分子冷凝聚法制备萝卜几丁质结合蛋白的方法，利用PAA+R·CBP→PAA-R·CBP↓和PAA-R·CBP+Ca2+→PAA-Ca2+↓+R·CBP的原理，以萝卜为材料，经诱导、提取、选择性热变性、超过滤浓缩、冷凝反应和置换，提纯获得R·CBP粉。本发明的工艺生产设备投资少，工艺简单，易于实现工业化生产；反应产物PAA-Ca2+可通过使用H2SO4溶液将PAA回收再利用，降低了成本，无环境污染。
文档编号C12N9/00GK102174483SQ201110033110
公开日2011年9月7日 申请日期2011年1月30日 优先权日2011年1月30日
发明者徐凤彩, 程京燕, 胡永刚, 苏保荣 申请人:珠海市御品堂生物科技有限公司