专利名称：一种鲜鹿茸酶降解提取有效成分的方法
技术领域：
本发明属于鲜鹿茸酶降解提取有效成分的方法，涉及一种利用Alcalase碱性蛋白酶直接降解鲜鹿茸提取有效成分的方法。
背景技术：
鹿茸是指雄性梅花鹿或马鹿未骨化的角组织，是著名的传统中药材，含有磷脂、糖脂、胶脂、激素、脂肪酸、氨基酸、维生素、蛋白质及钙、磷、镁、纳等[1]成份。近年来采用冷冻干燥法分离出一些活性物质，鹿茸中含有多种生理活性成分[2]，如神经生长因子、表皮生长因子、胰岛素样生长因子、转化生长因子及鹿茸多肽等。依据其溶解性分为水溶性、脂溶性、 和不溶性物质；水溶性物质中主要包括19种氨基酸、多肽、蛋白质，粘多糖、粘蛋白、氨基己糖和葡萄糖。脂溶性物质主要是磷脂、留体化合物、脂肪酸、中性脂、维生素类和前列腺素等；不溶性物质主要包括硬蛋白和胶原蛋白等物质。鹿茸性温而不燥，对全身虚弱、久病之后患者，有较好的保健作用[3]_[4]。因此由其提取的鹿茸素含有多种生物活性物质，能够促进机体的生长发育和新陈代谢，增强机体的免疫功能，具有壮肾阳，益精血，强筋骨等特殊功效。鹿茸素是鹿茸中的活性成份的总称。鹿茸素在食品、医药、保健、美容化妆品的应用随着人们生活水平的提高有不断上升的趋势，市场销售前景十分广阔。目前提取鹿茸素的方法主要有⑴乙醇提取法[5]_[6]采用乙醇提取鹿茸素，乙醇用量为10倍量时，出膏率为5%，醇提物中只含有17KD以下的多肽。⑵酸提法盐酸提取鹿茸多糖操作比较复杂[7]，一般需要反复多次提取，酸提法获得的鹿茸提取物中的活性成分含量低，且含有一些不易被人体吸收的物质，如蛋白质等大分子物质。( 超临界CO2萃取法[8_1(|]超临界(X)2萃取技术是纯物理方式提取鹿茸中活性物质，具有无毒、环保、萃取时间短、产品质量高等特点，但鹿茸中活性物质提取率也只有10%，而且设备投资费用大，成本高。概括而言，目前提取鹿茸素的方法主要存在操作复杂、提取率低、提取的有效成分不完全的缺点，难以满足当今市场对鹿茸素的需求。
发明内容
本发明的目的是针对上述已有技术的不足，提供一种鲜鹿茸酶降解提取有效成分的方法，具体涉及一种利用Alcalase碱性蛋白酶直接降解鲜鹿茸提取有效成分的方法。本发明的方法反应条件温和、操作简单、鹿茸的全部有效成分都能被充分提取利用。本发明的技术方案包括以下操作步骤(1)鲜鹿茸经燎毛、洗净，在4 6°C的条件下机械切成片状；(2)取切成片状的鲜鹿茸，按底物浓度为0. 05g/mL 0. 20g/mL的比例加入缓冲溶液，用胶体磨粉碎至微米级，调PH值为7 10，按切成片状的鲜鹿茸重量的0. 01 0. 03倍加入Alcalase碱性蛋白酶，在温度为50°C 70°C条件下降解池 8h，降解过程保持pH 值恒定，降解后90-95°C加热15min，将Alcalase碱性蛋白酶灭活；所用缓冲溶液为pH值为 9 12的碳酸钠缓冲溶液、乳酸钠-氢氧化钠缓冲溶液或碳酸氢钠缓冲溶液；(3)用滤纸或离心过滤去除鲜鹿茸降解后的残渣物，收集滤液，将得到的滤液减压蒸馏，浓缩，获得鹿茸的生物活性物质的浓缩液；鲜鹿茸经Alcalase碱性蛋白酶降解处理后，其降解率为82% 93% ；(4)将过滤得到的鲜鹿茸降解后的残渣物烘干；(5)将已处理好的氢型732强酸性阳离子交换树脂装入两支串联的柱子里，将步骤(3)的获得鹿茸的生物活性物质的浓缩液调pH值为2-5后上柱，吸附3- ，用蒸馏水洗脱，至收集液使茚三酮显阳性，再用洗脱剂洗脱至使茚三酮显阴性，得到鹿茸有效成分氨基酸；收率达到12%以上；所述的洗脱剂为NH4Cl溶液、NH4Ac溶液或NH3. H2O ；氢型732强酸性阳离子交换树脂的处理方法为将树脂置于其两倍量的浓度为26. 5%的食盐溶液中浸泡18-20小时，然后放尽食盐水，用清水漂洗净，使排出水不带黄色；再用与食盐溶液量相同的浓度为 2% -4%的NaOH溶液浸泡2_4小时，或作小流量清洗，放尽碱液后，用清水冲洗树脂直至排出水接近中性为止，最后用与食盐溶液量相同的浓度为5%的HCL溶液浸泡4-8小时，放尽酸液，用清水漂流至中性待用。有益效果本发明提供一种鲜鹿茸酶降解提取有效成分的方法，鲜鹿茸经 Alcalase碱性蛋白酶降解处理后，获得鹿茸的生物活性物质的浓缩液，其降解率为82% 93% ；获得鹿茸的生物活性物质的浓缩液中，经分析含有脂肪酸、磷脂、留体化合物、糖类、 微量元素等多种有效成分，所有的有机质都变成了易于人体吸收的溶液状态，可用于制药、 保健品、食品、化妆品诸多方面；用Alacalase碱性蛋白酶降解鲜鹿茸，鲜鹿茸降解后的残渣物为鹿茸钙化物质及无机元素等，可用作良好的饲料添加剂；鹿茸的生物活性物质的浓缩液分离纯化后得到纯度为97%的氨基酸产品为重要的营养品，氨基酸的收率达到12% 以上。本发明的反应条件温和、操作简单、鹿茸的全部有效成分都能被充分利用，提高了鹿茸的应用价值和经济效益，能够解决目前市场上鹿茸素供不应求的局面。
图1. 1是本发明的鲜鹿茸酶解产物中氨基酸的HPLC图。1.天冬氨酸Asp，2.谷氨酸Glu，3.丝氨酸kr，4.苏氨酸Thr，5.精氨酸Arg，6.丙氨酸Ala，7.脯氨酸ftx)，8.缬氨酸Val，9.甲硫氨酸Met，10.异亮氨酸Ile，ll.亮氨酸Leu，12.苯丙氨酸Wie，13.组氨酸 His, 14.赖氨酸Lys，15.酪氨酸Tyr。图1.2是17种氨基酸混合标准溶液HPLC图。1.天冬氨酸Asp，2.谷氨酸Glu，3.丝氨酸kr，4.甘氨酸Gly，5.苏氨酸Thr，6.精氨酸Arg，7.丙氨酸Ala，8.脯氨酸ftx)，9.缬氨酸Val，10.甲硫氨酸Met，11.半胱氨酸Cys，12.异亮氨酸Ile，13.亮氨酸Leu，14.苯丙氨酸Wie，15.组氨酸His，16.赖氨酸Lys，17.酪氨酸Tyr。通过图1. 1与图1. 2的对比，可以得出本发明的鹿茸酶降解产物中含有精氨酸、赖氨酸、亮氨酸等15种氨基酸。图2是本发明的鲜鹿茸酶解产物中氨基酸的红外光谱图。由图2可以看出吸收峰为3414. 96的官能团为氨基，在氨基酸的红外光谱上，没有典型的羧基(-C00H)伸展吸收峰127501^-17000^1,而只有-COO负离子的伸展吸收峰ΙθδΟαι^-ΙΜδαιΓ1，因此可以判断图中的吸收峰16 . 49979CHT1是由羧基产生的，而且杂质峰很少，本发明的方法分离的混合氨基酸纯度也很高，可达97%。
具体实施例方式实施例1 本发明的技术方案包括以下操作步骤(1)鲜鹿茸经燎毛、洗净，在4 6°C的条件下机械切成片状；(2)取15. Olg切成片状的鲜鹿茸，放入500mL烧杯中，按底物浓度为0. lg/mL的比例加入乳酸钠-氢氧化钠缓冲溶液，用胶体磨粉碎至微米级，调PH值为8. 5，按切成片状的鲜鹿茸重量的0. 02倍加入Alcalase碱性蛋白酶，在温度为65°C条件下降解6h，降解过程保持PH值恒定，降解后95°C加热15min，将Alcalase碱性蛋白酶灭活；所用缓冲溶液为pH 值为9 12的NH3. H2O ；(3)用滤纸或离心过滤去除鲜鹿茸降解后的残渣物，收集滤液，将得到的滤液减压蒸馏，浓缩，获得鹿茸的生物活性物质的浓缩液；鲜鹿茸经Alcalase碱性蛋白酶降解处理后，其降解率为93% ；(4)将过滤得到的鲜鹿茸降解后的残渣物烘干；(5)将已处理好的氢型732强酸性阳离子交换树脂装入两支串联的柱子里，将步骤(3)的获得鹿茸的生物活性物质的浓缩液调pH值为2后上柱，吸附3- ，用蒸馏水洗脱， 至收集液使茚三酮显阳性，再用洗脱剂洗脱至使茚三酮显阴性，得到鹿茸有效成分氨基酸； 收率达到12%以上；所述的洗脱剂为NH4Cl溶液、NH4Ac溶液或NH3. H2O ；氢型732强酸性阳离子交换树脂的处理方法为将树脂置于其两倍量的浓度为26. 5%的食盐溶液中浸泡18-20小时，然后放尽食盐水，用清水漂洗净，使排出水不带黄色；再用与食盐溶液量相同的浓度为 2% -4%的NaOH溶液浸泡2_4小时，或作小流量清洗，放尽碱液后，用清水冲洗树脂直至排出水接近中性为止，最后用与食盐溶液量相同的浓度为5%的HCL溶液浸泡4-8小时，放尽酸液，用清水漂流至中性待用。实施例2-6的条件如表1，其余的同实施例1。表权利要求
1.一种鲜鹿茸酶降解提取有效成分的方法，其特征在于包括以下步骤(1)鲜鹿茸经燎毛、洗净，在4 6°C的条件下机械切成片状；(2)取切成片状的鲜鹿茸，按底物浓度为0.05g/mL 0. 20g/mL的比例加入缓冲溶液， 用胶体磨粉碎至微米级，调PH值为7 10，按切成片状的鲜鹿茸重量的0. 01 0. 03倍加入Alcalase碱性蛋白酶，在温度为50°C 70°C条件下降解池 8h，降解过程保持pH值恒定，降解后90-95°C加热15mindfAlcalase碱性蛋白酶灭活；所用缓冲溶液为pH值为9 12的碳酸钠缓冲溶液、乳酸钠-氢氧化钠缓冲溶液或碳酸氢钠缓冲溶液；(3)用滤纸或离心过滤去除鲜鹿茸降解后的残渣物，收集滤液，将得到的滤液减压蒸馏，浓缩，获得鹿茸的生物活性物质的浓缩液；(4)将过滤得到的鲜鹿茸降解后的残渣物烘干；(5)将已处理好的氢型732强酸性阳离子交换树脂装入两支串联的柱子里，将步骤(3) 的获得鹿茸的生物活性物质的浓缩液调PH值为2-5后上柱，吸附3-他，用蒸馏水洗脱，至收集液使茚三酮显阳性，再用洗脱剂洗脱至使茚三酮显阴性，得到鹿茸有效成分氨基酸；所述的洗脱剂为NH4Cl溶液、NH4Ac溶液或NH3. H2O ；氧型732强酸性阳离子交换树脂的处理方法为将树脂置于其两倍量的浓度为26. 5%的食盐溶液中浸泡18-20小时，然后放尽食盐水，用清水漂洗净，使排出水不带黄色；再用与食盐溶液量相同的浓度为2% -4%的 NaOH溶液浸泡2-4小时，或作小流量清洗，放尽碱液后，用清水冲洗树脂直至排出水接近中性为止，最后用与食盐溶液量相同的浓度为5%的HCL溶液浸泡4-8小时，放尽酸液，用清水漂流至中性待用。
2.如权利要求1所述的一种鲜鹿茸酶降解提取有效成分的方法，其特征在于所述的(2)底物浓度为0. 01g/mL,调pH值为8. 5，按切成片状的鲜鹿茸重量的0. 02倍加入 Alcalase碱性蛋白酶，在温度为65°C条件下降解他，缓冲溶液为乳酸钠-氢氧化钠缓冲溶液；(5)将步骤(3)的获得鹿茸的生物活性物质的浓缩液调pH值为2后上柱，吸附4h，所述的洗脱剂为NH3. H2O ；其余的同权利要求1。
3.如权利要求1所述的一种鲜鹿茸酶降解提取有效成分的方法，其特征在于所述的(2)底物浓度为0. 05g/mL,调pH值为7. 5，按切成片状的鲜鹿茸重量的0. 01倍加入 Alcalase碱性蛋白酶，在温度为50°C条件下降解池，缓冲溶液为碳酸钠缓冲溶液；( 将步骤(3)的获得鹿茸的生物活性物质的浓缩液调pH值为2后上柱，吸附池，所述的洗脱剂为 NH4Cl溶液；其余的同权利要求1。
4.如权利要求1所述的一种鲜鹿茸酶降解提取有效成分的方法，其特征在于所述的 (2)底物浓度为0. 08g/mL，调pH值为8. 0按切成片状的鲜鹿茸重量的0. 015加入Alcalase 碱性蛋白酶，在温度为条件下降解4h，缓冲溶液为碳酸氢钠缓冲溶液；( 将步骤(3) 的获得鹿茸的生物活性物质的浓缩液调PH值为3上柱，吸附4h，所述的洗脱剂为NH4Ac溶液；其余的同权利要求1。
5.如权利要求1所述的一种鲜鹿茸酶降解提取有效成分的方法，其特征在于所述的 (2)底物浓度为0. 10g/mL，调pH值为8. 5按切成片状的鲜鹿茸重量的0. 02加入Alcalase 碱性蛋白酶，在温度为60°C条件下降解5h，缓冲溶液为碳酸钠缓冲溶液；(5)将步骤⑶的获得鹿茸的生物活性物质的浓缩液调PH值为4上柱，吸附4h，所述的洗脱剂为NH3. H2O ；其余的同权利要求1。
6.如权利要求1所述的一种鲜鹿茸酶降解提取有效成分的方法，其特征在于所述的 (2)底物浓度为0. 15g/mL,调pH值为9. 0按切成片状的鲜鹿茸重量的0. 025加入Alcalase 碱性蛋白酶，在温度为65°C条件下降解6h，缓冲溶液为碳酸钠缓冲溶液；(5)将步骤⑶的获得鹿茸的生物活性物质的浓缩液调PH值为5上柱，吸附他，所述的洗脱剂为NH3. H2O ；其余的同权利要求1。
7.如权利要求1所述的一种鲜鹿茸酶降解提取有效成分的方法，其特征在于所述的 (2)底物浓度为0. 20g/mL,调pH值为9. 5按切成片状的鲜鹿茸重量的0. 030加入Alcalase 碱性蛋白酶，在温度为70°C条件下降解他，缓冲溶液为碳酸钠缓冲溶液；( 将步骤(3)的获得鹿茸的生物活性物质的浓缩液调PH值为4上柱，吸附池，所述的洗脱剂为NH4C溶液； 其余的同权利要求1。
全文摘要
本发明提供一种鲜鹿茸酶降解提取有效成分的方法。鲜鹿茸经Alcalase碱性蛋白酶降解处理后，获得鹿茸的生物活性物质的浓缩液，其降解率为82％～93％；获得鹿茸的生物活性物质的浓缩液中，含有脂肪酸、磷脂、甾体化合物、糖类、微量元素等多种有效成分，所有的有机质都变成了易于人体吸收的溶液状态，可用于制药、保健品、食品、化妆品诸多方面；用Alacalase碱性蛋白酶降解鲜鹿茸，鲜鹿茸降解后的残渣物为鹿茸钙化物质及无机元素等，可用作良好的饲料添加剂；鹿茸的生物活性物质的浓缩液分离纯化后得到纯度为97％的氨基酸产品为重要的营养品，氨基酸的收率达到12％以上。本发明的反应条件温和、操作简单、鹿茸的全部有效成分都能被充分利用，提高了鹿茸的应用价值和经济效益。
文档编号C12P13/04GK102286561SQ20111019177
公开日2011年12月21日 申请日期2011年7月11日 优先权日2011年7月11日
发明者张龙, 王兰兰 申请人:长春工业大学