专利名称：生产稳定性同位素碳13全标记l型亮氨酸的发酵工艺的制作方法
技术领域：
本发明属于稳定性同位素标记化合物生产领域；涉及到微生物发酵生产工艺，尤其是涉及一种生产稳定性同位素碳13全标记L型亮氨酸的发酵工艺。
背景技术：
L-亮氨酸-U-13C6的生产可采用有机合成法、前体发酵法、酶法及提取法、直接发酵法等。采用合成法工艺繁琐，且合成得到的是消旋的DL型亮氨酸-U-13C6,需要光学拆分才能得到目标物L-亮氨酸-U-13C6,使13C原料利用率大大降低，成本上升。水解法常用于制备复合氨基酸，要分开所有氨基酸很困难。酶法生产L-亮氨酸-U-13C6需要α-氧代己酸、 甲酸铵-1 作为原料，最终产量不是很高，且原料甲酸铵-1 价格昂贵，不易得。而采用普通直接发酵法生产，目标氨基酸大量富集，分离相对简单，但由于种子、发酵配方中添加多种有机碳源，且这些有机碳源一般多为混合物，很难标记，常常使得到的L-亮氨酸-13C产品的丰度下降很多，达不到产品要求，而如果不添加这些物质，菌种的产酸水平又会大大降低，使生产成本急剧上升，如果采用常规发酵方法稳定性同位素标记L-亮氨酸产量虽然相对较高，但1 丰度下降很大，往往下降3%以上，很难达到高丰度产品要求。且由于要添加大量1Y葡萄糖，成本很高。采用全合成培养基发酵虽然对"C丰度影响不大，但产酸量太低使得"C原料利用率不高。因此，筛选适用于L-亮氨酸-U-13C6生产的工艺条件是该技术的关键。目前， 在碳13标记领域中还未见相关产品的生产方法专利和文献报道。
发明内容
本发明的目的就是为了克服上述现有技术存在的缺陷而提供一种可使"C原料得到有效利用，又可使丰度下降很少，以致在不影响丰度的情况下实现高产的生产稳定性同位素碳13全标记L型亮氨酸的发酵工艺。本发明的目的可以通过以下技术方案来实现生产稳定性同位素碳13全标记L型亮氨酸的发酵工艺，采用摇瓶发酵或发酵罐发酵对菌体进行发酵培养后，再经分离提取得到同位素碳13全标记L型亮氨酸。所述的菌体适用于L型亮氨酸生产的棒杆菌、短杆菌属，并能采用强制控制工艺控制其细胞膜通透性，包括黄色短杆菌、钝齿棒杆菌、大肠杆菌、粘质赛氏杆菌或谷氨酸棒杆菌。所述的摇瓶发酵包括以下步骤将菌体接种于活化培养基平板上，30°C下生化培养箱中培养16-30小时，待长成菌落后，将菌落接种于事先灭菌完的发酵培养基中，每瓶发酵培养基接一环菌体，发酵培养基的装液量为一个500ml三角瓶装20-60ml发酵培养基，将接种完的发酵培养基置于摇摆式摇床上，控制发酵温度25-35°C，摇床转速180-240转/分钟，连续发酵72-96小时。所述的发酵罐发酵包括以下步骤
(1)将菌体接种于活化培养基平板上，30°C下生化培养箱中培养16-30小时，待长成菌落后将菌落接种于已灭菌的装有种子培养基的摇瓶中，在下摇床培养IO-M 小时，获得种子液；(2)发酵初始温度25-35 °C，初始pH6. 8-7. 2，采用大接种量(2-lOwt % )、低糖流加、强制控制发酵工艺，将种子液按2-10% (体积比)接种于已灭菌的装有发酵培养基的发酵罐中开始发酵，控制温度25-37 °C，通气量0. 5-1. 5VVM，罐压0. 01-0. 05MPa,溶解氧5-30% (体积比)，pH为6. 5-7. 5，并以消泡剂消泡，发酵全过程用添加液氨控制pH 在7. 0-7. 5，并且流加50wt%的"C葡萄糖，控制发酵液"C葡萄糖浓度3-6wt%，发酵时间 32-70小时。所述的活化培养基平板采用斜面活化培养基，该斜面活化培养基的配方包括葡萄糖l_5g/l、蛋白胨5-15g/l、牛肉膏3-15g/l、氯化钠l_10g/l、琼脂15_30g/l，用 2mol/l氢氧化钠调节pH = 6. 5-8. 0，在110_130°C高压灭菌锅中灭菌10-20分钟。所述的发酵培养基以13C葡萄糖为碳源，初始配方中13C葡萄糖浓度为； 以氯化铵、硫酸铵、硝酸铵、醋酸铵或尿素中的一种或几种为初始氮源，浓度为2-5wt%，发酵中后期添加尿素、氨水或液氨调节PH来补充氮源，添加高丰度菌体水解液作为有机碳源和氮源，添加量为0. 2-2wt%。不添加或添加极微量玉米浆、酵母膏、蛋白胨有机碳源，单独添加一种即可，添加量在0. 2wt%以下，根据不同菌种添加磷酸盐、镁盐、锰盐和亚铁盐，添加纯生物素 10-50ug/L，VBl 200-2000ug/L, VB6 100-1000ug/L，泛酸 100_500ug/L，尼克酸 100-600ug/L。所述的发酵培养基的配方包括1 葡萄糖80-120g/l、(NH4)2SO4 :20-40g/l、 MgSO4 · 7H20 :4-8mg/L、MnSO4 · H2O :2_6mg/L、FeSO4 · 7H20 :2_6mg/L、KH2PO4 :lg/l、纯生物素30ug/L、VBl :400ug/L、VB6 :10ug/L、泛酸50_300ug/l、尼克酸50_300ug/l、玉米浆 0. 1-3. 0g/l,13C高丰度菌体水解液0. 5-5g/l，用2mol/l氢氧化钠调节pH = 6. 5-8. 0，在 110-130°C高压灭菌锅中灭菌10-20分钟。所述的种子培养基的配方包括葡萄糖20-50g/l、尿素0.5_3g/l、硫酸铵 2-8g/l、KH2PO4 :0. 1-lg/l、玉米浆5_50g/l、MgSO4 · 7H20 :l_10mg/L，用 2mol/l 氢氧化钠调节pH = 6. 5-8. 0，在110-130°C高压灭菌锅中灭菌10-20分钟。所述的高丰度菌体水解液采用以下工艺获得离心收集高丰度"C稳定性同位素发酵液所产生的菌泥，将菌泥收集放入三口烧瓶中，加入5mol/l的硫酸进行消煮，消煮15 小时后，冷却后，加入2mol/l氢氧化钠，调节pH值至中性，离心，收集清液，即为高丰度菌体水解液。所述的分离提取采用等电点沉淀或离子交换法等分步提取得到"C稳定性同位素标记L-亮氨酸溶液，然后通过真空浓缩赶氨并采用乙醇低温结晶、真空干燥得到产品。与现有技术相比，本发明通过改变发酵配方和控制工艺，本发明获得的"C稳定性同位素标记L-亮氨酸产酸量比采用全合成培养基发酵产酸量相应提高50%以上，且1V丰度下降可以减少到0. 5%以下，有的甚至几乎不下降，大大提高了 13C葡萄糖利用率，减少了生产成本，同时，在保证产品1V丰度条件下，采用一次接种的方法，简化了发酵和提取工艺，由于原料得到充分利用，大大节省了原料，降低了成本，本发明可利用低丰度和高丰度 13C葡萄糖满足不同丰度产品要求。
具体实施例方式下面结合具体实施例对本发明进行详细说明。实施例1使用菌种为以黄色短杆菌ATCC39106为出发菌，使用的培养基包括斜面保藏培养基、斜面活化培养基、摇瓶发酵培养基。斜面保藏培养基和斜面活化培养基同常规发酵采用相同。使用的斜面保藏培养基、斜面活化培养基、摇瓶发酵培养基配方如下所示斜面保藏培养基蛋白胨10g/l、牛肉膏3g/l、氯化钠5g/l、琼脂20g/l ；斜面活化培养基葡萄糖3g/l、蛋白胨10g/l、牛肉膏10g/l、氯化钠5g/l、琼脂:20g/l ；发酵培养基=13C葡萄糖100g/l、(NH4)2SO4 :20g/l、MgS04. 7H20 :6mg/L、MnS04 .H2O 4mg/L,FeSO4 ·7Η20 :4mg/L,KH2PO4 :lg/l、VH :10ug/L、VBl :400ug/L、泛酸100ug/l、尼克酸 100ug/l、玉米桨0. 5g/l,13C高丰度菌体水解液2g/l ；用500ml三角瓶以20ml的载液量分装发酵培养基。以上培养基均用2mol/l氢氧化钠调节pH = 7. 0，在115°C高压灭菌锅中灭菌15分钟，待用。取黄色短杆菌ATCC39106 —环菌体接入斜面活化培养基，放入生化培养箱，30°C 下培养观小时，在无菌操作台上将斜面活化培养基上的菌体接入事先配好的300ml发酵培养基中，每瓶接一环菌体，接种完用九层纱布封口，置于旋转式摇床上，在30°C、160rmp下发酵42小时后将摇床转速提高至220rmp再发酵42小时。产L-亮氨酸-U-13C6达18g/l。将上述发酵液离心分离(4000rpm，10分钟)，所得到的上清液用盐酸调节pH = 2， 上阳离子交换树脂(H+型)吸附，水洗后用0. IN氨水洗脱，将得到的L-亮氨酸-U-13C6单斑洗脱液浓缩，活性炭脱色，再结晶并过滤得到的晶体真空干燥得到L-亮氨酸-U-13C6固体 4. 22克。经质谱分析得到产品丰度10. 19%，丰度下降小于0. 5%，丰度几乎不下降，纯度大于99 %，可以满足对高丰度产品的要求。实施例2使用菌种为以谷氨酸棒杆菌ATCC13032为出发菌，使用的培养基包括斜面保藏培养基、斜面活化培养基、摇瓶发酵培养基。斜面保藏培养基和斜面活化培养基同常规发酵采用相同。使用的斜面保藏培养基、斜面活化培养基、摇瓶发酵培养基配方如下所示斜面保藏培养基蛋白胨10g/l、牛肉膏3g/l、氯化钠5g/l、琼脂20g/l ；斜面活化培养基葡萄糖3g/l、蛋白胨10g/l、牛肉膏10g/l、氯化钠5g/l、琼脂:20g/l ；发酵培养基=13C葡萄糖100g/l、(NH4)2SO4 :35g/l、MgSO4. 7H20 :6mg/L、MnSO4. H2O 2mg/L, FeSO4. 7H20 :2mg/L, KH2PO4 :lg/l、VH :25ug/L、VB6 :100ug/L、泛酸300ug/l、尼克酸 400ug/l、蛋白胨lg/l、"C高丰度菌体水解液2g/l ；用500ml三角瓶以20ml的载液量分装发酵培养基。以上培养基均用2mol/l氢氧化钠调节pH = 7. 0，在115°C高压灭菌锅中灭菌15分钟，待用。取谷氨酸棒杆菌ATCC13032 —环菌体接入斜面活化培养基，放入生化培养箱， 30°C下培养M小时，在无菌操作台上将斜面活化培养基上的菌体接入事先配好的400ml发酵培养基中，每瓶接一环菌体，接种完用九层纱布封口，置于旋转式摇床上，在30°C、220rmp下发酵80小时。产L-亮氨酸-U-13C6达2(^/1。将上述发酵液离心分离(4000rpm，10分钟)，所得到的上清液用盐酸调节pH = 2， 上阳离子交换树脂(H+型)吸附，水洗后用0. IN氨水洗脱，将得到的L-亮氨酸-U-13C6单斑洗脱液浓缩，活性炭脱色，再结晶并过滤得到的晶体真空干燥得到L-亮氨酸-U-13C6固体 5. 52克。经质谱分析得到产品丰度99. 16%,丰度下降小于0. 5%，丰度几乎不下降，纯度大于99 %，可以满足对高丰度产品的要求。实施例3使用菌种为以黄色短杆菌ATCC39103为出发菌，使用的培养基包括斜面保藏培养基、斜面活化培养基、种子培养基、发酵培养基。斜面保藏培养基和斜面活化培养基同常规发酵采用相同。使用的斜面保藏培养基、斜面活化培养基、种子培养基、摇瓶发酵培养基配方如下所示斜面保藏培养基蛋白胨10g/l、牛肉膏3g/l、氯化钠5g/l、琼脂20g/l ；斜面活化培养基葡萄糖3g/l、蛋白胨10g/l、牛肉膏10g/l、氯化钠5g/l、琼脂:20g/l ；种子培养基葡萄糖30g/l、尿素lg/l、硫酸铵5g/l、KH2PO4 :0. 5g/l、玉米桨 20g/l、MgSO4. 7H20 :5mg/L发酵培养基=13C葡萄糖110g/l、(NH4)2SO :40g/l、MgSO4. 7H20 :6mg/L、MnSO4. H2O 2mg/L、FeSO4. 7H20 :2mg/L, KH2PO4 :lg/l、VH :50ug/L、VBl :2000ug/L、泛酸200ug/l、尼克酸500ug/l、玉米浆lg/l、"C高丰度菌体水解液15g/l。以上培养基均用2mol/l氢氧化钠调节pH = 7. 0，在115°C高压灭菌锅中灭菌15 分钟，待用。将菌体接种于活化培养基平板上，30°C下生化培养箱中培养30小时，待菌落长成后，将长好的菌苔接种于已灭菌的各装有50ml种子培养基的2个500ml摇瓶中，在下摇床培养10小时，获得种子液。将种子按2% (体积比)接种于已灭菌的装有5000ml发酵培养基的发酵罐中开始发酵，控制条件温度，通气量1. 5VVM，罐压0. 02MP,溶解氧60%，以30% (体积比) ΝΗΛ0调节PH = 7. 2，并以消泡剂消泡。发酵全过程控制pH在微碱性(pH控制在7. 0-7.5， 用添加液氨控制)，流加50% 13C葡萄糖控制发酵液1V葡萄糖浓度5%，发酵时间70小时。 产L-亮氨酸-U-13C6达198/1。将上述发酵液离心分离(4000rpm，10分钟)，所得到的上清液用盐酸调节pH = 2， 上阳离子交换树脂(H+型)吸附，水洗后用0. IN氨水洗脱，将得到的L-亮氨酸-U-13C6单斑洗脱液浓缩，活性炭脱色，再结晶并过滤得到的晶体真空干燥得到L-亮氨酸-U-13C6固体 30. 18克。经质谱分析得到产品丰度99. 66%，丰度下降小于0. 5%，丰度几乎不下降，纯度大于99 %，可以满足对高丰度产品的要求。实施例4使用菌种为以大肠杆菌ATCC21530为出发菌，使用的培养基包括斜面保藏培养基、斜面活化培养基、种子培养基、发酵培养基。斜面保藏培养基和斜面活化培养基同常规发酵采用相同。使用的斜面保藏培养基、斜面活化培养基、种子培养基、摇瓶发酵培养基配方如下所示
斜面保藏培养基蛋白胨10g/l、牛肉膏3g/l、氯化钠5g/l、琼脂20g/l ；斜面活化培养基葡萄糖3g/l、蛋白胨10g/l、牛肉膏10g/l、氯化钠5g/l、琼脂:20g/l ；种子培养基葡萄糖30g/l、尿素lg/l、硫酸铵5g/l、KH2PO4 :0. 5g/l、玉米桨 20g/l、MgSO4. 7H20 :5mg/L ；发酵培养基=13C葡萄糖90g/l、(NH4)2SO4 :50g/l、MgSO4. 7H20 :5mg/L、MnSO4. H2O 2mg/L, FeSO4. 7H20 :2mg/LKH2P04 :lg/l、H :20ug/L、VBl :200ug/L、泛酸200ug/l、尼克酸 300ug/l玉米浆dg/l^C高丰度菌体水解液20g/l。以上培养基均用2mol/l氢氧化钠调节pH = 7.0，在115°C高压灭菌锅中灭菌15 分钟，待用。将菌体接种于活化培养基平板上，30°C下生化培养箱中培养16小时，待菌落长成后，将长好的菌苔接种于已灭菌的各装有50ml种子培养基的3个500ml摇瓶中，在下摇床培养30小时，获得种子液。将种子按5% (体积比)接种于已灭菌的装有3000ml发酵培养基的发酵罐中开始发酵，控制条件温度32°C，通气量0. 5VVM，罐压0. 05MP,溶解氧80 %，以30 % (体积比) ΝΗΛ0调节PH = 7. 2，并以消泡剂消泡。发酵全过程控制pH在微碱性(pH控制在7. 0-7.5， 用添加液氨控制)，流加50% 13C葡萄糖控制发酵液1V葡萄糖浓度3%，发酵时间55小时。 产L-亮氨酸-U-13C6达198/1。将上述发酵液离心分离(4000rpm，10分钟)，所得到的上清液用盐酸调节pH = 2， 上阳离子交换树脂(H+型)吸附，水洗后用0. IN氨水洗脱，将得到的L-亮氨酸-U-13C6单斑洗脱液浓缩，活性炭脱色，再结晶并过滤得到的晶体真空干燥得到L-亮氨酸-U-13C6固体 22. 32克。经质谱分析得到产品丰度99. 06%，丰度下降小于0. 5%，丰度几乎不下降，纯度大于99 %，可以满足对高丰度产品的要求。实施例5生产稳定性同位素碳13全标记L型亮氨酸的发酵工艺，采用摇瓶发酵对菌体进行发酵培养后，再经分离提取得到同位素碳13全标记L型亮氨酸。采用的菌体适用于L型亮氨酸生产的棒杆菌、短杆菌属，并能采用强制控制工艺控制其细胞膜通透性，包括黄色短杆菌、钝齿棒杆菌、大肠杆菌、粘质赛氏杆菌或谷氨酸棒杆菌，本实施例采用黄色短杆菌。摇瓶发酵具体包括以下步骤将黄色短杆菌接种于活化培养基平板上，30°C下生化培养箱中培养16小时，待长成菌落后，将菌落接种于事先灭菌完的发酵培养基中，每瓶发酵培养基接一环菌体，发酵培养基的装液量为一个500ml三角瓶装20ml发酵培养基，将接种完的发酵培养基置于摇摆式摇床上，控制发酵温度25°C，摇床转速180转/分钟，连续发酵72小时。其中，活化培养基平板采用斜面活化培养基，该斜面活化培养基的配方包括葡萄糖lg/l、蛋白胨5g/l、牛肉膏3g/l、氯化钠lg/l、琼脂15g/l，用2mol/l氢氧化钠调节 PH = 6. 5，在110°C高压灭菌锅中灭菌10分钟。发酵培养基以1V葡萄糖为碳源，初始配方中"C葡萄糖浓度为6wt%;以氯化铵为初始氮源，浓度为2wt%，发酵中后期添加尿素、氨水或液氨调节pH来补充氮源，添加高丰度菌体水解液作为有机碳源和氮源，添加量为0. 2wt%。不添加或添加极微量玉米浆、酵母膏、蛋白胨等有机碳源，单独添加一种即可，添加量在0. 2wt%以下，根据不同菌种添加磷酸盐、镁盐、锰盐和亚铁盐，添加纯生物素10ug/L，VBl 200ug/L, VB6 100ug/L，泛酸100ug/L， 尼克酸100ug/L。发酵培养基的配方包括13C葡萄糖80g/l、(NH4)2SO4 :20g/l、MgS04 ·7Η20 4mg/L,MnSO4 .H2O :2mg/L,FeSO4 · 7H20 :2mg/L,KH2PO4 :lg/l、纯生物素:30ug/L、VBl :400ug/ L、VB6 :10ug/L、泛酸:50ug/l、尼克酸:50ug/l、玉米浆0. lg/l、13C高丰度菌体水解液 0. 5g/l，用2mol/l氢氧化钠调节PH = 6. 5，在110°C高压灭菌锅中灭菌10分钟。高丰度菌体水解液采用以下工艺获得离心收集高丰度"C稳定性同位素发酵液所产生的菌泥，将菌泥收集放入三口烧瓶中，加入5mol/l的硫酸进行消煮，消煮15小时后， 冷却后，加入2mol/l氢氧化钠，调节pH值至中性。离心，收集清液，即为高丰度菌体水解液。 分离提取采用等电点沉淀或离子交换法等分步提取得到"C稳定性同位素标记L-亮氨酸溶液，然后通过真空浓缩赶氨并采用乙醇低温结晶、真空干燥得到产品。实施例6生产稳定性同位素碳13全标记L型亮氨酸的发酵工艺，采用摇瓶发酵对菌体进行发酵培养后，再经分离提取得到同位素碳13全标记L型亮氨酸。采用的菌体适用于L型亮氨酸生产的棒杆菌、短杆菌属，并能采用强制控制工艺控制其细胞膜通透性，包括黄色短杆菌、钝齿棒杆菌、大肠杆菌、粘质赛氏杆菌或谷氨酸棒杆菌，本实施例采用钝齿棒杆菌。摇瓶发酵包括以下步骤将钝齿棒杆菌接种于活化培养基平板上，30°C下生化培养箱中培养30小时，待长成菌落后，将菌落接种于事先灭菌完的发酵培养基中，每瓶发酵培养基接一环菌体，发酵培养基的装液量为一个500ml三角瓶装60ml发酵培养基，将接种完的发酵培养基置于摇摆式摇床上，控制发酵温度35°C，摇床转速240转/分钟，连续发酵96小时。活化培养基平板采用斜面活化培养基，该斜面活化培养基的配方包括葡萄糖 5g/l、蛋白胨15g/l、牛肉膏15g/l、氯化钠10g/l、琼脂:30g/l，用2mol/l氢氧化钠调节 PH = 8.0，在130°C高压灭菌锅中灭菌20分钟。发酵培养基以1V葡萄糖为碳源，初始配方中"C葡萄糖浓度为以硫酸铵和醋酸铵为初始氮源，浓度为5wt%，发酵中后期添加尿素、氨水或液氨调节pH来补充氮源， 添加高丰度菌体水解液作为有机碳源和氮源，添加量为2wt%。不添加或添加极微量玉米浆、酵母膏、蛋白胨等有机碳源，单独添加一种即可，添加量在0. 2wt%以下，根据不同菌种添加磷酸盐、镁盐、锰盐和亚铁盐，添加纯生物素50ug/L，VBl 2000ug/L, VB6 1000ug/L，泛酸 500ug/L，尼克酸 600ug/L。发酵培养基的配方包括13C葡萄糖120g/l、(NH4)2SO4 :40g/l、MgSO4 · 7H20 :8mg/ L、MnSO4 · H2O :6mg/L、FeSO4 · 7H20 :6mg/L、KH2PO4 :lg/l、纯生物素30ug/L、VBl :400ug/L、 VB6 :10ug/L、泛酸50-300ug/l、尼克酸300ug/l、玉米浆3. 0g/l,13C高丰度菌体水解液 5g/l，用2mol/l氢氧化钠调节pH = 8. 0，在130°C高压灭菌锅中灭菌20分钟。高丰度菌体水解液采用以下工艺获得离心收集高丰度"C稳定性同位素发酵液所产生的菌泥，将菌泥收集放入三口烧瓶中，加入5mol/l的硫酸进行消煮，消煮15小时后， 冷却后，加入2mol/l氢氧化钠，调节PH值至中性。离心，收集清液，即为高丰度菌体水解液。所述的分离提取采用等电点沉淀或离子交换法等分步提取得到"C稳定性同位素标记L-亮氨酸溶液，然后通过真空浓缩赶氨并采用乙醇低温结晶、真空干燥得到产品。
实施例7生产稳定性同位素碳13全标记L型亮氨酸的发酵工艺，采用发酵罐发酵对菌体进行发酵培养后，再经分离提取得到同位素碳13全标记L型亮氨酸。采用的菌体适用于L型亮氨酸生产的棒杆菌、短杆菌属，并能采用强制控制工艺控制其细胞膜通透性，包括黄色短杆菌、钝齿棒杆菌、大肠杆菌、粘质赛氏杆菌或谷氨酸棒杆菌，本实施例采用大肠杆菌。发酵罐发酵包括以下步骤(1)将大肠杆菌接种于活化培养基平板上，30°C下生化培养箱中培养16小时，待长成菌落后将菌落接种于已灭菌的装有种子培养基的摇瓶中，在下摇床培养10小时， 获得种子液；(2)发酵初始温度251，初始？!1为6.8，采用大接种量Qwt%)、低糖流加、强制控制发酵工艺，将种子液按2% (体积比)接种于已灭菌的装有发酵培养基的发酵罐中开始发酵，控制温度25°C，通气量0. 5VVM，罐压0. OlMPa,溶解氧5% (体积比)，pH为6. 5，并以消泡剂消泡，发酵全过程用添加液氨控制PH在7. 0，并且流加50wt %的1V葡萄糖，控制发酵液13C葡萄糖浓度3wt%，发酵时间32小时。其中，活化培养基平板采用斜面活化培养基，该斜面活化培养基的配方包括葡萄糖lg/l、蛋白胨5g/l、牛肉膏3g/l、氯化钠lg/l、琼脂15g/l，用2mol/l氢氧化钠调节 pH = 6. 5，在110°C高压灭菌锅中灭菌10分钟。发酵培养基以"C葡萄糖为碳源，初始配方中1Y葡萄糖浓度为6wt% ；以硝酸铵和尿素为初始氮源，浓度为2wt%，发酵中后期添加尿素、氨水或液氨调节pH来补充氮源， 添加高丰度菌体水解液作为有机碳源和氮源，添加量为0. 2wt%。不添加或添加极微量玉米浆、酵母膏、蛋白胨等有机碳源，单独添加一种即可，添加量在0. 2wt%以下，根据不同菌种添加磷酸盐、镁盐、锰盐和亚铁盐，添加纯生物素10ug/L，VBl 200ug/L, VB6 100ug/L，泛酸100ug/L，尼克酸100ug/L。发酵培养基的配方包括1 葡萄糖80g/l、(NH4)2SO4 :20g/l、 MgSO4 · 7H20 :4mg/L,MnSO4 · H2O :2mg/L、FeS04 · 7H20 :2mg/L,KH2PO4 :lg/l、纯生物素30ug/ L、VB1 :400ug/L、VB6 :10ug/L、泛酸:50ug/l、尼克酸:50ug/l、玉米浆:0. lg/l、13C 高丰度菌体水解液0. 5g/l，用2mol/l氢氧化钠调节pH = 6. 5，在110°C高压灭菌锅中灭菌10分钟。种子培养基的配方包括葡萄糖20g/l、尿素0. 5g/l、硫酸铵2g/l、KH2PO4 0. lg/Ι、玉米浆5g/l、MgSO4 · 7H20 :lmg/L，用 2mol/l 氢氧化钠调节 pH = 6. 5，在 110°C高压灭菌锅中灭菌10分钟。高丰度菌体水解液采用以下工艺获得离心收集高丰度"C稳定性同位素发酵液所产生的菌泥，将菌泥收集放入三口烧瓶中，加入5mol/l的硫酸进行消煮，消煮15小时后， 冷却后，加入2mol/l氢氧化钠，调节PH值至中性。离心，收集清液，即为高丰度菌体水解液。 分离提取采用等电点沉淀或离子交换法等分步提取得到"C稳定性同位素标记L-亮氨酸溶液，然后通过真空浓缩赶氨并采用乙醇低温结晶、真空干燥得到产品。实施例8生产稳定性同位素碳13全标记L型亮氨酸的发酵工艺，采用发酵罐发酵对菌体进行发酵培养后，再经分离提取得到同位素碳13全标记L型亮氨酸。采用的菌体适用于L型亮氨酸生产的棒杆菌、短杆菌属，并能采用强制控制工艺控制其细胞膜通透性，包括黄色短杆菌、钝齿棒杆菌、大肠杆菌、粘质赛氏杆菌或谷氨酸棒杆菌，本实施例采用谷氨酸棒杆菌。
发酵罐发酵包括以下步骤所述的发酵罐发酵包括以下步骤(1)将谷氨酸棒杆菌接种于活化培养基平板上，30°C下生化培养箱中培养30小时，待长成菌落后将菌落接种于已灭菌的装有种子培养基的摇瓶中，在30°C下摇床培养M 小时，获得种子液；(2)发酵初始温度35°C，初始pH7.2，采用大接种量(IOwt %)、低糖流加、强制控制发酵工艺，将种子液按10% (体积比)接种于已灭菌的装有发酵培养基的发酵罐中开始发酵，控制温度37°C，通气量1.5界11，罐压0.0510^，溶解氧30% (体积比)，pH为7. 5，并以消泡剂消泡，发酵全过程用添加液氨控制PH在7. 5，并且流加50wt%的"C葡萄糖，控制发酵液"C葡萄糖浓度6wt%，发酵时间70小时。活化培养基平板采用斜面活化培养基，该斜面活化培养基的配方包括葡萄糖 5g/l、蛋白胨15g/l、牛肉膏15g/l、氯化钠10g/l、琼脂:30g/l，用2mol/l氢氧化钠调节 PH = 8.0，在130°C高压灭菌锅中灭菌20分钟。发酵培养基以1V葡萄糖为碳源，初始配方中"C葡萄糖浓度为以醋酸铵、 硫酸铵和尿素为初始氮源，浓度为5wt%，发酵中后期添加尿素、氨水或液氨调节pH来补充氮源，添加高丰度菌体水解液作为有机碳源和氮源，添加量为2wt%。不添加或添加极微量玉米浆、酵母膏、蛋白胨等有机碳源，单独添加一种即可，添加量在0. 2wt%以下，根据不同菌种添加磷酸盐、镁盐、锰盐和亚铁盐，添加纯生物素50ug/L，VBl 2000ug/L, VB6 IOOOug/ L，泛酸 500ug/L，尼克酸 600ug/L。发酵培养基的配方包括13C葡萄糖120g/l、(NH4)2SO4 :40g/l、MgSO4 · 7H20 :8mg/ L、MnSO4 · H2O :6mg/L、FeSO4 · 7H20 :6mg/L、KH2PO4 :lg/l、纯生物素30ug/L、VBl :400ug/L、 VB6 :10ug/L、泛酸50-300ug/l、尼克酸300ug/l、玉米浆3. 0g/l,13C高丰度菌体水解液 5g/l，用2mol/l氢氧化钠调节PH = 8. 0，在130°C高压灭菌锅中灭菌20分钟。种子培养基的配方包括葡萄糖50g/l、尿素3g/l、硫酸铵8g/l、KH2PO4 :lg/l、 玉米浆50g/l、MgSO4 ·7Η20 :10mg/L，用2mol/l氢氧化钠调节pH = 8. 0，在130°C高压灭菌锅中灭菌20分钟。高丰度菌体水解液采用以下工艺获得离心收集高丰度"C稳定性同位素发酵液所产生的菌泥，将菌泥收集放入三口烧瓶中，加入5mol/l的硫酸进行消煮，消煮15小时后， 冷却后，加入2mol/l氢氧化钠，调节PH值至中性。离心，收集清液，即为高丰度菌体水解液。 分离提取采用等电点沉淀或离子交换法等分步提取得到"C稳定性同位素标记L-亮氨酸溶液，然后通过真空浓缩赶氨并采用乙醇低温结晶、真空干燥得到产品。
权利要求
1.生产稳定性同位素碳13全标记L型亮氨酸的发酵工艺，其特征在于，该发酵工艺采用摇瓶发酵或发酵罐发酵对菌体进行发酵培养后，再经分离提取得到同位素碳13全标记L 型亮氨酸。
2.根据权利要求1所述的生产稳定性同位素碳13全标记L型亮氨酸的发酵工艺，其特征在于，所述的菌体适用于L型亮氨酸生产的棒杆菌、短杆菌属，并能采用强制控制工艺控制其细胞膜通透性，包括黄色短杆菌、钝齿棒杆菌、大肠杆菌、粘质赛氏杆菌或谷氨酸棒杆菌。
3.根据权利要求1所述的生产稳定性同位素碳13全标记L型亮氨酸的发酵工艺，其特征在于，所述的摇瓶发酵包括以下步骤将菌体接种于活化培养基平板上，30°C下生化培养箱中培养16-30小时，待长成菌落后，将菌落接种于事先灭菌完的发酵培养基中，每瓶发酵培养基接一环菌体，发酵培养基的装液量为一个500ml三角瓶装20-60ml发酵培养基，将接种完的发酵培养基置于摇摆式摇床上，控制发酵温度25-35°C，摇床转速180-240转/分钟，连续发酵72-96小时。
4.根据权利要求1所述的生产稳定性同位素碳13全标记L型亮氨酸的发酵工艺，其特征在于，所述的发酵罐发酵包括以下步骤(1)将菌体接种于活化培养基平板上，30°C下生化培养箱中培养16-30小时，待长成菌落后将菌落接种于已灭菌的装有种子培养基的摇瓶中，在下摇床培养IO-M小时， 获得种子液；(2)发酵初始温度25-35°C，初始pH6.8-7.2，采用大接种量(2-lOwt% )、低糖流加、 强制控制发酵工艺，将种子液按2-10% (体积比)接种于已灭菌的装有发酵培养基的发酵罐中开始发酵，控制温度25-37°C，通气量0. 5-1. 5VVM，罐压0. 01-0. 05MPa，溶解氧5-30% (体积比)，PH为6. 5-7. 5，并以消泡剂消泡，发酵全过程用添加液氨控制pH在7. 0-7. 5，并且流加50wt%的1V葡萄糖，控制发酵液"C葡萄糖浓度3-6wt%，发酵时间32-70小时。
5.根据权利要求3或4所述的生产稳定性同位素碳13全标记L型亮氨酸的发酵工艺， 其特征在于，所述的活化培养基平板采用斜面活化培养基，该斜面活化培养基的配方包括 葡萄糖l_5g/l、蛋白胨5-15g/l、牛肉膏3-15g/l、氯化钠l_10g/l、琼脂15_30g/l，用 2mol/l氢氧化钠调节pH = 6. 5-8. 0，在110_130°C高压灭菌锅中灭菌10-20分钟。
6.根据权利要求3或4所述的生产稳定性同位素碳13全标记L型亮氨酸的发酵工艺，其特征在于，所述的发酵培养基以13C葡萄糖为碳源，初始配方中13C葡萄糖浓度为；以氯化铵、硫酸铵、硝酸铵、醋酸铵或尿素中的一种或几种为初始氮源，浓度为2-5wt %，发酵中后期添加尿素、氨水或液氨调节pH来补充氮源，添加高丰度菌体水解液作为有机碳源和氮源，添加量为0.2-2wt%。不添加或添加极微量玉米浆、酵母膏、蛋白胨有机碳源，单独添加一种即可，添加量在0. 2wt%以下，根据不同菌种添加磷酸盐、镁盐、锰盐和亚铁盐，添加纯生物素10-50ug/L，VBl 200-2000ug/L, VB6 100-1000ug/L，泛酸 100-500ug/L，尼克酸 100-600ug/L。
7.根据权利要求3或4所述的生产稳定性同位素碳13全标记L型亮氨酸的发酵工艺，其特征在于，所述的发酵培养基的配方包括1 葡萄糖80-120g/l、(NH4)2SO4 :20_40g/ UMgSO4 · 7H20 :4-8mg/L、MnSO4 · H2O :2_6mg/L、FeSO4 · 7H20 :2-6mg/L, KH2PO4 :lg/l、纯生物素30ug/L、VBl :400ug/L、VB6 :10ug/L、泛酸50_300ug/l、尼克酸50_300ug/l、玉米浆0·.1-3. 0g/l,13C高丰度菌体水解液0. 5-5g/l，用2mol/l氢氧化钠调节pH = 6. 5-8. 0，在 110-130°C高压灭菌锅中灭菌10-20分钟。
8.根据权利要求4所述的生产稳定性同位素碳13全标记L型亮氨酸的发酵工艺，其特征在于，所述的种子培养基的配方包括葡萄糖20-50g/l、尿素0. 5-3g/l、硫酸铵2-8g/1·、KH2PO4:0. 1-lg/l、玉米浆5-50g/l、MgSO4 · 7H20 :l_10mg/L，用 2mol/l 氢氧化钠调节 pH =6. 5-8. 0，在110-130°C高压灭菌锅中灭菌10-20分钟。
9.根据权利要求6所述的生产稳定性同位素碳13全标记L型亮氨酸的发酵工艺，其特征在于，所述的高丰度菌体水解液采用以下工艺获得离心收集高丰度"C稳定性同位素发酵液所产生的菌泥，将菌泥收集放入三口烧瓶中，加入5mol/l的硫酸进行消煮，消煮15小时后，冷却后，加入2mol/l氢氧化钠，调节pH值至中性，离心，收集清液，即为高丰度菌体水解液。
10.根据权利要求1所述的生产稳定性同位素碳13全标记L型亮氨酸的发酵工艺，其特征在于，所述的分离提取采用等电点沉淀或离子交换法等分步提取得到"C稳定性同位素标记L-亮氨酸溶液，然后通过真空浓缩赶氨并采用乙醇低温结晶、真空干燥得到产品。
全文摘要
本发明涉及生产稳定性同位素碳13全标记L型亮氨酸的发酵工艺，该发酵工艺采用摇瓶发酵或发酵罐发酵对菌体进行发酵培养后，再经分离提取得到同位素碳13全标记L型亮氨酸，其中，产品需求量大时采用发酵罐发酵，反之，采用摇瓶发酵。与现有技术相比，本发明获得的13C稳定性同位素标记L-亮氨酸产酸量比采用全合成培养基发酵产酸量相应提高50％以上，且13C丰度下降可以减少到0.5％以下，减少了生产成本，简化了发酵和提取工艺，由于原料得到充分利用，可利用低丰度和高丰度13C葡萄糖满足不同丰度产品要求。
文档编号C12R1/15GK102352390SQ201110298559
公开日2012年2月15日 申请日期2011年9月28日 优先权日2011年9月28日
发明者宋明鸣, 张亮, 李良君, 杜晓宁 申请人:上海化工研究院